Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биохимия, гистохимия и цитология кремниефильных организмов. Сущность изобретения: препарат биологического объекта подвергают тепловой обработке в мягком режиме при 20 - 40С, обрабатывают препаратом флюоресцирующего лектина и микроскопируют. 4 ил. , 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2009490
Класс(ы) патента: G01N33/48
Номер заявки: 4940747/13
Дата подачи заявки: 23.04.1991
Дата публикации: 15.03.1994
Заявитель(и): Всесоюзный научно-исследовательский институт риса
Автор(ы): Алешин Н.Е.; Авакян Э.Р.; Сорочинская Е.М.; Туманьян Н.Г.; Алешин Е.П.
Патентообладатель(и): Всесоюзный научно-исследовательский институт риса
Описание изобретения: Изобретение относится к биохимии, гистохимии и цитологии кремниефильных организмов, и может быть использовано в оценке исходного материала указанных организмов, в частности риса, в лабораторной практике гистобиохимических и цитологических исследований.
Известны способы выявления кремнийсодержащих биологических структур, основанные на анализе препаратов для световой микроскопии без какой-либо специальной обработки (Алешин Е. П. , Власов В. Г. "Анатомия риса", Краснодар, ВНИИриса, 1982, с. 112, рис. 284).
Недостатками указанных способов являются:
- непригодность для идентификации неизвестных кремнийсодержащих структур, так как идентификация в них происходит только на основе уже известной морфологии;
- получаемые изображения кремнийсодержащих структур не контрастны.
Известны способы выявления кремнийсодержащих биологических структур, основанные на анализе препаратов для световой микроскопии, контрастированных фенолом.
Недостатками вышеуказанных способов являются:
- невозможность идентификации кремнийсодержащих структур неизвестной морфологии;
- невозможность выявить наличие или отсутствие кремния в биологических структурах, окремневающих в определенные периоды развития, т. е. являющихся то не окремневшими, то частично окремневшими, а то полностью окремневшими;
- дополнительные затраты времени и средств, связанные с повторными и последующими операциями по выявлению биологических кремнийсодержащих структур, ранее неизвестной морфологии, либо структур, окремневающих в определенные периоды онтогенеза.
Известен способ выявления кремнийсодержащих структур (прототип), заключающийся в том, что исследуемый биологический объект (кусочек ткани, органа и т. д. ) помещают на предметное стекло и подвергают тепловой обработке при повышенной температуре до 700оС. При этом все биологические структуры разрушаются, исключая структуры, состоящие, по большей части, из неорганического кремнезема. Останки названных структур четко видны на предметном стекле в поле зрения микроскопа и идентифицируются абсолютно достоверно.
Недостатками способа являются:
- невозможность выявления кремнийсодержащих биологических структур в нативном состоянии, так как при высокотемпературной тепловой обработке все нативные кремнийсодержащие структуры спекаются в скелетообразные агломераты, структура которых не имеет ничего общего со структурой нативных кремнийсодержащих образований и дает характеристику лишь общего расположения последних в пределах микросподографированного биологического объекта;
- невозможность выявления кремнийсодержащих биологических структур, в которых кремний присутствует в форме кремнийорганических соединений, так как все органические соединения, в том числе составляющие клеточные стенки сложные эфиры ортосиликата и целлюлозы, разрушаются при высокотемпературной тепловой обработке и видимыми остаются только неорганические агломераты.
Целью изобретения является выявление нативного состояния кремнийсодержащих биологических структур.
Цель достигается тем, что в известном способе выявления кремнийсодержащих биологических структур, включающем тепловую обработку исследуемого биологического объекта и микроскопирование, тепловую обработку проводят в мягком режиме при 20-40оС, а перед микроскопированием объект обрабатывают раствором препарата лектина, меченного флюоресцирующей меткой.
Подобные препараты используют в химии углеводов для специфического взаимодействия с некоторыми классами сахаров. Использование таких препаратов для выявления кремнийсодержащих структур не известно.
Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается тем, что тепловую обработку объекта проводят в мягком режиме при 20-40оС, а перед микроскопированием его обрабатывают раствором лектина, меченного флюоресцирующей меткой. Таким образом, заявленный способ соответствует критерию изобретения "новизна".
Сравнение заявленного решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области не позволило выявить в них признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "существенные отличия" (табл. 1).
Способ поясняется фиг. 1-4.
П р и м е р 1. Реализация способа-прототипа.
