Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: относится к способам и устройствам для амплификации ДНК в методах генной инженерии и молекулярной биологии. Сущность изобретения: способ включает получение, амплификацию ДНК путем циклического нагревания и охлаждения реакционной смеси в замкнутой капиллярной системе, устройство которой представляет собой замкнутый капилляр из четырех сообщающихся ячеек, с определенным соотношением объемов. Каждая ячейка заключена в муфту, сообщенную с термостатом с регулятором градиента температур. Ячейки снабжены регулятором скорости потока. 2 с.п. ф-лы, 1 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2017821
Класс(ы) патента: C12Q1/68
Номер заявки: 4870176/13
Дата подачи заявки: 10.10.1990
Дата публикации: 15.08.1994
Заявитель(и): Онищенко Анатолий Михайлович
Автор(ы): Онищенко Анатолий Михайлович
Патентообладатель(и): Онищенко Анатолий Михайлович
Описание изобретения: Изобретение относится к биохимии, в частности к методу амплификации дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК).
Известны различные способы амплификации, которые в общем случае сводятся к следующему: к ДНК, выделенной из какого-либо организма, добавляют химически синтезированные олигонуклеотиды (праймеры), которые способны узнавать определенные последовательности ДНК и слипаться (комплементарно) с ним. Эти комплексы узнает ДНК-полимераза, которая из имеющихся в растворе нуклеотидов достраивает к концу олигонуклеотида последовательность, комплементарную исходной. Таким образом, процесс происходит в три основных этапа: плавление матричной ДНК, отжиг праймеров и достройка комплементарной цепи, затем цикл повторяется [1].
Наиболее близким к заявляемому является способ [2], заключающийся в следующем: готовят реакционную смесь, включающую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4 при комнатной температуре), 1,5 мМ MgCl2 100 мкг/мл желатины, 250 мкМ каждого dNTР, 2,5 ед Taq-полимеразы, 1 мМ каждого праймера (олигонуклеотида) берут 50-100 мкл смеси. За исходное количество матрицы брали 102-105 копий ДНК Матричную ДНК расплавляют при t 94оС в течение 20 с, далее проводят отжиг праймеров при 55оС в течение 20 с и достройку комплементарной цепи при 72оС в течение 30 с. Для осуществления способа используют программируемый термостат при скорости нагрева 0,3оС/с и скорости охлаждения 1оС/с, для амплификации применяют фрагмент ДНК длиной от 150 до 3000 пар оснований, продолжительность цикла 3,75 мин. Всего проводят 30 циклов.
Однако описанный способ имеет ряд недостатков: количество целевого продукта в данной ситуации ограничено, поскольку наступает насыщение, поскольку комплементарные цепи при охлаждении слипаются между собой и тем самым выключаются из последующего процесса. Лимитирующим моментом в данном процессе является также скорость охлаждения смеси, чем быстрее охлаждение, тем меньше происходит самослипание молекул, тем соответственно эффективнее амплификация. В настоящее время амплификация проводится в пробирках, помещенных в программируемый термостат.
Целью изобретения является повышение выхода ДНК.
Цель достигается тем, что плавление ДНК, отжиг праймеров и достройку комплементарной цепи проводят при регулируемой скорости нагрева 0,3-6,0оС/с и скорости охлаждения 8,5оС/с, при этом цикличность температурного режима осуществляют в замкнутой трубке, внутри которой помещают реакционную смесь.
Известные в настоящее время устройства не позволяют достичь достаточно высокой скорости нагрева и охлаждения. Поэтому для осуществления описанного способа сконструировано специальное устройство (см. чертеж), с помощью которого значительно повышается выход ДНК.
Устройство представляет собой замкнутую капиллярную систему из стекла (или другого биологически инертного и пластичного материала), состоящую из капилляров различного диаметра.
Система имеет отверстие 1 для введения образца и отбора проб, капилляр ячейки охлаждения 2, помещенный в муфту 3, соединенную с термостатом 4. Капилляр ячейки охлаждения переходит в капилляр ячейки отжига затравки 5, помещенный в муфту 6, соединенную с термостатом 7, далее через регулятор скорости потока 8 трубка переходит в капилляр ячейки достройки комплементарной цепи 9, помещенный в муфту 10, соединенную с термостатом 11. Капилляр ячейки достройки переходит в капилляр ячейки плавления ДНК 12, помещенный в муфту 13 термостата 14. Термостаты 7 и 11 снабжены регуляторами градиента температуры (15, 16).
Важным условием работы устройства является соблюдение соотношения диаметра к длине капилляров в ячейках охлаждения и плавления ДНК 1:60, а соотношение рабочих объемов капилляров 2, 5, 9, 12 как 2:15:35:6.
