Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к иммунохимии и касается способа получения ковалентных коньюгатов. Цель - расширение спектра носителей, используемых для синтеза ковалентных конъюгатов катехоламинов, достигается введением защиты молекулы катехоламина N-трет-бутоксикарбонилом, конденсацией его с ε-аминокапроновой кислотой и ковалентным связыванием полученного продукта с носителем через активированные эфиры. 3 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2027443
Класс(ы) патента: A61K38/00
Номер заявки: 4950946/14
Дата подачи заявки: 27.07.1991
Дата публикации: 27.01.1995
Заявитель(и): Московская медицинская академия им.И.М.Сеченова
Автор(ы): Казак Л.Е.; Маслин Д.Н.; Большакова Т.Д.
Патентообладатель(и): Казак Людмила Ефимовна; Большакова Татьяна Дмитриевна
Описание изобретения: Изобретение относится к иммунохимии, в частности способам присоединения катехоламинов к молекуле носителя, и может быть использовано в медицине для разработки методов определения антител к катехоламинам и самого гаптена в крови и тканях человека и животных в целях диагностики, а также в научных целях.
Известен способ получения конъюгатов катехоламин-белок с помощью глутарового альдегида или карбодимида. При использовании их в качестве иммуногенов получены антисыворотки с низким средством и специфичностью. Они не позволяют различать катехоламины, имеющие различную структуру алифатической цепи.
Известен способ получения конъюгатов катехоламинов с белком в реакции конденсации с помощью формальдегида по Маниху с предварительной защитой алифатической NH2-группы. Недостатком способа является получение антисыворотки с низкой специфичностью и перекpестными реакциями 10-45% с родственными катехоламинами при использовании для иммунизации конъюгатов адреналин-бычий сывороточный альбумин (А-БСА). В качестве прототипа выбран способ связывания молекулы катехоламина с белком в реакции аминометилирования. Способ включает защиту NH2-группы катехоламина янтарным ангидридом. Связывание гаптена с альбумином проводят в соотношении 0,3М и 0,2-0,5М соответственно. Использованные для иммунизации конъюгаты имели молярное число 16-20. С помощью полученной антисыворотки (в рабочем разведении 2 .104) в тест-системе на базе твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) определены концентрации стандарта адреналина, равные 108-102 пкг/мл пробы. Перекрестные реакции другими веществами катехоловой структуры составили 0-0,01%.
К недостаткам способа следует отнести: для снятия защиты молекулы адреналина требуется инкубация конъюгата в течение суток при 60оС и рН 1, использование формальдегида в реакции связывания адреналина с белком. Обе процедуры вызывают деструкцию белков и ограничивают выбор белка-носителя для катехоламинов группой альбуминов.
Целью изобретения является расширение спектра носителей.
Поставленная цель достигается способом получения конъюгатов катехоламинов (КА), в которых защиту NH2-группы КА проводят карбалкоксикарбонильными группами, а инкубацию сложного эфира гаптена с белком ведут в боpатном буфере при рН 8,2 при комнатной температуре в течение 1 сут. Снятие защиты проводят инкубируя продукт с трифторуксусной кислотой 30 минут при комнатной температуре.
Сущность способа состоит в конденсации N-защищенной молекулы КА с Е - аминокарбоновой кислотой в реакции Маниха, и присоединении N-оксисукцинимидного эфира полученного продукта к белку в боратном буфере при рН 8,5 при инкубации 1 сут и комнатной температуре.
Первоначально введенная по NH2-группе КА третбутоксикарбонильная группа снимается обработкой трифторуксусной кислотой при комнатной температуре 15-30 мин. Конъюгат диализуется и высушивается лиофильно. Полярное число составило для белков 24 и 25, для полилизина-53. Воспроизводимость получения конечного продукта составляет 100%.
Отличительными признаками способа по изобретению являются:
использование для защиты аминогруппы КА алкоксикарбонильной группы с последующим снятием ее в мягких условиях, конденсация N-замещенного КА с Е-аминокарбоновой кислотой и присоединением белка в 0,1 М боратном буфере при рН 8,5 и комнатной температуре в атмосфере азота.
Способ осуществляется следующим образом.
К суспензии адреналина (или норадреналина) в растворителе добавляют дитретбутилпирокарбонат, смесь перемешивают в течение 2 ч. К полученному твердому остатку добавляют Е-аминокапроновую кислоту. Затем прибавляют формальдегид и метиловый спирт. Колбу, заполненную азотом, инкубируют 3-е сут. Из реакционной смеси продукт выделяют хроматографией на колонке IH-20. Выделенный продукт растворяют в диметилформамиде (ДМФА), смешивают с дициклогексилкарбодиимидом, гидроксисукцинимидом и оставляют на 18 ч при 20оС. Растворитель удаляют на вакууме. 0,05 мМ продукта адреналина, растворенного в 50 мкл ДМФА, инкубируют с 0,1 М боратным буфером, содержащим 25 мкг белка в атмосфере азота. Молярное отношение продукт-белок равно 100:1. После инкубации 1 сут конъюгат диализуют в 0,01М растворе уксусной кислоты. После лиофильного высушивания снимают защиту NH2-группы с помощью ТФУК, диализуют и высушивают лиофильно.
