Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА - Патент РФ 2016901
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА
ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА

ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ обеспечивает увеличение активности фермента каталазы вследствие иммобилизации ее с иммуноглобулином и полистиролом, а также устойчивости фермента и вследствие этого возможности использования ее для многократного употребления. 5 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2016901
Класс(ы) патента: C12N11/02, C12N9/08
Номер заявки: 4953337/13
Дата подачи заявки: 03.06.1991
Дата публикации: 30.07.1994
Заявитель(и): Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Автор(ы): Благородов С.Г.; Мартыненко Л.Д.; Свечникова Л.В.; Шепелев А.П.
Патентообладатель(и): Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Описание изобретения: Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для научно-исследовательских целей и в производстве препаратов крови для улучшения их качества.
Известна иммобилизованная композиция на основе каталазы, альбумина, связанных с грибным мицелием с помощью глутарового альдегида и комплексирующего буфера, применяемая для аналитических целей и в пищевой промышленности[1].
При стабилизации каталазой препаратов крови (иммуноглобулина и альбумина) происходит улучшение качества препарата (физико-химические свойства). Снижается уровень фрагментации, малонового диальдегида. Однако степень опалесценции не отличается от контроля. Кроме того, введение каталазы в препараты крови ставит задачу освобождения от фермента, так как препараты, применяемые в медицине, не должны содержать в себе посторонних примесей.
Цель изобретения - создание сорбента КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы для улучшения физико-химических свойств препаратов крови.
Это достигается композицией соединений на основе каталазы и иммуноглобулина (химическим путем), связанных с полистиролом (физико-химическим путем), применяемой в соответствие сорбента для очистки препаратов крови от активированных форм кислорода.
Существенными отличиями нового биологически активного вещества (БАВ) являются
устойчивость фермента каталазы в иммобилизованном состоянии;
повышение активности каталазы.
Способ осуществляется следующим образом.
К 5-6 мл раствора иммуноглобулина донорского, разведенного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,4 до концентрации 5-6 мг белка в 1 мл, прибавляют эквивалентный объем раствора каталазы, содержащей 2,8-3,2 мг белка в 1 мл, перемешивают в течение 5-7 мин и по каплям приливают 0,5 мл 1%-ного водного раствора глутарового альдегида; в течение 2,5-3 ч перемешивают при комнатной температуре, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25-30 мин, надосадочная жидкость представляет собой комплекс иммуноглобулин-катализа. Иммобилизацию комплекса проводят путем адсорбции на гранулы полистирола размером 3х5 мм. С этой целью объем полученной надосадочной жидкости доводят 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,2 до 50-60 мл, заливают полистироловые пластины (30-32 г) и оставляют на 18 ч при 4оС; несвязавшийся белок удаляют промыванием 100-120 мл физиологического раствора, рН 7,0-7,2. Полученным сорбентом КИГС-1 заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 25оС.
П р и м е р 1. Выбор оптимальной величины рН буфера при получении сорбента КИГС-1.
При получении сорбента КИГС-1 были использованы следующие величины рН комплексирующего буфера: 5,0; 7,0; 7,2; 7,4; 8,6; 9,6.
Как видно из данных табл.1, оптимальной величиной рН комплексирующего буфера является 7,0-7,4.
Кроме того, в результате иммобилизации каталазы и иммоглобулина значительно увеличивается удельная активность фермента. Если до иммобилизации она составила 35000 усл.ед.ак., то после наблюдали активность в 42000 ед. активности.
Применение иммобилизованной каталазы в составе сорбента КИГС-1 для стабилизации препаратов крови.
Полученным сорбентом КИГС-1 (на основе иммобилизованной каталазы) заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 20-25оС. Данные об эффективности применения сорбента приведены в табл.2, 3, 4, 5.
Как свидетельствуют данные таблиц, эффективность очистки препаратов крови - иммуноглобулина и альбумина сорбентом КИГС-1 превосходит эффективность взятой в качестве прототипа каталазы. Кроме того, использование в качестве стабилизатора сорбента позволяет его многократно использовать для данных целей, причем в аппараты крови не попадают посторонние вещества.
