Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М. TUBERCULOSIS И М. BOVIS
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М. TUBERCULOSIS И М. BOVIS

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М. TUBERCULOSIS И М. BOVIS

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: ветеринария, медицина. Сущность изобретения: для определения микобактерий туберкулеза в биологической пробе путем посева биологической пробы на твердую питательную среду, инкубации с последующим проведением газохроматографического анализа культуры клеток и регистрацией маркерного вещества используют среду следующего состава, г: KH2PO4 0,9700 1,0300, Na2HPO4 2,4250 2,5750, MgSO4 0,0485 - 0,0515, (NH4)2SO4 0,4850 0,5150, лимоннокислый натрий 0,0970 0,1030, пируват натрия 0,4850 0,5150, лимоннокислое железо 0,0390 0,0410, CuSO4 0,001, малахитовый зеленый 0,001, глицерин 1,94 2,06 мл, агар Дифко 14,5500 15,4500, дистиллированная вода до 1000 мл, а в качестве маркерного вещества пентоказановую кислоту C25:O. 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2042134
Класс(ы) патента: G01N33/49, G01N29/02
Номер заявки: 92000899/13
Дата подачи заявки: 15.10.1992
Дата публикации: 20.08.1995
Заявитель(и): Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ
Автор(ы): Лазовская А.Л.; Рачкова О.Ф.; Фокина Е.И.; Ильина Е.А.
Патентообладатель(и): Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ
Описание изобретения: Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к лабораторным способам идентификации микроорганизмов, и может быть использовано для идентификации микобактерий туберкулеза.
Видовая идентификация штаммов микобактерий туберкулеза необходима для установления источника заболевания, что имеет значение при выборе противотуберкулезных мероприятий в очаге инфекций.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза по культуральным, бактериологическим и биологическим свойствам выделенных штаммов. Однако этот способ продолжителен во времени, недостаточно информативен из-за изменения культуральных, бактериологических и биологических свойств под влиянием различных факторов внешней среды и трудоемок.
Известен также способ определения микобактерий M. bovis, M. tuberculosis путем определения в газохроматографическом спектре жирных кислот, выросших на твердых питательных средах после селективной обработки патологического материала или образцов окружающей среды, соотношения гексакозановой (С26:0) и тетракозановой (С24:0) кислот. Однако клетки M. tuberculosis и M. bovis, выросшие на плотной яичной среде, имеют сходные профили жирных кислот. Видовая идентификация возможна на основе определения соотношения длиноцепочечных кислот, что требует затрат времени и труда.
Цель изобретения повышение специфичности и упрощение способа.
Это достигается тем, что для определения микобактерий туберкулеза в биологической пробе путем посева биологической пробы на твердую питательную среду, инкубации с последующим проведением газохроматографического анализа культуры клеток и регистрацией маркерного вещества, используют среду следующего состава: KH2PO4 0,9700-1,0300 г Na2HPO4 2,4250-2,5750 г MgSO4 0,0485-0,0515 г (NH4)2SO4 0,4850-0,5150 г
Лимоннокислый натрий 0,0970-0,1030 г Пируват натрия 0,4850-0,5150 г
Лимоннокислое железо 0,0390-0,0410 г CuSO4 0,001 г Малахитовый зеленый 0,001 г Агар Дифко (ПА) 14,5500-15,4500 г Глицерин 1,94-2,06 мл Дистиллированная вода До 1000 мл, в качестве маркерного вещества пентикозановую кислоту, при ее отсутствии определяют наличие микобактерий M. bovis, а при ее присутствии наличие микобактерий M. tuberculosis.
П р и м е р 1. Определяют специфичности питательной среды. Используют среду следующего состава: KH2PO4 0,9700 г Na2HPO4 2,4250 г NgSO4 0,0485 г (NH4)2SO4 0,4850 г Лимоннокислый натрий 0,0970 г Пируват натрия 0,4850 г Лимоннокислое железо 0,0390 г CuSO4 0,001 г Малахитовый зеленый 0,001 г Глицерин 1,94 мл Агар Дифко (ПА) 14,5500 г Дистиллированная вода До 1000 мл
Среду стерилизуют кипячением в течение 30 мин на водяной бане, горячей разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Патологический материал засевают на селективную среду Левенштейна-Йенсена, визуально проверяют чистоту культуры и делают мазки с окраской по Цилю-Нильсену. Культуры со среды Левенштейна-Йенсена пересевают на среду в соответствии с изобретением. Штаммы выращивают в течение 2-3 недель при 37оС. Снятую с питательной среды бактериальную массу в количестве 2-5 мг помещают в ампулу, добавляют несколько капель (0,1-0,2 мл) 7% -ного раствора ГТМА в 80%-ном водном метаноле. Запаянные ампулы прогревают при 120-130оС в течение 15-20 мин, в результате проба приобретает вид прозрачного или опалесцирующего раствора.
