Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование для лечения опухолей и в трансплантации. Цель - повышение цитотоксического действия коньюгата. Для этого путем коньюгирования 14-галоидарубицина (1dа/ с моноклональным антителом или его фрагментом, содержащим по меньшей мере один антигенсвязывающий участок антигена, получают цитотоксический коньюгат, который очищают с помощью адсорбционной или ионообменной хроматографии от идарубицина. 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2009500
Класс(ы) патента: G01N33/53, G01N33/577
Номер заявки: 4355348/14
Дата подачи заявки: 10.03.1988
Дата публикации: 15.03.1994
Заявитель(и): Фармиталиа Карло Эрба С.р.л. (IT)
Автор(ы): Ян Фаркьюхар Кэмпбелл МакКензи[AU]; Джеффри Аллан Питерс[AU]
Патентообладатель(и): Фармиталиа Карло Эрба С.р.л. (IT)
Описание изобретения: Изобретение относится к конъюгантам иммуноглобулина, способу их получения и использованию.
Общая концепция целенаправленной доставки антинеопластических веществ к опухолям, используя моноклональные антитела (Moab) известна, и в настоящее время определяется ее терапевтическое значение. Обычно такой подход включает получение конъюгантов антитела с токсическим веществом, способных селективно локализоваться и убивать клетки опухоли. Основное внимание уделялось конструированию иммунотоксинов из A-цепей токсинов растений и бактерий и антител, таких которые связывают антиген и, проникая внутрь, ведут к гибели клеток. В действительности многие Moab, которые считались специфичными к опухолям, оказались также реакционноспособными по отношению к субпопуляциям нормальных клеток, и, следовательно, может оказаться невозможным использовать такие сильные токсины из-за того, что потенциально они могут повредить нормальные ткани. Безопасной альтернативой растительным токсинам является соединение антител с обычными противоопухолевыми препаратами такими, как доксорубицин, виндезин, хлорамбуцил, мелфалан и метотрексат. Из-за неспецифической токсичности обычно используемых антинеопластических агентов предпринимались попытки повысить их терапевтический индекс путем соединения их с Moab и с ассоциированными с опухолью антигенами.
Цель - повышение цитотоксического действия конъюганта.
Настоящее изобретение раскрывает конъюганты иммуноглобулина, включающая Ida, соединенные с моноклональными антителами или их фрагментами, включающими по меньшей мере, один из участков связывания антигена данного антитела.
Ida описан в патенте США 4077988. Предпочтительно 2-8 молекул Ida ковалентно связаны с каждой молекулой антитела или фрагмента антитела, более предпочтительно 2-6. Обычно, но не обязательно, молекулы Ida присоединены в положении 14 к моноклональному антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно они связаны непосредственно, хотя возможна связь через инертный носитель или сшивающий агент. Ida может быть связан с моноклональным антителом или фрагментом антитела посредством аминогруппы. Это можно осуществить, используя разлагающийся пептидный соединитель, декстрановый носитель, кислотночувствительный соединитель или полиглутаминовую кислоту.
Обычно каждое антитело или фрагмент антитела специфичны к антигену на поверхности клеток, против которых необходимо воздействовать Ida. Например, антитело или фрагмент антитела могут быть специфичны к соответствующей ткани-мишени такой, как неоплазм у человека. Примерами неоплазмов у человека, на которые может быть желательно направить действие Ida, являются опухоли груди, оболочной кишки, легких, простаты, яичников, тимуса и другие раки, саркомы и лейкемии. Антитело и фрагмент антитела может быть специфичен к неоплазмам у животных. Можно использовать антитело или фрагмент антитела специфичный к рецептору трансферина (TFR) человека, который присутствует на делящихся клетках, эритроидных клетках-предшественника и клетках различных опухолей. Подходящее анти-ТГР моноклональное антител можно использовать против рецептора трансферина на клетках LiCR-LON-Uhy-2(NMy-2).
Если конъюганты иммуноглобулина предполагается использовать для уничтожения специфичных популяций Т-лимфоцитов, то антитело или фрагмент антитела специфичен к клеточному поверхностному антигену, который сам по себе специфичен к этим Т-лимфоцитам. Поэтому антитело или фрагмент антитела может быть специфичен к популяции хелперов, супрессоров или цитотоксичных Т-лимфоцитов.
