Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: в коллоидной и неорганической химии золота, электронномикроскопических исследованиях в биологии и медицине. Сущность способа: в водный раствор золотохлористоводородной кислоты с рН 6,5 вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затем восстанавливают золото введением борогидрида натрия. Коньюгацию осуществляют по известным методикам.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2013374
Класс(ы) патента: C01G7/00, B01J13/00
Номер заявки: 5049681/26
Дата подачи заявки: 26.06.1992
Дата публикации: 30.05.1994
Заявитель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Автор(ы): Богатырев В.А.; Дыкман Л.А.; Щеголев С.Ю.
Патентообладатель(и): Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к коллоидной и неорганической химии золота и применимо в электронномикроскопических и твердофазных методах исследования в биологии и медицине.
Известен способ, по которому при создании маркеров золи золота получают восстановлением золотохлористоводородной кислоты ЗХВК динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Na2). По этому способу: 100 мл раствора ЭДТА-Na2 с концентрацией 3 х 10-4 М смешивают с 5 мл 0,05 N раствора карбоната калия и доводят до кипения в колбе с обратным водяным холодильником; в кипящий раствор добавляют 1 мл 1% водного раствора ЗХВК и интенсивно перемешивают.
Таким образом получают золи золота с диаметром частиц 20 нм [1] . Затем проводят приготовление маркера по методике [2,3] .
Недостатком этого способа является невозможность получения маркеров с частицами золота диаметром менее 20 нм. Также известен способ, по которому для получения маркеров с размерами частиц золота 3-17 нм, используют восстановление ЗХВК.
Наиболее близким к предлагаемому является способ, по которому при создании маркеров для синтеза гидрозолей золота, пригодных для конъюгации с биомакромолекулами, используют восстановление ЗХВК борогидридом натрия. Согласно этому способу: к 40 мл бидистиллированной воды добавляют 150 мкл 4% водного раствора ЗХВК и 200 мкл 0,2 М карбоната калия; затем порциями по 400 мкл (обычно 3-5) добавляют свежеприготовленный 0,05% водный раствор борогидрида натрия при интенсивном перемешивании до тех пор, пока раствор не станет оранжево-красным [4] , после чего золь используют для приготовления маркера [2,3] или хранят на холоду в плотно закрытых флаконах из темного стекла.
Недостатками данного способа являются: невысокая степень воспроизводимости размеров частиц маркеров, малая стабильность золей при хранении.
Целью изобретения является повышение качества препаратов за счет воспроизводимой однородности в области малых размеров частиц, и следовательно, стабильности маркера.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения биоспецифических маркеров-конъюгатов коллоидного золота, включающем синтез золей золота химическим восстановлением ЗХВК борогидридом натрия и конъюгацию их с макромолекулами, синтез золей золота осуществляют в присутствии борогидрида натрия и ЭДТА-Na2 при комнатной температуре, причем ЭДТА-Na2 вводят до борогидрида натрия.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: к 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК (в реакционную смесь может быть добавлен 0,2 М раствор карбоната калия для достижения рН, необходимого для дальнейшей конъюгации) при интенсивном перемешивании сначала добавляют ЭДТА-Na2 (3-3,5 х 10-4 м), а затем 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия; образуется золь оранжево-красного цвета.
О размере частиц золота судят по величине и положению максимума спектральной зависимости оптической плотности, определяемых с помощью стандартного спектрофотометра [3] .
Затем определяют минимальное защитное количество биополимера (зонда), необходимое для стабилизации золя золота (золотое число). Стабильным считается золь, не изменяющий цвета при добавлении хлорида натрия до концентрации 1% [2,3] .
Далее проводят конъюгацию золота с зондом, количество которого определяют исходя из золотого числа простым смешиванием на магнитной мешалке. Через 2-3 мин вносят вторичный стабилизатор (полиэтиленгликоль) до концентрации 0,02% .
Концентрирование проводят либо центрифугированием, либо диализом против полиэтиленгликоля. Затем фракционируют препараты центрифугированием в градиенте концентрации глицерина или с помощью гель-фильтрации. Отобранные фракции подвергают спектрофотометрическому контролю, доводят до оптической плотности Д(520)= 5,0 и разливают по аликвотам для хранения и использования.
П р и м е р. Синтез биоспецифического маркера стрептавидин + коллоидное золото 5 нм. К 50 мл 0,01% водного раствора ЗХВК добавляют 0,2 мл 0,2 М раствора карбоната калия для достижения рН = 6,5 - оптимального значения для дальнейшей конъюгации. К полученному раствору добавляют 5,5 мг (3 ˙10-4м ) ЭДТА-Na2 и тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Затем, увеличив обороты мешалки, вносят 0,5 мл 0,1% раствора борогидрида натрия. Практически мгновенно образуется золь оранжево-красного цвета.
Максимум спектральной зависимости оптической плотности определяется с помощью спектрофотометра. Максимум составляет 513 нм, что по теории Ми соответствует диаметру золотых частиц 5 нм.
Дальнейшие операции проводят согласно [2,3] .
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ-КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА, включающий восстановление раствора золотохлористоводородной кислоты борогидридом натрия при комнатной температуре и конъюгацию полученного золя золота с макромолекулами, отличающийся тем, что перед восстановлением в раствор золотохлористоводородной кислоты вводят динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.