Исследуемый биологический объект - цветковую чешую зерновки риса сорта Краснодарский 424 наносили на предметное стекло. Затем объект подвергали высокотемпературному тепловому воздействию, для чего выдерживали предметное стекло с объектом в муфельной печи при 700оС в течение 30 мин. За это время органические ткани объекта разрушались и выявлялись кремнийсодержащие структуры. После этого предметное стекло с полученной микросподограммой извлекали из муфеля и, охладив до комнатной температуры, подвергали микроскопированию с помощью светового микроскопа "Биолар" (Польша). Результаты представлены на фиг. 1 и 2. Использование способа-прототипа (фиг. 1) для выявления биологических кремнийсодержащих структур, позволяет выявить общий контур кремнийсодержащего объекта. Однако использование способа-прототипа приводит к спеканию кремнийсодержащих структур в крупные агломераты, которые отчетливо видны на фиг. 1. При этом не выявляется даже тонкая структура поверхности самих этих агломератов (фиг. 2). Кроме того, полностью разрушаются кремнийсодержащие органические структуры.
П р и м е р 2. Операции выполняли как описано в примере 1. Перед микроскопированием полученную сподограмму обрабатывали стандартным препаратом соевого лектина, меченного флюоресцеирующей меткой (SBA-FDTClabelled, 20% в растворе PBS; N L-1020) (см. Biochemicals organic compounds for research and diagnostic reagents, "Sigma". USA, 1990), а затем подвергали микроскопированию на ультрафиолетовом микроскопе "Люмам И-3" (СССР). Экспериментальные результаты приведены на фиг. 3. Анализ результатов показывает, что при использовании предлагаемого способа после высокотемпературной обработки также, как и в случае использования способа-прототипа, получаются спекшиеся агломераты, однако обработка препаратом флюоресцирующего лектина позволяет рассмотреть тонкое строение поверхности выявленных микросподографированием неорганических кремнийсодержащих структур. Несмотря на выявление тонкого строения неорганических структур в данном варианте, где, как и в способе-прототипе, использовали высокотемпературную тепловую обработку, невозможно выявить органические кремнийсодержащие структуры.
П р и м е р 3. Исследуемый биологический объект - цветковую чешую зерновки риса Краснодарский 424 наносили на предметное стекло и термостатировали в термостатической камере - Komatsu Eletronics Inc. , (Япония) в мягком режиме при 30оС в течение 30 мин (время обработки как в способе-прототипе). Затем объект обрабатывали препаратом лектина N L-1020 как описано в примере 2. После этого объект подвергали микроскопированию на ультрафиолетовом микроскопе "Люмам И-3" (СССР). Экспериментальные результаты приведены на фиг. 4.
Предлагаемый способ позволяет выявить нативное тонкое строение кремнийсодержащих биологических структур, причем выявляются кремнийорганические структуры, не разрушающиеся в отличие от способа-прототипа. В данном случае на фиг. 4 прекрасно видны флюоресцирующие кремний-целлюлозные волоски (трихомы) и тонкая организация их поверхности, а также тонкая организация продольных рядов окремневших цилиндрических клеток на поверхности чешуек. Оба названных типа структур при использовании способа-прототипа полностью разрушаются.
Исследуемый объект подвергали тепловой обработке при 20 и 40оС. При этом тепловая обработка при 20оС не дает необходимой повторяемости эффекта от использования флюоресцеирующих лектинов при дальнейшем микроскопировании. Обработка при 40оС вызывает скручивание листьев и приводит к невозможности увидеть нативные структуры. Воздействие на исследуемый объект температурой 30оС дает наиболее стабильные, повторяемые результаты, являясь оптимальным вариантом.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить нативное состояние кремнийсодержащих биологических структур, в т. ч. тех, где кремний присутствует в форме кремнийсодержащих соединений. Это, в свою очередь, позволяет вести работы по направленной оценке гистологических и цитологических процессов у кремниефильных организмов, по использованию морфологии выявляемых кремнийсодержащих структур в систематике и селекции; по их роли в формировании урожая; в устойчивости и т. д. Заявляемый способ достаточно прост, требующиеся для его осуществления материалы доступны в любой биохимической лаборатории. (56) Loshida Sh. "Laboratory Manual forphysiological Studies of rice. 2-nd ed. The 2RR2. Manila, 1972, p. 72.
Прозина М. Н. Ботаническая микротехника. М. : Высшая школа, 1960.
Формула изобретения: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР, включающий тепловую обработку препарата биологического объекта и микроскопирование, отличающийся тем, что тепловую обработку проводят при 20 - 40oС, а перед микроскопированием объект обрабатывают препаратом флюоресцирующего лектина.