Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология, клеточная инженерия. Сущность изобретения: растительные протопласты получают путем инкубации ткани в растворе ферментных препаратов, при этом в качестве пектолитического препарата используют мацеразу С, полученную при микробиологическом синтезе, а в качестве целлюлолитического - целловиридин ГЗх. 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2032740
Класс(ы) патента: C12N5/00, C12N5/04
Номер заявки: 5016755/13
Дата подачи заявки: 08.07.1991
Дата публикации: 10.04.1995
Заявитель(и): Белорусский государственный университет
Автор(ы): Желдакова Р.А.; Шевчик В.Е.; Евтушенков А.Н.; Таманькова А.В.; Прокулевич В.А.; Фомичев Ю.К.
Патентообладатель(и): Белорусский государственный университет
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, биохимии, физиологии растений, клеточной и генетической инженерии, в частности к получению клеточных структур, лишенных клеточной стенки.
Известны способы получения протопластов растений [1,2,3] при которых в качестве мацерирующих ферментов используют препараты Onozuka R-10, Macerozim, Cellulolysin и др. В некоторых случаях [4] возможно совместное использование отечественных (ксиланаза) и импортных препаратов.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ обработки пересадочной культуры растительной ткани для проведения цитометрического контроля и получения протопластов [6] при котором протопласты образуются в смеси с клетками и конгломератами клеток после 4-10 ч инкубирования при 20-30оС и 2-4 ч при 22-26оС (обе стадии с перемешиванием) в количестве 60% от массы.
Недостатком этого способа получения протопластов является то, что они образуются в смеси с клетками, время их получения продолжительно, обработка ферментами проходит в два этапа при высокой концентрации последних. Кроме того, штамм Bacillus macerans, продуцент мацерирующих ферментов, является спорообразующим.
Целью изобретения является упрощение и удешевление способа получения, расширение набора ферментов, пригодных для этой цели, сокращение времени обработки, получение чистой суспензии протопластов.
Цель достигается использованием комплекса пектолитических ферментов (мацераза С), продуцируемых бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5 [5] и обладающего пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностями, с целловиридином ГЗх, в результате чего время обработки растительной ткани в 0,5 М растворе сахарозы сокращается до 3-6 ч, повышается жизнеспособность образующихся протопластов и снижается их гибель.
П р и м е р 1. Листья асептически выращенных растений картофеля нарезали полосками размером 3-5 мм и переносили в раствор следующего состава, мг/л: КН2РО4- 27,2; KNO3 101,0; MgSO4 ˙ 7 H2O 246,0; KJ 0,16; CuSO4 ˙ 5H2O 0,025; CaCl2 -1480,0; сахароза 171000; целловиридин ГЗх 10000; мацераза С 0,03; рН 5,8. Инкубировали 3-6 или 18 ч в темноте при 24-28оС. Результаты выделения протопластов из листьев картофеля приведены в таблице.
П р и м е р 2. Из предварительно вымытых и простерилизованных клубней картофеля вырезали диски размером 3х3 мм, помещали в ферментный раствор следующего состава, мг/л: КН2РО4 - 27,2; KNO3 101,0; MgSO4 ˙ 7H2O 246,0; KJ 0,16; CuSO4 ˙ 5H2O 0,25; CaCl2 1480,0; сахароза 171000; мацераза С 0,03; рН 5,8. Инкубировали 3-18 ч в темноте при 24-28оС. Результаты выделения протопластов приведены в таблице.
П р и м е р 3. Листья 30-дневных растений табака освобождали от нижнего эпидермиса и переносили в ферментный раствор следующего состава, мг/л: KH2PO4 27,2; KNO3 101,0; MgSO4 ˙ 7H2O 246,0; KJ 0,16; SuSO4 ˙ 5H2O 0,025; CaCl2 1480,0; сахароза 171000; мацераза С 0,015; целловиридин ГЗх 5000; рН 5,8. Инкубировали 3-6 ч в темноте при 20-28оС. Результаты выделения протопластов приведены в таблице.
Данный способ обладает следующими преимуществами:
а) возможностью замены импортных ферментных препаратов отечественными (целловиридин ГЗх), а также пектолитическими, продуцируемыми бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5; б) упрощением и удешевлением способа получения за счет сокращения времени обработки растительной ткани до 3-6 ч; проведения процесса при комнатной температуре без перемешивания; в) получением однородной суспензии жизнеспособных протопластов.
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ, включающий обработку растительной ткани комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментных препаратов в растворе 0,5 М сахарозы, отличающийся тем, что в качестве пектолитического ферментного препарата используют препарат мацеразу С, продуцируемую бактериями Erwinia chrysanthemi ENA 49-5, обладающую пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностью, а в качестве целлюлолитического - целловиридин ГЗх.