Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО α - СУБЪЕДИНИЦУ РЕЦЕПТОРА АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТА L FA - 1
СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО α - СУБЪЕДИНИЦУ РЕЦЕПТОРА АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТА L FA - 1

СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО α - СУБЪЕДИНИЦУ РЕЦЕПТОРА АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТА L FA - 1

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: клонирование фрагмента ДНК, кодирующего a субъединицу рецептора адгезии лейкоцита LFA-1, осуществляют путем скрининга lgt 10 библиотеки к ДНК, полученной из клеток Н460, индуцированных комплексом форбола и миристиновой кислоты с использованием в качестве зонда 32-мерного олигонуклеотида 5ʹ GGGATGTTGTGGTCA TGGATGGTGGGCTAAT, выделяют клон, гибридизующийся с олигонуклеотидом, получают 5ʹ EcoRI фрагмент размером 1,0kb данного клона, библиотеку кДНК подвергают повторному скринингу с помощью того же зонда и выделяют клон, содержащий дополнительный 5ʹ фрагмент размером 1,0kb. 5 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2051175
Класс(ы) патента: C12N15/12, C07K7/00
Номер заявки: 4614959/13
Дата подачи заявки: 22.08.1989
Дата публикации: 27.12.1995
Заявитель(и): Дана Фарбер Кензер Инститют (US)
Автор(ы): Тимоти Спрингер[US]; Ричард Ларсон[US]
Патентообладатель(и): Дана Фарбер Кензер Инститют (US)
Описание изобретения: Изобретение относится к способу получения молекул рецептора поверхностной адгезии, в частности к способу получения альфа-подъединицы (субъединицы) рецептора адгезии лейкоцита LFA-I или его функционального производного.
Семейство LFA-I молекул рецептора адгезии содержит три высокородственных гликопротеида поверхности клетки. Эти гликопротеиды, как было обнаружено, являются промежуточным звеном во взаимодействиях клетка-клетка при воспалении. Гликопротеиды были названы "LFA-I" (функционально ассоциированный антиген-1 лимфоцита), "Мас-1" и "р150,95". В то же время LFA-I находят на поверхностях большинства лейкоцитов (Springer Т. А. et al. Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)), Мас-1 и р150,95 находят прежде всего на микрофагах, гранулоцитах и других крупных зернистых лимфоцитах (Springer, T. A. et al. Immunol. Rev. 68:111-135 (1982); Keizer, G. et al. Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)).
Семья гликопротеидов LFA-I состоит из гетеродимеров, каждый из которых содержит альфа-подъединицу, которая нековалентно ассоциирована с бета-подъединицей. Альфа-подъединицы этого семейства, как оказалось, отличаются друг от друга и обозначаются СD 11а, CD 11b и CD 11c соответственно. Гликолизированные альфа-подъединицы имеют приблизительные молекулярные веса в 180, 170 и 150 кд соответственно.
Важность семейства LFA-I рецепторов была первоначально признана при исследованиях, которые показали способность моноклональных антител (которые были способны присоединяться либо к специфическим альфа-подъединицам, либо к обычной бета-подъединице) к ингибированию зависимых от адгезии функций лейкоцитов (Sanchez-Madrid, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 79:7489-7493 (1982); Вeller. D. I. et al. J. Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)).
Недавно была идентифицирована группа индивидуумов, которые неспособны проявлять нормальные количества любого члена семейства белка адгезии LFA-I на клеточных поверхностях их лейкоцита. Эта болезнь была названа "Дефицит адгезии лейкоцита" или "ДАЛ" и характеризуется хроническими и возвратными инфекциями, также как и другими клиническими симптомами (Anderson, D. C. et al. Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson. D. C. et al. J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)). Лейкоциты от пациентов с ДАЛ демонстрируют in vitro нарушения, которые были аналогичны нарушениям, отмеченным, когда лейкоциты нормальных индивидуумов испытывали антагонизм со стороны антитела, специфичного для членов семейства LFA-I. Оказалось, что пациенты с ДАЛ были неспособны к нормальной иммунной реакции. Было обнаружено, что это нарушение вызвано неспособностью лейкоцитов пациентов с ДАЛ сцепляться с клеточными и внеклеточными субстратами (Anderson, D. C. et al. Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D. C. et al. J. Infect, Dis 152:668-689 (1985)). Эти исследования показали, что воспалительные реакции смягчаются, когда лейкоциты неспособны сцепляться нормальным образом из-за отсутствия функциональных молекул адгезии на их клеточной поверхности.
Таким образом, способность лейкоцитов поддерживать здоровье и жизнеспособность животного требует, чтобы они были способны сцепляться с другими клетками (такими как эндотелиальные клетки) и белками (такими как iC3b). Оказалось, что эта адгезия требует контактов, которые вовлекают специфичные рецепторные молекулы, присутствующие на лейкоцитарной поверхности лейкоцитов. Эти молекулы рецептора клеточной поверхности оказались высокородственными дpуг другу. Люди, лейкоциты которых не имеют этих молекул рецепторов клеточной поверхности, проявляют хронические и возвратные инфекции, также как и другие клинические симптомы.
Так как адгезия лейкоцитов участвует в процессе, через который чужеродная ткань идентифицируется и отторгается, понимание этого процесса является значительным по своей важности в областях трансплантации органов, пересадки тканей, аллергии и онкологии.
