Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Н-ФОСФОНАТЫ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДОВ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ИЛИ ИХ АНАЛОГОВ
Н-ФОСФОНАТЫ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДОВ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ИЛИ ИХ АНАЛОГОВ

Н-ФОСФОНАТЫ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДОВ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ИЛИ ИХ АНАЛОГОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов. Сущность: продукт - Н-фосфонат гидроксилсодержащих стероидов общей ф-лы 1 , где X - остаток холестерина или тестостерона. Выход 69 - 89% . 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2009147
Класс(ы) патента: C07J9/00
Номер заявки: 4908998/04
Дата подачи заявки: 08.02.1991
Дата публикации: 15.03.1994
Заявитель(и): Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН
Автор(ы): Веньяминова А.Г.; Сергеева З.А.; Баширова В.З.
Патентообладатель(и): Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к биорганической химии, а именно к новым химическим соединениям - Н-фосфонатам гидроксилсодержащих стероидов общей формулы I XO--H где X - остаток гидроксилсодержащего стероида,
например:
холестерина (Chs)
тестостерона (TS) которые могут быть использованы как исходные реагенты для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов и их аналогов.
Известен лишь один пример твердофазного синтеза холестеринсодержащих олигонуклеотидов, основанный на использовании 2-(холестерилоксикарбониламино)этиламина формулы II [1] NH(CH2)2NH-O-холестерин который получают из холестерилхлорформиата и этилендиамина (выход - 76% ). С помощью этого реагента получен ряд олигодезоксирибонуклеотидов с остатком холестерина, связанным с 31-концевым межнуклеотидным фосфатом. Выход холестеринсодержащего олигонуклеотида - 50% .
Недостатком данного метода является сравнительно низкий выход стероидных производных олигонуклеотидов, а также то, что межнуклеотидная связь, содержащая холестериновый остаток, существует в виде R- и S-стереоизомеров по атому фосфора, различающихся по своим физико-химическим свойствам, в частности, образующих комплексы различной устойчивости с нуклеиновыми кислотами.
Твердофазный синтез олигонуклеотидов и их аналогов является в настоящее время наиболее широко используемым методом вследствие своей быстроты и эффективности. Испытания стероидных производных олигонуклеотидов в клеточных системах показали их перспективность в качестве средств подавления развития вирусов. Поэтому весьма актуальной задачей является повышение выхода стероидных производных олигонуклеотидов и их аналогов при твердофазном синтезе этих производных.
Указанная задача решается тем, что в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидсодержащих олигонуклеотидов и их аналогов используют новые химические соединения - Н-фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов формулы 1, которые получают из соответствующих стероидов обработкой триимидазолидом фосфора с последующим гидролизом водой и выделением хроматографией на силикагеле.
Синтезированные Н-фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов были использованы в качестве реагентов для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов дезоксирибо-ряда, рибо-ряда и 21-0-метилрибо-ряла, предварительно полученных твердофазным Н-фосфонатным методом. Полученные результаты подтверждают возможность твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов с использованием данного реагента, при этом выход целевых продуктов составляет 80-90% . Проведение реакции в твердофазном варианте существенно облегчает процедуру избытка реагентов и может быть легко автоматизировано.
П р и м е р 1. Синтез Н-фосфонатов гидроксилсодержащих стероидов.
а) Синтез Н-фосфоната холестерина.
Колбу заполняют аргоном 1,2 г (17,5 ммоль) имидазола, предварительно высушенного над P2O5 при 1-2 мм рт. ст. , растворяют в 60 мл абс. ацетонитрила и охлаждают льдом. Затем при перемешивании добавляют 0,35 мл (5,25 ммоль) PCl3 и 1,5 мл (18 ммоль) триэтиламина. Через 15 мин по каплям добавляют раствор предварительно высушенного холестерина (0,5 г, 1,25 ммоль) в 60 мл абс. хлороформа в течение 30 мин, затем охлаждение убирают и продолжают перемешивание еще 2 ч. За ходом реакции следят с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ - этанол (9: 1). Затем реакционную смесь разлагают добавлением 15 мл воды и упаривают досуха. Смесь растворяют в хлороформе (75 мл), экстрагируют водой (2 x 50 мл). Органическую фазу после отделения высушивают безводным Na2SO4, упаривают и хроматографируют на силикагеле (колонка 150 мл, градиент концентрации этанола (0 -> 50% ) в хлороформе, содержащем 1% триэтиламина). Фракции, содержащие продукт с Rf = = 0,23 (ТСХ, система хлороформ - этанол 6: 4), упаривают досуха. Выход 0,6 г (85% ).
Продукт гомогенен по данным ТСХ и дает положительный нингидриновый тест.
ИК-спектр, см-1: 1000, 1060, 1090 (цикл), 1240 (Р= О), 1340 (-СН), 1460 (С-СН3), 1600 (С= С), 2400, 2500 (Р-ОН), 2690 (Р-Н), 2860, 2950 (-СН2-, -СН3, С-Н).
31Р-ЯМР, δм.д. (CDCl3): 0,86 (J = 618 Гц)
1Н-ЯМР, δм.д. (CDCl3): 0,82 (S, 3Н, 13-CH3), 0,88 (S, H, -(CH3)2), 0,95 (S, 3H, 20-CH2), 1,31 (t, 9Н, СН3СН2-N), 0,8-2,40 (m, 3Н, цикл), 3,03 (g, 6H, CH3CH2-N), 3,94 (m, 3H, 10-CH3), 5,27 (Sm, 1H, 3-H), 6,98 (d, 1H, P-H (J = 618 Гц)), 8,35 (S, 1H, N-H).
