Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-(A/G) CCGG (T/C)-3`
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-(A/G) CCGG (T/C)-3`

ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-(A/G) CCGG (T/C)-3`

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология. Сущность изобретения: выявление штамма-продуцента Bacillus species, обеспечивающего получение термостабильной эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5ʹ-(A/G) CCGG(T/C)-3ʹ с высоким выходом и активностью фермента. Штамм Bacillus species ВКПМ - В 5941 выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 4000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bse 118 1 является изошизомером рестриктазы Cfr 10 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2037522
Класс(ы) патента: C12N9/14, C12N9/14, C12R1:07
Номер заявки: 5054093/13
Дата подачи заявки: 06.07.1992
Дата публикации: 19.06.1995
Заявитель(и): Репин Владимир Евгеньевич
Автор(ы): Репин Владимир Евгеньевич
Патентообладатель(и): Репин Владимир Евгеньевич
Описание изобретения: Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-(A/G) CCGG (T/C) 3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Bacillus species M. продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5' ACCTGC 3' и 5' TCCGGA 3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5' (A/G)CCGG(T/C)-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Bacillus stearothermophilus, продуциpующий рестриктазу BsrF I (сайт узнавания 5' (A/G)CCGG(T/C) 3') [2]
Недостатком данного штамма является низкий выход эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.
Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Citrobacter freundii, продуцирующий рестриктазу Cfr10 I [3]
Недостатком данного штамма является то, что продуцируемая им рестриктаза является термолабильной. Выход рестриктазы не превышает 300 ед/г сырой биомассы. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5' -(A/G)CCGG(T/C) 3', с высоким выходом и активностью фермента.
Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus specis118 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bse118 l.
Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus species118 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5941, а продуцируемая им рестриктаза названа Bse118 l согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus species118 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8х2-12 мкм, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 60оС, рН 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70оС или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен, растет при концентрации NaCl до 5% 0,002% азида натрия, на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре; устойчив к стрептомицину.
Для культивирования Bacillus species B-5941 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента 4000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл.
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются следующие:
наличие термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку предлагаемый штамм получены впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "Новизна" и "Изобретательский уровень".
Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bst118 I, Cfr10 I и Bse118 I, Cfr10 I представляет идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе, подтверждает их изошизомерию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3'.
Выход фермента Bse118 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60оС. Выход фермента составляет 4000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.
Поскольку рестриктаза Bse118 I имеет сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Cfr10 I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Формула изобретения: Штамм бактерий Bacillus species ВКПМ В-5941 продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5ʹ (A/G) CC GG (T/C) 3ʹ.