Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: аллерген, дрожжеподобный гриб, кандидоносительство, диагностика. Сущность изобретения: штамм Candida tropikalis ВСБ 928 выращивают в ферментере в жидкой среде в режиме циклического культивирования при pH 5,5, насыщении кислородом pO2 не ниже 80% с поддержанием уровня глюкозы в среде 0,6 - 0,8%. Отделенную культуральную жидкость концентрируют, пропуская через полые волокна марки HIP8, и разделяют методом мембранной фильтрации. Полученный аллергенсодержащий материал с молекулярной массой от 10 до 300 кД подвергают фракционированию на ДЭАЕ-целлюлозе с последующим скринингом в аллерготесте в гомологичной и гетерологичной системах. Полученный аллерген может быть использован для диагностики заболеваний, вызванных дрожжеподобными грибами вида Candida tropikalis - процентами биомасс кормового назначения.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2031657
Класс(ы) патента: A61K39/35, C12N1/14, C12N1/14, C12R1:74
Номер заявки: 5019234/13
Дата подачи заявки: 24.12.1991
Дата публикации: 27.03.1995
Заявитель(и): Московская медицинская академия
Автор(ы): Кравцов Э.Г.; Гукасян И.А.; Ермолаев А.В.; Долгих М.С.
Патентообладатель(и): Московская медицинская академия
Описание изобретения: Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для диагностики аллергических заболеваний, вызванных дрожжеподобными грибами (ДПГ) рода Candida - продуцентами биомасс кормового назначения.
Характерной особенностью предприятий, выпускающих такие биомассы, является присутствие особого биологического фактора: живых клеток микроорганизмов - продуцентов и белковой пыли микробной биомассы [1]. Как показали исследования [2 и 3] нахождение персонала в зоне циркуляции промышленного штамма ДПГ может приводить к сенсибилизации организма антигенами гриба. В то же время широкая распространенность ДПГ рода Candida в составе ценозов окружающей среды и нормальной микрофлоры человека ставит перед врачом задачу дифференциальной диагностики этиологии кандидосенсибилизации, которая должна проводиться с помощью специфических аллергенов. В настоящее время не существует специфических аллергенов для диагностики кандидосенсибилизации.
Известен способ получения аллергена из Candida maltosa выращенных на плотной среде Сабуро с 4% глюкозы, при котором аллерген экстрагировали из разрушенных механических путем клеток спиртовым раствором β-нафтола, экстракт отделяли из разрушенных клеток центрифугированием [4].
Недостатком способа является получение препарата с недостаточно высокой активностью и специфичностью.
Известны способы получения аллергенов путем экстракции из клеточных стенок и целых клеток Candida maltosa с последующей очисткой методом гельфильтрации на ультрагелях АсА и сефакриле S-200 [5].
Недостатком способов является низкая специфичность получаемых аллергенов.
Известен способ получения аллергена из среды культивирования Candida maltosa, при котором осветленную жидкую среду или экстракт из плотной среды после 7 с культивирования на них гриба очищали последовательно на катионите "Биокарб-Т" и ультрагеле АсА-44 [5].
Недостатком способа является резкое снижение в результате очистки активности аллергена.
Целью изобретения является повышение видовой специфичности аллергенного препарата.
Поставленная цель достигается тем, что культивирование биомассы проводят в ферментере в условиях контролируемого автоматического режима при концентрации глюкозы в среде от 0,6 до 0,8%, рН 5,5 рО2 не ниже 80%, скорости перемешивания 1100 об/мин и температурном оптимуме роста объекта, культуральную жидкость концентрируют в 100 раз и разделяют путем мембранной фильтрации с последующим выделением субпродукта с молекулярной массой от 10 до 300 кД, который дополнительно фракционируют методом ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЕ-целлюлозы. Искомый продукт отбирают по признаку специфичности в процессе скрининга фракций путем аллерготестирования в гомологичной и гетерологичной системах.
Способ осуществляется следующим образом.
Культуру гриба выращивают в ферментере в условиях контролируемого стерильного циклического культивирования при следующем режиме: рН 5,5 рО2 не ниже 80%, температурном оптимуме роста, скорости перемешивания 1100 об/мин, на жидкой минеральной среде с трехкратным добавлением глюкозы до содержания 0,6-0,8%.
Культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием на холоду при 5000 об/мин 15 мин, осветляют, пропуская через фильтр Зейтца, концентрируют на установке "Amicon" (полые волокна тип Н1Р8) в 10 раз и отмывают от низкомолекулярных компонентов, одновременно дополнительно концентрируя на мембране "Amicon" марки РМ-10.
Концентрат культуральной жидкости разделяют на молекулярной массе на мембране "Amicon" марки ХМ-300 в атмосфере азота при давлении 15 psi, после чего фильтрат, содержащий компоненты с молекулярной массой от 10 до 300 кД, концентрируют на мембране марки VM-2, доводя его объем до 20 мл.