Предпочтительно моноклональное антитело или фрагмент антитела того же класса, что и то, против которого предполагается использовать конъюгант иммуноглобулина. Моноклональное антитело или фрагмент антитела человека или мыши обычно поэтому используют, когда предполагается вводить соединение человеку. Предпочтительно, чтобы антитело или фрагмент антитела был класса IgG. Фрагмент антитела может Fab или Fab' или F(ab)2 фрагмент.
Можно использовать также мономер IgM, который можно получить из IgM-антитела путем протеолитического ферментативного переваривания.
Способ осуществляется следующим образом.
Конъюганты иммуноглобулина получают по настоящему изобретению по способу, который включает соединение Ida с моноклональным антителом или фрагментом антитела. Предпочтительно 14-гало-Ida вводят во взаимодействие с моноклональным антителом или фрагментом антитела. 14-заместитель может быть фтором, хлором, бромом или иодом, но предпочтительно бром. 14-бром-Ida описан в патенте США N 4125607. Конъюгацию, таким образом, можно осуществить способом, который включает: а) смешение моноклонального антитела или фрагмента антитела с молярным избытком 14-гало-Ida; б) проведение реакции при 18-37оС; с) удаление осадка; удаление непрореагировавших исходных материалов путем гельфильтрации и е) удаление препарата (Ida) путем абсорбционной хроматографии или ионообменной хроматографии.
Стадию (а) обычно проводят в смешивающемся с водой органическом растворителе таком, как N-N-диметилформамид. Предпочтительный молярный избыток 14-гало-Ida на стадии (а) до 50 раз. На стадии (b) реакцию предпочтительно проводят в течение 1-8 ч. Обычно реакцию проводят при комнатной температуре.
Можно использовать и другие способы получения конъюганта. Если необходимо, чтобы конъюгант имел инертный носитель или сшивающий агент, расположенный между Ida и моноклональным антителом или фрагмент антитела, носитель или сшивающий агент обычно сначала присоединяют к атому углерода С-14 Ida и затем присоединяют к антителу или фрагменту антитела. Как указано выше, антитело или фрагмент антитела может быть связан с Ida посредством аминогруппы путем использования расщепляющегося пептидного соединителя, декстранового носителя, кислотночувствительного соединения или полиглутаминовой кислоты.
Конъюганты иммуноглобулина по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака у людей и млекопитающих. Можно применять терапевтически эффективное количество конъюганта. Рак может представлять собой твердую опухоль, асцитную опухоль или лейкемию. Неоплазмы у человека, которые можно лечить настоящими конъюгантами, указаны выше. Можно вводить два и более конъюганта в которых моноклональное антитело или фрагмент антитела в каждом конъюгате имеет различную специфичность.
Конъюгант можно вводить в виде инъекции. Можно его применять паэнтерально, например внутривенно. Его можно вводить локально или непосредственно в опухоль. Количество конъюганта, вводимое больному, зависит от различных факторов таких, как вид подлежащий лечению опухоли, состояние больного. Обычная доза составляет 0,4-1,6 мк конъюганта на 1 кг веса тела. Настоящие конъюганты можно применить совместно с другими химиотерапевтическими агентами или с агентами, усиливающими активность настоящих конъюгантов, например, вазоактивные агенты или фактор омертвления опухоли.
Конъюганты можно также использовать для специфичного удаления подкласса Т-лимфоцитов из популяции клеток. Человеку или животному можно ввести цитотоксично эффективное количество конъюганта, включающего моноклональное антитело или фрагмент антитела, направленный против клеточного поверхностного антитела, присутствующего на подлежащих удалению лимфоцитах. При альтернативном варианте популяцию клеток можно инкубировать in vitro с таким конъюгантом. Можно использовать комбинацию конъюгантов против двух или более клеточных поверхностных антигенов. Подлежащие удалению лимфоциты могут представлять собой хелперы, супрессоры или цитотоксичные Т-клетки.