Устройство работает следующим образом. Термостат охлаждения 4 выводят на режим работы 10-30оС, термостат отжига 7 на температуру 30-72оС, термостат 11 на 50-75оС, термостат 14 на 80-95оС в зависимости от свойств исходной реакционной смеси. В отверстие 1 помещают реакционную смесь (описанную в примере 1 осуществления способа), наслаивают вазелиновое масло для герметизации капиллярной системы (или другое масло). Скорость потока жидкости устанавливают с помощью регулятора 8 в зависимости от длины цепи конечного продукта и свойств исходных олигонуклеотидов. Под действием различных температур в каждом капилляре жидкость циркулирует по системе. Всего проводят около 30 циклов, отслеживая завершение работы по времени или при помощи маркера цикла. Отбор полученного продукта проводят с помощью микрошприца из отверстия 1. Технологический аспект работы устройства изложен далее в примерах осуществления способа.
П р и м е р 1. Термостаты устройства выводят на следующие рабочие режимы: термостат 4 на температуру 15оС, термостат 7 - на 42оС, термостат 11 на 68оС, термостат 14 - на 95оС. Готовят реакционную смесь следующего состава: 10 мкл буферного раствора, содержащего 500 мМ KCl, 100 мМ Трис-HCl /pH 8,4/, 15 мМ MgCl2, 0,1 мкг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), 1% Np-40, затем добавляют 100 пикомолей каждого олигонуклеотида
1/ праймер идентичной последовательности иРНК 223-250 оснований следующей первичной структуры:
5' - GGCACATGTCTAAACGATCACTCTTCAC-3'
2/ праймер комплементарной последовательности овальбумина иРНК в положении 561-587 (осн.):
5' - GCTTGTGTGTCTTGATCCTTAAATGC - 3'
в конечной концентрации 1 ммоль кДНК гена овальбумина в количестве 20 пг. Далее вносят 10 мкл dNTP /2,5 ммоль/, 2 ед ТТН-полимеразы и воду до 100 мкл. Полученной смесью заполняют капиллярную систему, наслаивают 30 мкл вазелинового масла для герметизации устройства. При этом достигается скорость охлаждения 8,5оС/с и скорость нагревания 6оС/с.
С помощью регулятора скорости потока 8 прибор выводят на режим 3,75 мин на один цикл, всего проводят 30 циклов.
Из отверстия 1 извлекают конечный продукт - ДНК фрагмента гена овальбумина длиной 364 пар оснований. Электрофореграмма результатов сравнительного анализа ДНК овальбумина амплифицированного по известному методу и заявленному способу показывает, что концентрация последней больше предыдущей в 3 раза.
С помощью разработанного прибора удается в способе амплификации достичь более высокого выхода целевого продукта за счет скорости нагревания около 6оС/с и скорости охлаждения около 8,5оС/с.
П р и м е р 2. Термостаты прибора выводят на режимы, указанные в примере 1. Нагрев в термостате 7 осуществляют градиентно 37-42оС, а в термостате 12 от 55 до 68оС с помощью регуляторов потока 15 и 16. Готовят реакционную смесь как в примере 1, за исключением олигонуклеотидов, используют следующие праймеры:
1/ праймер, идентичный последовательности ов-иРНК в положении 913-929 (пар оснований) 5'- CTGATCTGTTTAGCTCTTC - 3',
2/ праймер комплементарной последовательности ов иРНК в области 1056-1072 (пар оснований): 5' - GATCAGAGACGGTTGAC - 3'
При этом скорость охлаждения составляет 8,5оС/с, а скорость нагрева 0,3оС/с. Скорость потока устанавливают таким, чтобы время цикла составило 2,5 мин. Проводят 30 циклов. Конечный продукт - фрагмент (длинной 159 пар оснований).
Денситометрический анализ проб позиций 1 и 2 показывает, что концентрация последней в 5 раз выше, чем в первой.
Таким образом, осуществление заявленного способа с помощью нового устройства позволяет повысить концентрацию ДНК в 3-5 раз в сравнении с известным.
Современные методы амплификации (фирма Celus-Perken-Elmer) позволяют получить до 0,2-1,0 мкг ДНК в расчете на одну пробирку. Заявленный способ позволяет получить в аналогичной ситуации порядка 50-100 мкг ДНК, на 1-2 порядка в сравнении с известными конструкциями.
Формула изобретения: 1. Способ амплификации ДНК, включающий помещение в емкость реакционной смеси, состоящей из матричной ДНК, праймеров синтетических нуклеотидов и ДНК, отжиг праймеров и достройку комплементарной цепи в циклическом температурном режиме, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, плавление, отжиг и достройку проводят при скорости нагревания 0,3 - 6 град, скорости охлаждения 8,5 град, а цикличность температурного режима осуществляют в капиллярной системе, внутри которой помещают реакционную смесь.
2. Устройство для амплификации ДНК, включающее реакционную емкость с отверстием для ввода пробы, снабженную термостатом, отличающееся тем, что, с целью увеличения выхода ДНК, емкость представляет собой замкнутый капилляр, состоящий из четырех последовательно сообщающихся ячеек, служащих соответственно для охлаждения, отжига праймеров, достройки комплементарной цепи и плавления ДНК, при этом ячейки заключены в муфты, сообщенные с термостатом и снабженные регулятором скорости потока, а термостат снабжен регулятором градиента температуры, причем соотношение объемов указанных ячеек соответственно составляет 2 : 15 : 35 : 6, а соотношение диаметра и длины ячеек охлаждения и плавления ДНК - 1 : 60.