2-3 мкл анализируемого материала вводят микрошприцом в испаритель газового хроматографа.
Газохроматографический анализ проводят на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Используют две стальные колонки длиной 1,5-2,0 м и диаметром 3 мм. Колонки заполняют целитом-545 (60-80 меш) с нанесенной на него жидкой фазой 7% апиезона 1. Приготовление сорбента и заполнение колонок проводят общепринятыми методами.
Основные рабочие параметры: температура термостата колонок в режиме программирования от 180 до 280оС при скорости нагрева 8оС в 1 мин; температура испарителя 370оС; расход газа-носителя и водорода 2,4 л/ч, воздуха 25 л/ч.
На хроматограммах микобактерий выявляются жирные кислоты с алифатической цепью, содержащей нечетное число атомов углерода. Основным отличительным признаком является наличие пентакозановой кислоты (С25:0). У микобактерий M. bovis пентакозановая кислота отсутствует, а у микобактерий M. tuberculosis присутствует.
П р и м е р 2. Проводят сравнительное изучение специфичности способа видовой идентификации в зависимости от состава среды.
45 штаммов микобактерий туберкулеза выращивают на картофельно-глицериновой среде Павловского с последующим проведением газохроматографического анализа, как в примере 1. Параллельно исследуют те же штаммы. В опыт берут штаммы из коллекции ГИСК им. Тарасевича и свежевыделенные от больных туберкулезом людей и крупного рогатого скота.
Свежевыделенные штаммы идентифицируют с применением культурально-биохимических методов (морфология клеток и колоний, скорость роста при 37оС, наличие роста при 22 и 45оС, наличие роста в среде с салицилатом натрия и с 5% NaCl, наличие ферментов: галактозидазы, уреазы, никотинамидазы, пиразинамидазы, гидролиза Твин-80, арилсульфатазы; редукция нитратов, наличие ниацина. Несколько штаммов идентифицированы до вида с помощью биопробы на кроликах.
Результаты представлены в таблице.
Из таблицы видно полное совпадение результатов биохимических, биологических и газохроматографических исследований, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.
П р и м е р 3. Проводят видовую идентификацию 53 штаммов микобактерий туберкулеза, отобранных из 120 штаммов микобактерий, выделенных на плотных яичных средах из патологического материала от больных людей и животных по результатам газохроматографического анализа жирных кислот известным способом. 53 штамма исследуют, как в примере 1.
Результаты идентификации: в спектре жирных кислот 29 штаммов микобактерий туберкулеза отсутствует пентакозановая кислота, их относят к M. bovis, в спектре жирных кислот 24 штаммов микобактерий туберкулеза присутствует пентакозановая кислота, их относят к M. tuberculosis.
Биохимические исследования чистой культуры подтвердили результаты видовой идентификации способом в соответствии с изобретением.
Проведенные исследования показали, что предложенный способ в соответствии с изобретением отвечает современным требованиям, обладает значительной разрешающей способностью при относительной простоте его осуществления.
Формула изобретения: СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ М TUBERCULOSIS И М BOVIS, включающий посев биологической пробы на твердую питательную среду на основе глицерина, инкубацию посевов с последующим проведением газохроматографического анализа полученной биомассы и идентификацией бактерий по жирным кислотам, отличающийся тем, что посев проводят на питательную среду следующего состава, г/л
KH2PO4 0,9700 1,0300
Na2HPO4 2,4250 2,5750
Mg S O4 0,0485 0,0515
(NH4)2SO4 0,4850 0,5150
Лимоннокислый натрий 0,0970 0,1030
Пируват натрия 0,4850 0,5150
Лимоннокислое железо 0,0390 0,0410
CuSO4 0,001
Малахитовый зеленый 0,001
Агар Дифко (ПА) 14,5500 15,4500
Глицерин 1,94 2,06
Дистиллированная вода До 1,0
из жирных кислот выделяют пентакозановую кислоту и при ее наличии идентифицируют микобактерии M. tuberculosis, а при ее отсутствии - микобактерии M.bovis.