Этот аспект настоящего изобретения можно использовать для предотвращения отторжения трансплантированной ткани у реципиента. Настоящие конъюганты можно использовать как иммуносупрессивные агенты. Реципиенту вводят такое количество конъюганта, которое эффективно предотвращает отторжение трансплантата. В данном случае предпочтительно удаляют цитотоксичные Т-клетки.
Рак у животных и человека можно лечить путем удаления Т-клеток-супрессоров введением соответствующего конъюганта. Аутоиммунные заболевания можно лечить путем введения конъюганта для удаления Т-клеток-хелперов. В каждом случае применяются указанные выше способ введения конъюганта и доза.
Иммуноглобулиновые конъюганты приготавливают в виде фармацевтических композиций с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Можно использовать любой подходящий носитель или разбавитель.
Способ поясняется примерами.
П р и м е р 1. Материалы и способы. Опухолевые клетки.
Линии клеток, исследуемые в данном примере, включали вариант [E3] III(1)75NρE3(LY-2+ мышиной тимоны (ELY (LY-2, TFR) лимфомы.
СЕМ линию (TFR+) человеческих клеток и линию (250-30,6+) человеческих клеток COLO 205. Клетки сохранялись in vitro в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕ) или в среде R PMI 1640, в которую добавляли 10% -ную нагретую сыворотку новорожденного теленка Flow 2 мМ глютамина (Commonwealth Sorum Labratorisly Iney 100 мкг/мл стрептомицина Glasco, Meltawine, Australia и 1000 И. Е. /мл пенициллина Commonwealth Sorum Laboratories). Опухоль Е3 поддерживалась in vitro серийным пассажем в (С57BL/6xBA B/c/F1 мышь/мышь CBF1. У клетки изх асцитической жидкости промыли и центрифугировали (400g х 5 мл два раза в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), рН 7,3 повторно суспендировали в PBS и подкожно ввели (S. e) в абдоминальную стенку мыши: эти операции привели к прощупываемым опухолям до лечения. Мышь подвергли серии внутривенных (iv) или внутриопухолевых (it) обработок и ежесуточно измеряли последующий размер опухолей при помощи калибра-квадрата, производя измерения по перпендикулярным осям опухолей. Данные записывались как средний размер опухоли (произведение двух диаметров± cредняя квадратическая ошибка).
Мыши.
CBA, (C57BL (6xBALB/c/CBFI мыши) и голые мыши). Экспериментальные группы из 8-10 мышей одного пола и возраста использовали в каждом эксперименте.
Моноклональные антитела.
Использовали следующие моноклональные антитела: (i) Анти(Ly-2.1/IgGI), реагирующее с мышиной Ly-2.1 специфичностью A3C6(антиTFR/IgGI),
реагирующее с трансфериновым рецептором человека (TFR) и (iii) антитело, обозначенное 250-30.6, реагирующее с антигеном, присутствующим на клетках карциномы ободочной кишки человека.
MoAb выделили из асцитической жидкости осаждением при помощи 40% -ного сульфата аммония, растворением в PBS и диализом тем же буферным раствором. Эти неочищенные препараты либо абсорбировали на протеин-A-сефарозе интенсивно промывали PB (рН 7,3) и разбавляли 0,2 М глицин(HCl) (рН 2,8), либо пропускали через синюю колонну A ligel.
После нейтрализации MoAb подвергли диализу по отношению к PBS взяли аликвотную пробу и хранили при -70оС. A3C6 получили внутрибрюшинной иммунизацией мыши CAB с недельными интервалами в течение трех недель клетками LiCR-LON-HMy-2-(HMy-2)/OKT9+ve в количестве 2х106, удаляя селезенки через трое суток после последней инъекции и сливая с клетками Р3-NSI-AG4-1(NG-1).
Получение и количественная оценка конъюгантов.
Интактные анти-Ly-2.1, анти-TFRMoAb или 250-30.6 (1-2 мг/мл в борном буферном растворе, рН 8,0) смешали с молярным избытком (1-50) 14-бром-4-деметоксидаунорубицина (Br-Ida), растворенного в (NN)-диметилформамиде (ДМФ) при 10 мг/мл. Реакцию поддерживали при комнатной температуре 4 ч перед центрифугированием (400gx5 мин) для удаления любого осадка. Свободный Br-Ida и другие исходные вещества удалили гельфильтрационной хроматографией, используя колонну Sephadex G-25/РД-10. Pharmacia и конъюганты затем пропустили через колонну PorapaxA/Millipore для удаления любого поглощенного лекарства. Количество IdA, включенного в конъюганты лекарства MoAb определялось абсорбционной спектрометрией при 483 мм/Е498 = 3,4х103 М-1см-1 и протеиновой оценкой.
