Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ СУБАЛИН
ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ СУБАЛИН

ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ СУБАЛИН

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: профилактический биопрепарат, желудочно-кишечные заболевания, профилактика, дисбактериоз. Сущность изобретения: профилактический биопрепарат содержит в качестве основы рекомбинантный штамм В. Subtilis ВКПМ В-4759 и характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, антивирусной активностью за счет синтеза интерферона типа α 2, а также способностью индуцировать при пероральном введении животным синтез g -интерферона.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2035185
Класс(ы) патента: A61K35/66
Номер заявки: 5025233/13
Дата подачи заявки: 31.01.1992
Дата публикации: 20.05.1995
Заявитель(и): Институт микробиологии и вирусологии АН Украины; Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научно- производственного объединения "Вектор"
Автор(ы): Смирнов В.В.; Резник С.Р.; Сорокулова И.Б.; Сандахчиев Л.С.; Петренко В.А.; Ильичев А.А.; Белявская В.Н.; Тимофеев И.В.
Патентообладатель(и): Институт микробиологии и вирусологии АН Украины; Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научно- производственного объединения "Вектор"
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития патогенных бактерий и вирусов.
В настоящее время имеются биопрепараты, подавляющие развитие патогенных бактерий лакто-; бифидум-; колибактерин, бификол, бактисубтил, бактерин-СЛ [1-4] Известны также штаммы бацилл, вызывающие синтез эндогенного интерферона [5] однако с невысоким титром продуцируемого интерферона. Однако неизвестны биопрепараты, эффективные при вирусных инфекциях.
Наиболее близким к изобретению является препарат бактерин-СЛ [4] В основе этого биопрепарата две культуры аэробных спорообразующих бактерий В.subtilis и B.licheniformis. Препарат характеризуется высокой эффективностью при дисбактериозах, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, однако не обладает выраженной антивирусной активностью.
Целью изобретения является создание биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностью, а также способностью индуцировать в организме синтез γ -интерферона.
Это достигается тем, что в качестве основы биопрепарата используют рекомбинантный штамм В.subtilis ВКПМ В-4759 (положительное решение по заявке N 4836055/13/063118 от 7.06.90), характеризующийся высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также антивирусной за счет продукции интерферона человека типа α-2.
Рекомбинантный штамм, используемый в качестве основы биопрепарата, должен характеризоваться стабильностью введенной плазмидной ДНК при пассировании культуры через организм. Исследование стабильности плазмидной ДНК в штамме В. subtilis ВКПМ В-4759 проводили на белых мышах массой 18-20 г. В опыт отбирали животных, у которых в предварительных исследованиях не высевались из фекалий бактерий рода Bacillus. Животным вводили перорально по 1 дозе препарата. Через 18 ч проводили высев микрофлоры фекалий на МПА. Выросшие изолированные колонии В.subtilis перекалывали на МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр для подсчета количества клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду. Из культуры, выросшей на МПА, готовили суспензию в физиологическом растворе и вводили повторно животным перорально. Через 18 ч повторяли процедуру выделения В.subtilis и определения количества клонов, утративших плазмиду. Было проведено 10 пассажей культуры через организм.
Из случайно отобранных клонов, полученных после 10 пассажей через организм, выделяли плазмидную ДНК и анализировали с помощью эндонуклеаз рестрикции. Установлено, что плазмидная ДНК стабильно сохраняется и наследуется в течение 10 пассажей через организм животных.
Сохранность гена интерферона человека типа α2 в рекомбинантной плазмиде после пассажей через организм подтверждали методом гибридизации. Фильтры с отпечатками колоний после пассажей гибридизовали с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона типа α 2, выделенным из плазмиды. Установлено, что все клоны, не потерявшие рекомбинантную плазмиду после пассажей через организм, гибридизировались с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона, что свидетельствовало о сохранности гена интерферона типа α 2 в составе плазмиды.
Препарат содержит в качестве основы живые клетки В.subtilis ВКПМ В-4759 и наполнитель, об.
Биомасса В.subtilis ВКПМ В-4759
1 .109 1 .109 живых микробных клеток в 1 мл
физиологического раствора 92-98
Наполнитель 8-2
Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.
В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови, молоко и т. д. предпочтительно сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины).
Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (табл. 1).
Антивирусную активность препарата определяли по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Установлено, что препарат характеризуется антивирусной активностью в отношении ЕМС за счет синтеза интерферона типа α 2, уровень которого составлял 2. 105 5. 105 МЕ/л. Изучали также уровень содержания интерферона в организме мышей, получавших препарат. Для этого препарат вводили перорально мышам 1 раз в день в течение 3 дней из расчета 1 доза/кг веса. Уровень содержания α и γ -интерферона в сыворотке крови мышей исследовали через 24 ч после одно-,двух- и трехразового введения препарата. За титр интерферона принимали величину, обратную разведению исследуемой сыворотки, вызывающему 50% защиты клеток диплоидных фибробластов мыши Л-929 от 100 ЦПД50 тест-вируса ЕМС. Результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что при трехкратном пероральном введении препарата регистрируются максимальные уровни продукции как α -, так и γ -интерферона. Такие уровни содержания интерферона в крови по данным литературы [5] обеспечивают выраженный антивирусный эффект.
Препарат характеризуется безвредностью для животных (табл.3,4).
П р и м е р. На основе штамма В.subtilis ВКПМ В-4759 с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены пять вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата. Вариант I.
Препарат, содержащий, об.
Биомасса В.subtilis ВКПМ
В-4759 0,5. 108 живых микроб-
ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 92
Наполнитель (сыворотка крови КРС) 8 Вариант II
Биомасса В.subtilis ВКПМ
В-4759 1. 109 живых микроб-
ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 94 Наполнитель (молоко) 6 Вариант III.
Биомасса В.subtilis ВКПМ
В-4759 5 .109 живых микроб-
ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 95
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатина) 5 Вариант IV.
Биомасса В.subtilis
ВКПМ В-4759 1 .1010 живых
микробных клеток в 1 мл физиологического раствора 97 Наполнитель (сыворотка крови КРС) 3 Вариант V.
Биомасса В.subtilis ВКПМ
В-4759 5 .1010 живых микроб-
ных клеток в 1 мл физиологи- ческого раствора 98
Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 2
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы, высушивали лиофильно, ампулы запаивали.
Проверяли безвредность полученных вариантов препарата для лабораторных животных, специфическую активность в отношении тест-культур представителей различных групп патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также продукцию интерферона типа α 2.
Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 18-20 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения.
Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37оС в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37оС по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N2 без исследуемой культуры.
Полученные данные результатов испытания вариантов препарата представлены в табл.5.
Оптимальные количества живых микробных клеток В.subtilis ВКПМ В-4759 в 1 мл физиологического раствора составляют 1. 109 1. 1010 клеток при их объемном содержании 92-98% Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмом.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата безвредны для животных, характеризуются антагонистической активностью в отношении тест-культур, а также способностью продуцировать интерферон типа α-2. Поэтому предлагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются.
Формула изобретения: Профилактический биопрепарат, включающий живую биомассу Bacillus Subtilis и наполнитель, отличающийся тем, что он содержит биомассу Bacillus Subtilis ВКПМ В-4759 при следующем соотношении компонентов, об.
Биомасса Bacillus Subtilis ВКПМ В-4759 (1 · 109 1 · 1010 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора) 92 98
Наполнитель 2 8