Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к экспериментальной биологии, используется для диагностики алеутской болезни норок. Сущность изобретения: диагностика включает радиоиммунологическое определение вируса, при этом в качестве анализируемого образца используют пробу copros, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке. 5 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2021815
Класс(ы) патента: A61K39/00
Номер заявки: 4617589/13
Дата подачи заявки: 17.11.1988
Дата публикации: 30.10.1994
Заявитель(и): Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Автор(ы): Ковалевская А.М.; Тихонов В.А.; Набережных Г.А.
Патентообладатель(и): Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отеления РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к ветеринарии, а точнее к ветеринарной вирусологии.
Известен способ диагностики алеутской болезни норок, заключающийся в определении антител к вирусу алеутской болезни в сыворотке крови по образованию иммунного комплекса антиген-антитело с меченым радиоактивным изотопом антигеном, отделении и измерении радиоактивности этого комплекса, служающей мерой содержания антител [1].
Недостатком известного способа является его высокая трудоемкость, связанная со сложностью забора анализируемых проб крови.
Цель изобретения - упрощение способа.
Это достигается тем, что согласно способу диагностики алеутской болезни норок, включающему радиоиммунологическое определение вируса алеутской болезни, в качестве анализируемого образца используют пробу coprus, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке при 56-65оС в течение 30-60 мин.
Предлагаемый способ диагностики заключается в следующем.
Анализируемую пробу сoprus разбавляют в 5-10 раз буферным раствором с рH 7,4-7,5, прогревают при температуре 56-65оС в течение 30-60 мин, охлаждают до комнатной температуры, добавляют известные количества антител к вирусу АБ и меченого 125J-иодом антигена АБ, смешивают, инкубируют полученную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч, вносят раствор полиэтиленгликоля для осаждения образовавшегося комплекса антиген-антитело, осадок отделяют центрифугированием и радиоактивность осадка, служащую мерой содержания вируса АБ, определяют на автоматическом счетчике γ -излучений. Вирус АБ, вступая в конкурентное взаимодействие с меченым антигеном за ограниченное количество добавленных в систему антител, уменьшает радиоактивность осадка по сравнению с контрольными пробами, содержащими вирус.
Для осуществления заявляемого способа диагностики АБ норок необходим предварительный прогрев образцов coprus для исключения в некоторых случаях неспецифических положительных реакций. Выбор температурного интервала обоснован экспериментально. Нижнее значение температурного интервала (56оС) является критическим для большинства белков, когда последние из нативного состояния переходят в денатурированное. Верхнее значение (65оС) для данного метода диагностики является максимальным, т.к. при более высокой температуре начинается потеря вируса АБ антигенных свойств.
П р и м е р 1. Анализируемые образцы готовят растворением 100 мг coprus в 900 мкл фосфатно-буферного раствора, имеющего следующий состав: Na2 HPO4 ˙ 2H2O 10,6 г; натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ˙2H2O 3,73 г; бычий сывороточный альбумин 1,0 г, вода дистиллированная до 1 л. Образовавшуюся 10% -ную взвесь coprus осветляют центрифугированием при 3000g в течение 10 мин. 200 мкл надосадочной жидкости вносят в пластиковые или стеклянные пробирки, прогревают в термостате при 56оС в течение 30 мин, затем охлаждают при комнатной температуре. Предварительно подбирают разведение сывороток экспериментально зараженных или спонтанно больных алеутской болезнью норок или, что предпочтительнее, иммунизированных вирусом АБ кроликов, содержащих антитела к вирусу АБ, либо очищенных хроматографией кроличьих антител, а также разведение меченого антигена для обеспечения оптимальных условий анализа. На основании полученных данных строят кривые связывания меченого антигена, точки перегиба которых соответствуют рабочей концентрации антисывороток в конкурентном радиоиммунологическом анализе. В идеальном случае это то количество антител, которое связывает 50% меченого антигена.
Подготовив анализируемые образцы, антисыворотку и антиген, приступают к выполнению анализа.
В пробирки с анализируемыми образцами вносят антисыворотку, 200 мкл меченого антигена и 1,0 мл 10%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000, смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Одновременно обрабатывают контрольные пробы, содержащие
контроль неспецифического связывания: 200 мкл буферного раствора + 200 мкл меченого антигена + 1,0 мл ПЭГ;
контроль специфического связывания: 200 мкл буферного раствора + антисыворотка + 200 мкл меченого антигена + 1,0 мл ПЭГ.
После окончания инкубации пробирки центрифугируют при 2000g в течение 15 мин, супернатанты сливают, следя за максимально возможным удалением жидкости, пробирки помещают в автоматический γ -счетчик для определения радиоактивности осадков. Результаты сравнивают с контрольными пробами. Контроль 1 вычитают из результатов всех определений; контроль 2 является мерой связывания меченого антигена в отсутствии конкуренции со стороны немеченого за ограниченное количество антител. Совпадение результатов неизвестных проб с контролем 2 (с учетом ошибки эксперимента) указывает на отсутствие вируса АБ в анализируемых образцах.
Схема анализа представлена в табл.1.
Результаты типичного определения даны в табл.2.
В табл.2 приведены результаты определения вируса АБ у 10 норок. Процент связывания меченого антигена у больных норок может меняться в широких пределах в зависимости от содержания вируса. Эти величины связаны обратной пропорциональной зависимостью, - чем меньше процент связывания метки, тем выше концентрация вируса в исследуемом образце. Таким образом, уменьшение счета образца или процента связывания по сравнению с контролем связывания (ВО), или отношения ВХО c учетом ошибки определения является признаком присутствия вируса в исследуемом образце.
П р и м е р 2. Определение вируса АБ осуществляют аналогично тому, как описано в примере 1, но прогрев пробы coprus осуществляют при температуре 65оС в течение 60 мин.
Табл. 3 иллюстрирует влияние температурной обработки анализируемых образцов coprus на радиоиммунологическое определение вируса АБ. Приведены результаты анализа двух образцов, взятых от больной (по данным серологической диагностики) и здоровых норок.
Без тепловой обработки процент связывания меченого антигена здоровых норок не достигал уровня контроля специфического связывания, что затрудняет интерпретацию результатов диагностики. При нагревании образцов при 56-65оС - температурном интервале, в котором вирус АБ устойчив, результаты определения позволяют четко установить как содержащие, так и не содержащие вирус образцы.
Из данных табл.4 видно, что временно интервал температурной обработки coprus от 30 до 60 мин является оптимальным и достаточно широким, что представляет дополнительные удобства. Увеличение времени температурной обработки до 120 мин приводит к ухудшению результатов из-за образования геля вследствие денатурации белков.
Из данных табл.5 видно, что при одновременном определении у одних и тех же животных антител к вирусу АБ в сыворотке крови методами РИЭОФ и иммунорадиологическим, а в пробах coprus вирусов АБ предлагаемым методом встречаются образцы (N 10 и N 12), когда при отрицательной серологической диагностике животные являются носителями вируса АБ. Таким образом, предлагаемый способ более достоверен, т.к. позволяет выявить зараженных вирусом АБ животных, не диагностируемых серологическими методами из-за отсутствия антител или низкого их содержания.
Формула изобретения: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК, включающий радиоиммунологическое определение вируса алеутской болезни, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, при проведении радиоиммунологимческого определения, в качестве анализирующего образца используют пробу copros, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке при 56 - 65oС в течение 30 - 60 мин.