Активность антитела.
Тест на розеткообразование, использующий овечий антимышиный иммуноглобулин (SAMC), применили для определения активности антитела Ida-MoAb конъюгантов по сравнению со свободными моноклональными антителами (MoAb), которые подвергались тем же процедурам, которые используются в методики сцепления.
Активность лекарства.
(а) 24-часовой тест на подавление: 100 мкл клеток (2-5 х 106/мл) внесли в микротитровальную чашку, с плоским дном и выращивали 1 ч при 37оС. Свободный идарубицин (Ida), растворенный в PB, и конъюганты Ida-MoAb асептически отфильтровали и в стерильном PBS выполнили разбавления 450 мкл свободного Ida или конъюганта добавили в клетки, используя двойные лунки для каждой пробы: контрольные лунки получали 50 мкл PBS и клетки выращивали при 37оС, 7% CO2 в течение 24 ч.
b) 30-минутный тест на подавление: 200 мкл клеток (2-5 106/мл) собрали в стерильные пробирки Эппендорфа, повторно суспендировали в стерильном лекарстве или конъюганте и смешивали 30 мин при 37оС. Затем клетки центрифугировали (400g х 5 мин), повторно суспендировали в среде выращивания и 100 мкл аликвоты высеяли в микротитровальную чашку, используя двойные лунки для каждой пробы до инкубационного периода 16-24 ч. После инкубационного периода в обеих этих пробах добавили 50 мкг питательной среды, содержащей I и Ci[3H] тимидина (удельная активность = 5 Ci/ммоль); Amersham и чашки выращивали 2-4 ч. Клетки затем собрали, обезводили, отдельные пробы разделили и посчитали на бетасцинтилляционном счетчике. Введение [3H] тимидина выражалось, как процентное подавление во введении контрольных проб. Стандартная ошибка для любой точки создавалась двойными определениями и не превышала 5% для любой заданной экспериментальной точки.
Токсичность.
Группам из 10-20 CBA мышей давали одну внутривенную инъекцию различных доз Ida и Ida-анти-Ly-2.1 и наблюдалась выживаемость мышей по отношению к дозе лекарства, выраженной в мг/кг. Органы этих мышей удаляли, взвешивали до фиксации в формалине и окрашивании гемотоксилином-эозином.
Результаты.
Получение и определение характеристик конъюгантов.
Br-Ida ковалентно соединили с несколькими MoAb: против человеческого TFR, против антигена, присутствующего на раковых клетках ободочной кишки человека (антитело 250-30.5) и против Ly-2 аллоантигена мыши. Условия реакции установили для конъюгации, изменяя молярный избыток Br-Ida, добавленного в MoAb и на компромисс между более высоким введением Ida и более низкими протеиновыми выделениями. Ida/анти-Ly-2.1, Ida-анти-TFR и Ida-260-30.6 (данные не показаны) включали 3-5 молекул Ida при протеиновых выделениях больше 50% . Реакция Br-Ida с моноклональными антителами (MoAb) может обеспечить два типа связей. Для установления того, что было представлено, конъюганты подвергли воздействию рН 4,5 или 9,0 в течение 48 ч. 50% связанного лекарства было освобождено при воздействии основания (рН 9,0), в то время, как при рН 4,5 потерь не наблюдалось. Это позволяет предположить, что по меньшей мере 50% лекарства имеют сложноэфирную связь, так как сложноэфирная связь чувствительна к основным условиям, пока аминная связь является устойчивой.
Активность антитела.