П р и м е р 1. К суспензии адреналина (1 г) в 10 мл ДМФА добавляют 1,25 г дитрет-бутил пирокарбоната в ДМФА. Смесь перемешивают в течение 2 ч при 30оС до завершения реакции. Растворитель удаляют в вакууме. Твердый остаток растворяют в эфире, раствор промывают водой, 0,4 М раствором КНSO4 и насыщенным раствором NaCl. Эфирный слой сушат при помощи сульфита натрия, а растворитель отгоняют над вакуумом. Выход N-трет-бут-оксикарбонил адреналина (1) равен 1,02 г. В Н+-ЯМР-спектре в Д3ОД содержатся характерные полосы при d 1,4(с) [C(CH3] при 2,80 (с) [NCH3] и мультиплет при 6,68-6,80 (фенильные Н).
В 2 мл 3 М раствора ацетатного буфера с рН 6,0 растворяют 126 мг продукта 1, добавляют 2 мл раствора 0,3М бикарбоната натрия, содержащего 157,4 мг ε-аминокапроновой кислоты. Затем прибавляют 3 мл 7,5% формалина и 3 мл метилового спирта. Колбу заполняют азотом и оставляют на 3-е сут до завершения реакции. Продукт 11 выделяют из реакционной смеси хроматографией на колонке с насадкой LH-20 после элюции смесью хлороформметанол (1:2) в средней фракции. Тонкослойная хроматография на пластине силикагеля, элюент пиридин-бутанол-вода-уксусная кислота (10:15:12:3). Исходные продукты I и Е - аминокапроновая кислота (Е-АКК) имеют Rf 3,4 и 1,6 соответственно. В Н1 - ЯМР спектре в СД3ОД содержатся характерные поломы при g 1,42(c) [C(CH3)3], 3.66 (c) [NCH3], 4,69m (CH-OH), 3,36 g (-CH2-N), 6.68-6.92m (H2; H3(CH2), 2,35m (CH2COO-) 40 мг продукта 11 растворяют в ДМФА, добавляют 22,3 мг дициклогексилкарбодиимида, 12,4 мг N-гидроксисукцинимида, оставляют на 18 час при 20оС, осадок отделяют фильтрованием и получают раствор, содержащий 5- (NI -сукцинимидилокси-карбонил-Е-пептиламинометил)-N-БРК адреналин. Растворитель удаляют на вакууме, продукт (III) сохраняют на холоду в Н1 - ЯМР-спектре в СDCl3 содержится характерная полоса при gmg:1,42 с C(CH3)3], 2.79c) - - , 3.32g/ -CH2-N 4,67m (CH-OH). Из сухого остатка берут навеску, соответствующую 0,05 мМ адреналина (продукт III), содержащего 0,05 мМ гаптена, помещают в 4,5 мл 0,1М боратного буфера с рН 8,2, содержащего 25 мг БСА (5.10-4 мМ). Молярное соотношение продукт/белок равен 100:1. Колбу заполняют азотом и инкубируют 24 ч, после чего диализуют в 0,005-0,01М растворе уксусной кислоты 1 сут. Продукт лиофильно высушивают и растворяют в 2-х мл ТФУК и оставляют при комнатной температуре 20-30 мин, диализуют в 0,005М растворе уксусной кислоты и сушат лиофильно. Сухой продукт является ковалентным конъюгатом адреналина и БСА. Молярное число равно 25.
П р и м е р 2. Как описано в примере 1, в качестве белка-носителя используется соевый ингибитор трипсина (10 мг СИТа и 140 мг продукта адреналина (III), получают ковалентный конъюгат с молярным числом 24.
П р и м е р 3. В качестве носителя используют синтетическую полиаминокислоту полилизин. Как описано в примере 1, соотношение продукта адреналина (III) и полилизина равно 100:1 (140 мг продукта III и 1 мг полилизина). Молярное число составило 50.
П р и м е р 4. Кривые разведения и калибровочные кривые для определения концентраций стандарта адреналина. Определение разведения антисыворотки и конъюгатов для построения калибровочных кривых проводили с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА) на полистироловых планшетах для иммунологических реакций Московского завода. Использовали высокоспецифические антисыворотки к адреналину (4). Конъюгаты, полученные в примере 1 и 2, с использованием в качестве носителей кроличий сывороточный альбумин (КСА), соевый ингибитор трипсина (СИТ), служили антигеном, сорбированным на полистироле.
Кривые разведения антисыворотки к адреналину. С помощью кривых разведения определяли оптимальное соотношение концентрации сорбированного антигена и разведения антисыворотки. В интервале 1 - 20 мкг/мл пробы (см. фиг.1) и наблюдали линейное изменение оптической плотности (ОД) и снижение ее при 100 мкг/мл пробы. Максимальная ОД выявлена для разведения антисыворотки 1/200. На фиг. 2 видна линейная зависимость ОД от разделения тестируемой антисыворотки при различной концентрации сорбированного антигена, что отражает достоверность измеряемого показателя, т.е. содержание антител или количество иммобилизованного антигена. Оптимальная концентрация антисыворотки равна 1/200 и антигена - 5 мкг/мл. Построение калибровочных кривых проводили с помощью гетерогенного ИФА в варианте количественной нейтрализации с иммуноферментной меткой против глобулинов кролика. В качестве антигена использовали также конъюгат КСА-адреналин, полученный описанным ранее способом (4). Чувствительность измерения адреналина в обоих случаях близка и составила 1 нг/мл. Перекрестных реакций с норадреналином и дофамином не обнаружено (фиг.3). Таким образом, полученные описанным способом конъюгаты с использованием любого из показанных нами выше носителей могут быть применены как иммуногены для иммуноферментного анализа.
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ путем конденсации N-защищенного катехоламина с носителем с последующим снятием защиты, отличающийся тем, что, с целью расширения спектра носителей, защиту катехоламина проводят ε -трет-бутоксикарбонилом, конденсируют его с E-аминокапроновой кислотой и ковалентно связывают продукт с носителем методом получения активированных жиров.