Сконцентрированную на мембрану VNM-2 фракцию культуральной жидкости подвергают ионообменной хроматографии на колонке К 10/40 с ДЭАЕ-целлюлозой. В качестве стартового буфера используют 0,01 М трис HCl, содержащий 0,01 М NaCl, рН 5,5. Элюцию при ионообменной хроматографии проводят в градиентном режиме концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М. Выходящие с колонки фракции отмывают и концентрируют на мембрану VM-2 и исследуют их активность и специфичность путем аллерготестирования на морских свинках, сенсибилизированных культурой гомологичного штамма гриба и культурой Candida trapicalis, наиболее частого представителя естественных биоценозов окружающей среды и нормальной микрофлоры человека. Искомый продукт отбирают при скрининге фракций по признаку специфичности.
П р и м е р. Культуру Candida tropicalis штамм ВСБ 928 выращивают в ферментере в условиях контролируемого стерильного циклического культивирования при рН 5,5, рО2 не ниже 80%, температуре 35оС и скорости перемешивания 1100 об/мин на жидкой среде с трехкратным добавлением глюкозы до 0,6-0,8%. Взвесь среды с выросшей биомассой центрифугируют в течение 15 мин при 5000 об/мин. Выпавшие в осадок клетки отбрасывают.
Центрифугат фильтруют через фильтр Зейтца и концентрируют на установке "Amicon" (полые волокна тип Н1Р8) 10 раз, а затем отмывают от низкомолекулярных компонентов, дополнительно концентрируя на мембране "Amicon" марки РМ-10.
Концентрат культуральной жидкости фракционируют на мембране "Amicon" марки ХМ-300, после чего фильтрат, содержащий компоненты с молекулярной массой от 10 до 300 кД, концентрируют на мембране VM-2, доводя объем до 20 мл, и подвергают ионообменной хроматографии на колонке К 16/40 с ДЭАЕ-целлюлозой. В качестве стартового буфера используют 0,01 М трис HCl, содержащий 0,01 М NaCl рН 5,5. Элюцию проводят в градиентном режиме концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М. Фракции собирают, отмывают и концентрируют на мембране VM-2. Концентрацию белка в полученных фракциях определяют методом Лоури.
Фракции исследуют в аллерготесте на морских свинках, сенсибилизированных гомологичной культурой гриба (Candida tropicalis штамм ВСБ 928) и гетерологичной культурой Candida albicans в дозе, которая вызывает развитие гиперчувствительности замедленного типа у 100% животных. Рассчитывают и сравнивают среднеразрешающие дозы фракций при аллерготестировании в гомологичной и гетерологичной системах.
Специфический аллерген выходит в первом пике с фронтом стартового буфера.
Полученный материал стандартизируют по содержанию белка (1 мг/мл), разливают по ампулам и замораживают при -20оС.
Как показали результаты экспериментов на 180 животных, полученное средство не вызывает ложноположительных реакций у контрольной группы животных в дозе, выявляющей гиперчувствительность замедленного типа у 100% сенсибилизированных животных. Минимальная реактогенная доза аллергена не менее чем в 10 раз превышает дозу, выявляющую сенсибилизацию у 100% животных.
Активность препарата, полученного по конкретному примеру, оцениваемая по величине его среднеразрешающей дозы при аллерготестировании на животных, сенсибилизированных гомологичной культурой гриба, составляет 0,5 (0,4-0,75) мкг белка на животное массой 200 г. Эта доза выявляет гиперчувствительность замедленного типа у 50% животных, сенсибилизированных Candida tropicalis штамм ВСБ 928, но не выявляет ее ни у одного животного, сенсибилизированного Candida albicans. В дозе 5 мкг белка животное аллерген выявляет сенсибилизацию к Candida tropicalis у большинства животных, а к Candida albicans - у единичных животных.
Как показали эксперименты, полученное средство обладает выращенной активностью и относительно высокой видовой специфичностью.
Полученное средство может быть использовано как диагностикум для дифференционированного анализа кандидосенсибилизации при периодических медицинских осмотрах лиц, работающих в производстве биомасс кормового назначения, и при решении вопроса о профессиональном характере выявленного у них аллергического заболевания.
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA, включающий выращивание штамма - продуцента в жидкой питательной среде, отделение культуральной жидкости, ее концентрирование с последующей очисткой аллергенсодержащего материала и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Candida tropicalis ВСБ 928, выращивание ведут в режиме циклического культивирования при рН 5,5, насыщении кислородом рО2 не ниже 80% с поддержанием уровня глюкозы в среде 0,6-0,8 мас.%, концентрирование культуральной жидкости осуществляют последовательно на полых волокнах и мембранах с пределами задержания 10 кД, очистку аллергенсодержащего материала проводят ультрафильтрацией на мембране с пределом задержания 300 кД, ультрафильтрат концентрируют, подвергают фракционированию ионнообменной хроматографией на ДЭАЕ-целлюлозе в градиенте концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М, полученные фракции скринируют в аллерготесте в гомологичных и гетерологичных системах и выделяют целевой продукт, представляющий фракцию с максимальной специфической активностью.