Как свидетельствуют данные табл.3, физико-химические свойства альбумина, пропущенного через сорбент КИГС-1, значительно улучшаются по всем параметрам, в то время, как стабилизированные по способу-прототипу отличаются высокой степенью опалесценции. Пpиведены данные при ускоренном старении препарата (1 месяц при 37оС).
Пропускание через сорбент КИГС-1 альбумина также способствует увеличению % мономера и препятствует полимеризации альбумина (табл.4).
Как свидетельствуют данные табл.5, пропускание иммуноглобулина через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства иммуноглобулина по сравнению с иммуноглобулином, стабилизированным каталазой.
Таким образом, пропускание через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства альбумина и иммуноглобулина.
Доказательство свободы активных центров - иммуноглобулина и фермента каталаза в иммобилизованном комплексе иммуноглобулин + каталаза.
Проверку иммунологической активности иммуноглобулина и ферментативной активности каталазы проводили следующим образом.
В лунки полистиролового планшета (фирма Flow) раститровывают антисыворотку кролика к иммуноглобулину человека класса G 0,01 М карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до титров 20480, инкубируют. Происходит связывание антисыворотки с полистиролом, несвязавшаяся сыворотка удаляется трехкратным промыванием водопроводной водой и трехкратным промыванием физраствором с детергентом Твин-20 в концентрации 0,05%.
Затем в лунки вносят комплекс каталаза + иммуноглобулин по 0,2 мл. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37оС, несвязавшийся с антисывороткой комплекс каталаза + иммуноглобулин отмывают вышеуказанным способом. В лунки планшетов вносят в качестве индикаторной системы на ферментативную активность каталазы по 0,2 мл 0,025% Н2О2 (перекиси водорода) с инкубацией в течение 10 мин при 37оС, затем 0,2 мл 4%-ного раствора молибдата аммония с инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. В лунках, где каталаза прореагировала с перекисью Н2О2, желтого окрашивания не наблюдается.
Титр препарата в опытах составил 10240. Чем больше иммуноглобулина, тем больше каталазы, тем меньше выражено желтое окрашивание. В контрольных рядах наблюдалось стойкое желтое окрашивание. Следовательно, доказательством действия активного центра иммуноглобулина является его взаимодействие с антисывороткой: сохранность каталазного центра - взаимодействие с перекисью водорода.
Таким образом, данный эксперимент доказывает, что в этом иммобилизованном комплексе остаются свободными активные центры иммуноглобулина и каталазы.
Таким образом, структурная формула иммобилизованного комплекса представляется в следующем виде
K-N=-R-=N-Jg,, где К - остаток каталазы;
Ig - остаток иммуноглобулина;
R - остаток глутарового альдегида.
Каталаза и иммуноглобулин соединяются глутаровым альдегидом, содержащим две альдегидные группы на обоих концах цепи. Эти группы реагируют при нейтральных значениях рН со свободными аминогруппами. Один конец глутарового альдегида присоединяется к лизину каталазы, другой - в лизину иммуноглобулина. С полистиролом связывание происходит физико-химическим путем за счет гидрофобного присоединения. Активные центры каталазы и иммуноглобулина остаются свободными, что проявляется в их специфическом действии - связывании антигенов (антисыворотки) и разложении перекиси водорода (отсутствие окрашивания с молибдатом аммония).
Положительный эффект достигается за счет увеличения активности фермента каталазы вследствие иммобилизации ее (с иммуноглобулином и полистиролом), а также устойчивости фермента и вследствие этого возможности использования ее для многократного употребления.
Формула изобретения: ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА общей формулы
K-N=-R-=N-Jg,,
где K - остаток каталазы;
Jg - остаток иммуноглобулина в качестве сорбента для улучшения физико-химических свойств препаратов крови от активированных форм кислорода;
R - остаток глутарового альдегида.