Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ
КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Область использования: иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: синтетический иммуносорбент, полученный обработкой полисахаридного антигена периодатом натрия и полиэтиленимином, позволяет определять пневмококковые и стрептококковые инфекции. Иммуносорбент имеет мол.м. около 300 млн. дальтон, что позволяет использовать его в тесте агглютинации при выявлении пневмококковых и стрептококковых инфекций. 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2027190
Класс(ы) патента: G01N33/531
Номер заявки: 4859936/13
Дата подачи заявки: 22.08.1990
Дата публикации: 20.01.1995
Заявитель(и): Институт клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР; Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.Мечникова
Автор(ы): Губайдулин В.Р.; Лукьянчикова Н.Л.; Аутеншлюс А.И.; Михайлова Е.С.; Падюков Л.Н.; Левина Л.А.
Патентообладатель(и): Губайдулин Виль Рашадович; Лукьянчикова Нина Леонидовна; Аутеншлюс Александр Исаевич; Михайлова Елена Семеновна; Падюков Леонид Николаевич; Левина Людмила Абрамовна
Описание изобретения: Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к конъюгатам и иммуносорбентам.
Иммуносорбент может найти применение для диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний.
Известна активированная матрица для иммобилизации белков (Зенюк А.А. и соавторы. Активированная матрица для иммобилизации белков, авт.св. СССР N 1280834, кл. G 01 N 33/50) формулы
П-O-CH2--CH2-NH-(CH2)n-<>-O-N где П - остаток агарозы, сефадекса или целлюлозы; n=2 или 3 для иммобилизации белков.
Используют полисахаридные матрицы, которые получают в три стадии.
1. Активация полисахаридного носителя эпихлоргидрином.
2. Раскрытие эпоксидного цикла аминокислотой.
3. Этерификация N-оксисукцинимидом карбоксильной группы.
На матрице иммобилизуют белки, содержащие первичную аминогруппу, например, транскортин, сексстероидсвязывающий глобулин, иммуноглобулины.
Однако матрица непригодна для иммобилизации полисахаридных антигенов, так как последний не может связываться с используемым связывающим элементом.
Известен конъюгат, в котором активную группу белкового антигена связывают сульфонирующим или алкилирующим, или ацилирующим агентами (реагент агглютинации и способ его получения, заявка ЕПВ N 280561, кл. G 01 N 33/546).
Однако связывающие агенты пригодны лишь для белковых антигенов, которые зачастую недостаточно специфичны и, следовательно, не позволяют выявить заболевание, что снижает точность диагностики.
Известен также иммуносорбент [1], который выбран в качестве прототипа. Представляет собой конъюгат антиген-полисахарид-протеин. Полисахарид и протеин ковалентно связаны через
-CH2- -протеин. Низкие агглютинирующие свойства не позволяют использовать его в растворе. Малые адгезионные свойства допускают его использование только с активированными твердофазными носителями. В частности, конъюгат не может использоваться с неактивированными твердофазными носителями, например, из полистирола, поливинилхлорида, полисахарида.
Решаемой задачей является создание конъюгата, обладающего хорошими агглютинирующими свойствами, что позволит использовать его в растворе, и достаточными адгезионными свойствами, что позволит использовать его с неактивированной твердой фазой. Это значительно расширяет область использования конъюгата.
Техническим результатом является то, что альдегидную группировку полисахарида связывают полиэтиленимином.
Сущность изобретения состоит в том, что конъюгат имеет формулу

где n = 103-106
Из работ, описанных во вводной части описания, известно, что полисахарид используется в качестве антигена и активированного носителя. Использование полиэтиленимина в качестве связывающего звена не известно. Известно лишь использование его в качестве поликатиона для связывания сульфо-, карбокси- и других кислых групп (Haars A., Zonnez S. Hutterma A. Quantitative determination of lignosulfomates from sulfite spend liguors using presipitation with polyethyleneimine. Holzforsch 35(2); 59-65. 81).
Следовательно, налицо изобретательский уровень.
Конъюгат получают следующим образом.
Полисахаридный антиген, например С-полисахарид пневмококка (СПСХ) или А-полисахарид стрептококка гр. А( АПСХ) обрабатывают периодатом натрия, затем добавляют раствор полиэтиленимина. Полная реакционная схема следующая:
1.(C6H10O5)n+ 2 NaIO4__→(C6H6O3(HO)2)n+I2+4O2+2Na++2H+
2.(C6H6O3(HO)2)n+ (C4H9N)n(NH2)<>(C10H17O3)n+ 2H2O
Продукт реакции соответствует формуле
где n = 103-106
П р и м е р. Дозировка ингредиентов приведена в расчете на 1 мг полисахарида. 1.1 мг СПСХ - антигена пневмококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл). Инкубируют 1 ч в темноте. Затем добавляют каплю глицерина (для удаления свободного пеиродата натрия) и при энергичном встряхивании вливают 0,45 мл раствора полиэтиленимина, 2 мг/мл (мол.м. 30-40 кДа) на 0,1 М бикарбонатном буфере рН 8. Инкубируют 2 ч.