Титры антитела до и после конъюгации измеряли методом розеткообразования и они определялись, как разбавление, при котором 50% клеток-мишеней демонстрировали розетки. Ida-анти-Ly-2.1 конъюганты, содержащие 2 и 8 молекул Ida имели титры антитела по отношению к клеткам КЗ 1: 56000 и 1: 33000 соответственно, в то время, как титр неконъюгатированных антител был равен 1: 8000. Ida-250-40.6 конъюганты, содержащие 2 и 6 молекул Ida, имели титры антител против клеток COLO 205 1: 16000 и 1: 11000 соответственно, в то время как титр неконъюгатированных антител был 1: 33000. Таким образом, наблюдается некоторая потеря активности антител из-за процедуры конъюгации: конъюганты с менее 6 молекулами Ida-молекулой MoAb использовали для исследований in vitro и in vivo. Было отмечено, растворимость и активность антител Ida-анти-Ly-2.1 конъюгантов значительно снижаются ниже этих уровней внесения (данные не приводятся). Максимальное число молекул Ida, которые можно полезно вносить, сильно меняется в зависимости от индивидуального антитела.
In vitro активность и идарубицин и идарубицин-моноклональные антитела конъюганты.
In vitro цитотоксичность Ida и двух Ida-MoAb конъюгантов на линии клеток мыши ITT/I/75NSEB/Ly-2+TFR-/ и линии клеток СЕМ человека (Ly-2-TFR) измеряли в 24-часовом тесте подавления и определяли И. Д. 50/50% подавления при внесении стандартов 3Н-тимицина. Результаты показаны в табл. 1. И. Д. 50 для Ida находилась в диапазоне 1,0-2,5% 10-7 М для обеих проверяемых линий клеток (табл. 1) И. Д. 50 для Ida-анти-Ly-2.1 на Е3 была в 4 раза больше и для Ida-анти-TFR на СЕМ значения И. Д. 50 были в 1-2 раза больше, чем для свободного Ida (табл. 1). Следовательно, свободный Ida был более цитотоксичным по отношению к Е3 и СЕМ, чем Ida анти-Ly-2.1 и Ida-анти-TFR соответственно. Однако эти конъюганты Ida-MoAb проявляют 10-кратную меньшую цитотоксичность к нереагирующим линиям клеток (табл. 1), отмечая таким образом, что их цитотоксичное воздействие было специфичным и являлось результатом их задержки активности антител.
Конъюганты Ida-250.30.6 были слегка менее активными, чем свободный Ida. Свободный Ida имел И. Д. 50 6 х 10-8, в то время, как конъюгант имел И. Д. 50 3,55 х 10-7 М на линии клеток-мишеней COLO 205.
Для изучения, проявляют ли конъюганты избирательность в их цитотоксичном действии по отношению к клеткам-мишеням Ida анти-Ly-2.1 и Ida-анти-TFR выращивали 30 мин с Е3 (Ly-2+) клетками до вымывания несвязанного конъюганта и измерения цитотоксичности. Ida-анти-Ly-2.1 конъюгант имел И. Д. 50 6,2 х 10-7 М для свободного Ida. В противоположность этому, нереагирующий Ida-анти-TFR конъюгант имел И. Д. 50 5,0 х 10-6 М, т. е. в 10 раз больше, чем для свободного Ida, показывая, что активность связывания антител Ida-анти-Ly-2.1 конъюганта приводит к его избирательной цитотоксичности. Аналогично Ida-250-30.6 конъюгант и свободное лекарство выращивали 30 мин с COLO 205 (250-30.6 + ve) и Е3 (250-30.6 - ve) линиями клеток перед промывкой и проведением испытания на цитотоксичность. Обе линии клеток проявили аналогичную реакцию на дозу свободного лекарства, т. е. 9,2 х 10-7 М для COLO 205 и 9,8 х 10-7 М для Е3. Однако Ida-250.30.6 конъюгант был в 4 раза более токсичным по отношению к COLO 205, чем к нереактивной линии клеток Е3 антитела. Аналогичные результаты получили, используя линию клеток СЕМ и Ida-анти-Ly-2.1 как нереактивный стандарт (данные не показаны). Для дополнительной убежденности, что цитотоксичность конъюгантов Ida-MoAb для клеток мишеней была специфической и имела место в сайте связывания антитела, мы провели исследования по ингибированию цитотоксичности конъюганта, используя свободные MoAb.