Сигналы фосфорсодержащей части молекулы в ИК, 31Р- и 1Н-ЯМР-спектрах хорошо коррелируют с литературными данными [2] . Сигналы стероидной части молекулы в спектрах ИК- и 1Н-ЯМР также согласуются со справочными данными [3] .
б) Синтез Н-фосфоната тестостерона.
Синтез ведут аналогично описанному выше. Выход 0,49 г (69% ). Rf= 0,29 (ТСХ, система хлороформ-этанол 6: 4).
ИК-спектр, см-1: 1220 (P= O), 1460 (С-СН3), 1000-1100 (цикл), 1600 (С= С), 1680 (С= O), 2500 (P-OH), 2600 (P-H), 2800-3000 (C-H, -CH2, -CH3).
УФ-спектр (этанол): λmax 241 нм, lg ε = = 4,18.
31Р-ЯМР, δм.д. (CDCl3): 3,43 м. д. (J = 608 Гц).
1Н-ЯМР, δм.д. (CDCl3): 0,68 (S, 3H, 13-CH3), 1,34 (S, 3H, 10-CH3), 1,21 (t, 9H, CH3-CH2-N), 0,80-2,1 (m, 17H, цикл), 2,94 (g, 6H, CH3-CH2-N), 3,95 (m, 1H, 10-CH3), 5,57 (Sm, 1H, 17-Н), 6,68 (d, 1H, P-H (J = 608 Гц)), 8,11 (S, 1H, N-H).
Данные ИК, УФ и ЯМР согласуются с литературными данными [2-3] .
П р и м е р 2. Синтез стероидных производных олигонуклеотидов.
Для синтеза использованы полученные твердофазным методом на автоматическом синтезаторе "Виктория" [4] защищенные олигонуклеотиды в виде Н-фосфонатов, связанные по 31-концу с полимерным носителем и имеющие на 51-конце свободную оксигруппу.
а) Синтез холестеринового производного декатимидилата
ChSpT(pT)9
К высушенной навеске (8 мг, емкость 70 мкмоль/г по первому нуклеотидному звену, т. е. 0,5 мкмоль) полимер-связанного декатимидилата с Н-фосфонатными межнуклеотидными связями, добавляют 50 мкл абс. пиридина, 25 мкл абс. ацетонитрила, 25 мкл 0,1 М раствора (25 мкмоль) Н-фосфоната холестерина в хлороформе и 6 мкл (75 мкмоль) пивалоилхлорида. Смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, промывают полимерный носитель пиридином, добавляют 100 мкл 0,2 М раствора I1 в смеси пиридин - вод (98: 2), выдерживают 30 мин и промывают ацетоном. Затем носитель обрабатывают 1 мл конц. NH4OH в течение 1 ч, раствор сливают, упаривают досуха, растворяют в 1 мл воды и наносят на колонку с ионообменным сорбентом. Выделенные фракции вновь упаривают, растворяют в воде и наносят на колонку с обращенной фазой. Условия хроматографии приведены в таблице. После выделения фракцию, содержащую целевой продукт, упаривают досуха, растворяют в 100 мкл воды и добавляют по каплям в 1 мл 2% -ного раствора LiClO4 в ацетоне. Выпавший осадок литиевой соли олигонуклеотида отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и сушат при 14-2 мм рт. ст. Выход и характеристики полученного холестеринового производного декатимидилата приведены в таблице.
б) Синтез тестостеронового производного декатимидилата.
TSpT(pT)9
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а. Выход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
в) Синтез холестеринового производного декауридилата.
ChSpU(pU)9
Синтез ведут аналогично описанному в примере 2а, при этом в процедуру выделения вводят дополнительную стадию: полученный в результате ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии стероидсодержащий олигонуклеоимд с тетрагидропиранильными защитными группами в 21-положении рибозы обрабатывают 1 мл 0,01 М HCl в течение 2 ч при 50оС. Затем раствор нейтрализуют конц. NH4OH, упаривают досуха и растворяют в 1 мл воды. Затем наносят на колонку с обращенной фазой (условия хроматографии приведены в таблице) и после хроматографии выделяют целевой продукт аналогично описанному в примере 2а. Выход и характеристики продукта приведены в таблице.
г) Синтез тестостеронового производного декауридилата.
TSpU(pU)9
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2в. Результаты приведены в таблице.
д) Синтез холестеринового производного дека(21-0-метилуридилата)
ChSpUm(pUm)9
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а. Результаты приведены в таблице.
е) Синтез тестостеронового производного дека(21-0-метилуридилата)
TSpUm(pUm)9
Синтез и выделение ведут аналогично описанному в примере 2а.
Результаты приведены в таблице. (56) Letsinger R. L. , Zhang G. , Sun D. K. , Ikeuchi T. , Sarin P. S. PNAS, 1989, v. 86, N 17, p. 6553-6556.
Garegg P. J. , Regberg T. , Stawinski J. Chem. Ser. 1986, v. 26, N 1, p. 59-62.
The Sadtler Standard Spectra. Philadelphia Sadtler research Lab. 1966-1988.
Веньяминова А. Г. , Левина А. С. , Репкова М. Н. , Ченцова Н. А. Биоорганическая химия: 1989, т. 15, N 6, с. 844-847.
Формула изобретения: Н-Фосфонаты гидроксилсодержащих стероидов общей формулы
XO-H
где X - остаток холестерина или тестостерона,
в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов или их аналогов.