2. 1 мг группоспецифического полисахарида стрептококка группы А-антигена стрептококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл) на бикарбонатном буфере и выдерживают 1 ч в темноте. Для удаления свободного периодата натрия вливают каплю глицерина. Затем добавляют 0,45 мл раствора полиэтиленимина (2 мг/мл) и инкубируют в темноте 2 ч.
Приготовленные таким образом конъюгаты доводят фосфатным буфером до 40 мл и заливают в лунки планшета для иммуноферментного анализа по 100 мкл в каждую. Выдерживают 12 ч при 4оС, отмывают дистиллированной водой 4 раза и высушивают при 37оС. После этого материал готов для проведения иммуноферментного анализа.
Поскольку полисахаридный антиген является специфичным для острых инфекционно-воспалительных заболеваний, иммуносорбент пригоден для диагностики этого класса болезней. При этом сорбент с СПСХ - антигеном пневмококка пригоден для диагностики заболеваний, вызванных пневмококком (например острых пневмоний), с АПСХ - антигеном стрептококка группы А - для диагностики заболеваний, вызванных стрептококком группы А (ревматизм, тонзиллит, гломерулонефрит)), с Re- гликолипидом А-антигеном грамотрицательных микроорганизмов - для диагностики заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами - энтеробактериями (пиелонефрит, энтерит, аднексит и т.п.). Для диагностических целей в лунки планшета с конъюгатом вносят по 100 мл 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина на фосфатном буфере, инкубируют 1 ч при 37оС, после чего удаляют содержимое из лунок и вносят в них по 100 мкл испытуемой сыворотки в разведениях от 1:5 до 1:640. Инкубируют 1 ч при 37оС, отмывают 4 раза, добавляют в лунки по 100 мкл антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:200, выдерживают 1 ч при 37оС, отмывают 5 раз, вносят по 100 мкл субстрата - ортофенилендиамина (1 мг/мл), рН 4,7, содержащего 0,05% перекись водорода. Выдерживают в темноте 40 мин. Оптическую плотность измеряют при λ =492 нм. В качестве примера приводятся результаты исследования с иммуносорбентом СПСХ пяти больных.
1. Больной С-д, острая пневмония. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к СПСХ, выявленный с использованием разработанного конъюгата в качестве иммуносорбента, 1:320.
2. Больной Ю-с, острая пневмония, бронхиальная астма. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием предложенного иммуносорбента, 1:640.
3. Больная С-а, туберкулез легких. Титр антител 1:40.
4. Больной Н-о, саркоидоз. Титр антител 1:10.
5. Больной Г-о, хронический бронхит, высеян из мокроты стафилококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием разработанного иммуносорбента, 1:20.
Эти примеры показывают, что высокие титры антител наблюдаются у больных в острой фазе заболевания, вызванного пневмококком.
В случае использования сорбента в растворе к 50 мкл суспензии гранул сорбента с носителем добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором от 1:1 до 1:1024, инкубируют не менее 15 мин, реакцию учитывают по образованию цветного осадка.
В качестве примера работоспособности конъюгата приводятся результаты исследований, при которых определяли титр антител известным способом (стандарт) и с использованием предложенного иммуносорбента у пациентов со стрептококковой инфекцией. Результаты приведены в табл. 1.
Из табл. 1 видно, что при использовании стандарта невозможно установить степень достоверности при различной активности процесса, так как данные, полученные с его помощью, не соответствуют состоянию процесса. При использовании предложенного иммуносорбента отмечено высокодостоверное различие по группам больных.
Параллельно проводились исследования титра антител по предложенному изобретению и прототипу. Исследованы сыворотки больных, приведенных в описанных выше примерах. Результаты приведены в табл. 2.
Анализ данных табл. 2 показывает, что сорбент-прототип не пригоден в силу малой молекулярной массы для работы, так как не обладает агглютинирующими свойствами. Предложенный конъюгат можно использовать в качестве иммуносорбента в реакции агглютинации.
Формула изобретения: КОНЪЮГАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА С ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККОВЫХ И ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ.
Конъюгат полисахаридного антигена с полиэтиленимином общей формулы

где n = 103 - 106,
в качестве иммуносорбента для выявления стрептококковых и пневмококковых инфекций.