При концентраиции Ida 4,0 х 10-6 М (2 мкг анти-Ly-2.1), цитотоксичность конъюганта анти-Ly-2.1 на Е3 клетках была снижена на 70% после добавления 50 мкг (250 мкг/мл) анти-Ly-2.1, указывая, что цитотоксичность конъюганта Ida-анти-Ly-2.1 непосредственно связана с ее характеристикой связывания антител. Аналогичные контрольные результаты получили с 260-30.6. Следует отметить, что во всех тестах свободные анти-Ly-2.1, анти-TFR и 250-30.6 были нецитотоксичными (данные не показаны).
In vitro лечение клеток мышиной тимомы ITT/I/ 75NS Е3.
Для оценки подавления роста твердых опухолей группы мышей CBI (10 особей в группе), привитых 2,0 х 106 Е3 клетками подкожно в абдоминальной области, лечили внутривенными инъекциями одного из следующих препаратов: (I) PBS, (ii) анти-Ly-2.1 (iii) Ida, (iii) Ida-анти-TFR, или (v) Ida-анти-Ly-2.1. Мыши получали 20 мкг Ida и/или 1200 мкг анти-Ly-2.1 соответственно на 4 и 5 сут (размер опухоли = 0,1 см2) после инокуляции.
В пределах 24 ч первой обработки обработанные Ida анти-Ly-2.1 мыши имели средний размер опухоли, равный 20% опухоли, леченных PBS мышей (т. е. 80% уменьшение массы опухоли). Очевидно, что один препарат анти-Ly-2.1 и Ida, ковалентно связанный с неспецифическим анти-TFR и MoAb не влияли на рост опухоли Е3. Опухоли мышей, получающих только Ida, уменьшались до 50% , однако 3 из этих мышей погибли, а другие имели 25% снижения массы тела.
Индивидуальные кривые роста опухолей мышей, принимающих Ida-анти-Ly-2.1, показали снижение 9 и 10 опухолей во время курса лечения. 5 из 10 опухолей полностью регрессировали и не появились повторно (200 сут) и те опухоли, которые продолжали расти после завершения лечения (5 из 10) росли с меньшими скоростями, чем опухоли мышей, которых лечили PBS и Ida-анти-TFR. Был проведен дополнительный эксперимент для оценки внутривенного лечения больных опухолей, используя Ida-анти-Ly-2.1. Группам CBFI мышей (10 особей в группе) инокулировали 3,0 х 106 Е3 клеток, и мыши затем получили 15 мкг и 900 мкг Ida и анти-Ly-2.1 соответственно на 6 (размер опухоли = 0,2 см2) и 7 сут после инокуляции опухоли. Мыши, обработанные Ida-анти-Ly-2.1 имели средний размер опухоли на 50% меньше, чем мыши, обработанные PBS и 66% опухоли мышей, обработанных Ida на седьмые сутки. Эта тенденция продолжалась до окончания исследования (18 сут). Индивидуальные кривые роста опухолей 10 мышей CBFI, принимавших Ida-анти-Ly-2.1 показывают, что было 4 регрессии и одно полное исчезновение массы опухоли (200 сут, данные не приводятся). Следовательно, Ida-анти-Ly-2.1 был эффективен против больших опухолей и в обоих экспериментах антиопухолевая активность Ida была значительно улучшена при связывании с анти-Ly-2.1 MoAb.
In vitro лечение опухоли ободочной кишки человека COLO 205.
Воздействие Ida-анти-250.30.5 конъюганта оценивалось на голых мышах (nu/nu), порождающих ксенотрансплантаты COLO 205.
Инъекции подкожно в абдоминальную стенку 2 х 106 клеток привела к пальпируемой опухоли через 4 сут (примерно 0,1 см2). Группы из 10 мышей затем лечили внутривенными инъекциями одного из следующих препаратов ((I)PBS(ii) 250-30.6, (iii) Ida плюс 250-30.6 (неконъюгированные); (iv) Ida, (v) конъюгант Ida-250.30.6. Всего ввели 275 мкг Ida сериями внутривенных инъекций (5) на 4,5,6,10 и 12 сут после инокуляции опухоли.
В группах мышей, которых лечили PBS или неконъюганированным 250-30.6 не наблюдался терапевтический эффект. При применении только Ida 2 из 10 мышей выжили, в то время, как все мыши из группы, получавшей неконъюганированный Ida плюс 250-30.6 были мертвы на 7 сут, проявив предварительно явные симптомы токсичности, такие, как потеря веса. Мыши, получившие конъюгант Ida 250-30.6 характеризовались резким уменьшением размера опухоли. В противоположность этому, кривые роста опухолей для отдельных мышей показывают, что 5 из 10 мышей имели опухоли, которые регрессировали на 7 сут, эти опухоли затем продолжали расти, хотя 2 из 10 мышей остались без опухолей. Эти мыши не проявляли симптомов токсичности.
Внутриопухолевое лечение.
Внутриопухолевая терапия оказалась полезным способом для иммунотерапии опухолей человека и животных. Следовательно, провели исследования для определения характеристик противоопухолевой активности конъюгантов Ida-анти-Ly-2.1 при введении их непосредственно в твердых Е3 опухоль. У групп из 10 мышей CBFI, которым подкожно имплантировали 3,0 х 106 Е3 клеток, развились опухоли (0,1-0,2 см2) на 5 сут после инокуляции опухоли. Лечение состояло из 2 инъекцией на 5 и 6 сут после имплантации опухоли, причем мыши получали одно из следующих лечений (1) PBS (2) Ida, (3) анти-Ly-2.1 или (4) Ida-анти-Ly-2.1 (общее количество Ida = 30 мкг). Ida-анти-Ly-2.1 проявил наибольшую антиопухолевую активность, свободный Ida и только анти-Ly-2.1 не проявили влияние на рост опухоли при введении прямо в опухоль. Мыши, которые получали Ida-анти-Ly-2.1 имели средний размер опухоли, равный 60% опухоли мышей, которые получали PB на 8 сут, и 30% опухоли мышей, которые получали PBS на 13 сут. Индивидуальные кривые роста опухолей (данные не показаны) мышей, которые получали Ida-анти-Ly-2.1, показали одну полную регрессию, в то время, как остальные мыши проявили задержанное снижение роста опухоли на 3 сут после завершения лечения.
Токсичность.
Для экспериментов по острой токсичности группам из 10 CBA (Ly-2.1+) мышей давали одну инъекцию различных доз Ida, Ida-анти-Ly-2.1 или Ida-анти-TFR. Все мыши, которым вводили Ida, показали начальную потерю веса до 25% от исходного веса; однако у мышей, обрабатываемых любым конъюгантом Ida-MoAb не наблюдалась потеря веса. В табл. 2 показана токсичность Ida и Ida-анти-MoAb конъюгантов, выраженная в значениях ЛД50 и ЛД10. Как показано, ЛД10 Ida-анти-Ly-2.1 была 10,0 мг/кг Ida по сравнению с только 0,75 мг/кг для свободного Ida. В дополнение, конъюгант Ida-анти-TFR имел ЛД10 8,0 мг/кг. Конъюганты Ida-MoAb не проверялись на ЛД50 дозу. Эти результаты показывают самый большой терапевтический индекс конъюгантов Ida-MoAb по сравнению со свободным Ida.
N. T = не проверялись.
Гистопатологические результаты
Острый эффект: Внутривенное введение свободного Ida (1,0 мг/кг) приводит к атрофии белой пульпы в селезенке на 15 сут после лечения и некоторой гипертрофии сердечной мышечных волокон (данные не приводятся). В противоположность этому, одна доза Ida-анти-Ly-2.1 (2,4 мг/кг) не вызывала неспецифической тканевой токсичности, через 15 и 30 сут, хотя некоторое набухание гепатоцидов наблюдалось на 15 сут. (56) Hurwitz et al. Cancer Res. 35, 1975, 1175.
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА путем смешивания моноклонального антитела специфического к поверхностному антигену клетки неоплазмы или фрагмента антитела с токсическим агентом с последующей очисткой продукта центрифугированием и фильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения цитотоксического действия конъюгата, в качестве токсического агента используют 14-галоидарубицин, причем его берут в избытке, а при очистке продукта дополнительно осуществляют адсорбционную или ионообменную хроматографию для удаления свободного идарубицина.