Предлагаемый способ получения альфа-подъединицы LFA-I или его функционального производного содержит этапы:
а) солюбилизация альфа-подъединицы LFA-I из мембран клеток, содержащих альфа-подъединицу LFA-I, для получения препарата растворенной альфа-подъединицы LFA-I;
б) введение препарата с солюбилизационной альфа-подъединицей LFA-I в матрицу сродства, при этом матрица содержит иммобилизованное антитело, способное связывать альфа-подъединицу LFA-I;
в) разрешение альфа-подъединице LFA-I связываться с антителом матрицы сродства;
г) удаление из матрицы любого соединения, неспособного к связыванию с антителом;
д) извлечение подъединицы LFA-I элюированием альфа-подъединицы LFA-I из матрицы.
Молекула альфа-подъединицы LFA-I содержит по крайней мере полипептид, выбранный из группы, состоящей из: а. P-P-R-A-C-P-H; з. G-V-D-V-Q-D-C-E-I-E; б. I-I-T-D-C-E-A; и. D-I-N-G-D-G-L-V-D-V; в. S-W-A-G-G-F-L; к. V-K-D-E-G-D-G-L-A; г. S-Q-V-Q-T-I-H; л. T-Y-L-S-G-L; д. R-H-G-G-L-S-P; м. Y-I-I-C-I-G-K; e. M-S-C-T-D-F-S; н. I-E-G-T-Q-V-L-S-Q; и ж. R-L-L-S-R-A-L; о. P-S-I-H-N-I-P.
Ген альфа-подъединицы LFA-I может быть получен клонированием с помощью известных в данной области методов.
Один такой способ влечет за собой анализ библиотеки челночного вектора вставок сДНК (производных альфа-подъединицы LFA-I, отраженной в клетке) на присутствие вставки, которая содержит ген альфа-подъединицы LFA-I. Такой анализ может быть осуществлен путем переноса клеток с вектором и затем анализом в отношении проявления альфа-подъединицы LFA-I. Предпочтительный способ для клонирования гена альфа-подъединицы LFA-I влечет за собой определение аминокислотной последовательности молекулы альфа-подъединицы LFA-I или триптических пептидов молекулы. Для выполнения этой задачи молекулы альфа-подъединицы LFA-I предпочтительно очищают от клеток продуцента с помощью аффинной хроматографии моноклональных антител и изолируют препаративным гель-электрофорезом с додецилсульфатом натрия полиакриламидным гелем (ДСН-ПААГ) и электроэлюированием (Miller, L. J. et al. J. Immunol. 138:2381-2383Ю (1987), ссылка на которого включена в данном случае в качестве справочного материала). Молекулы альфа-подъединицы фрагментируются как цианбромидом, так и протеaзами, такими как папаин, химотрипсин или трипсин (Oike, J. et al. J. Вiol. Chem. 257:9751-9758 (1982); Liu, C. et al. Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Предпочтительно альфа-подъединица протеолитически усваивается с трипсином. Полученные пептиды отделяются жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с обращенной фазой и подвергаются аминокислотной секвенации. Для выполнения этой задачи белок предпочтительно анализируют на автоматических секвенсерах (секвенaторах). Хотя можно определить полную аминокислотную последовательность альфа-подъединицы LFA-I, предпочитают определять последовательность пептидных фрагментов молекулы. Предпочтительным источником аьфа-подъединицы LFA-I является клеточная линия SKW3.
Последовательность аминокислотных остатков в пептиде в данном случае обозначается либо через применение их обычно применяемых трехбуквенных обозначений, либо с помощью их однобуквенных обозначений. Перечень этих трехбуквенных и однобуквенных обозначений можно найти в руководствах, таких как Biochemistry, Leihninger, A. Orth. Publisher, Bew-York YY (1970). Когда такая последовательность приводится в списке вертикально, аминный конечный остаток предполагается находящимся в верхней части списка, а карбоксильный концевой остаток пептида предполагается находящимся в нижней части списка. Таким же образом, при горизонтальном перечислении aминное окончание предполагается находящимся слева, в то время как карбоксильное окончание предполагается находящимся с правого конца.
Остатки аминокислот в пептиде могут быть отделены черточками. Такие черточки предназначены только для облегчения записи последовательности. В качестве чисто иллюстративного примера аминокислотная последовательность, обозначенная -Gly-Ala-Ser-Phe указывает, что остаток Ala связан с карбоксильной группой Gly и что остаток Ser связан с этой карбоксильной группой остатка Ala и с аминной группой остатка Phe. Это обозначение далее указывает, что аминокислотная последовательность содержит тетрапептид Gly-Ala-Ser-Phe. Это обозначение не предназначено для ограничения аминокислотной последовательности этим одним тетрапептидом, а служит для включения.
1) тетрапептида, имеющего одну или более аминокислот, связанных с его аминным или карбоксильным окончанием;
2) тетрапептида, имеющего один или более аминокислотных остатков, связанных как с его аминным, так и с карбоксильным окончаниями;
3) тетрапептида, не имеющего дополнительных аминокислотных остатков.
Как только подвергали секвенации один или более подходящих фрагментов пептида, то затем анализировали последовательности ДНК, способные кодировать их. Так как генетический код образуется, для кодирования частной аминокислоты может использоваться больше одного кодона (Watson, I. D. In. Mollecular Biology of the Gene, 3rd Ed. W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, CA (1977), рр. 356-357). Фрагменты пептида анализируют для идентификации последовательностей аминокислот, которые могут быть закодированы олигонуклеотидами, имеющими самую низкую степень дегенерации. Это предпочтительно выполняют путем идентификации последовательностей, которые содержат аминокислоты, которые кодируются только одним простым кодоном.
Хотя временами аминокислотные последовательности могут кодироваться только одним олигонуклеотидом, часто аминокислотная последовательность может кодироваться любым из набора подобных олигонуклеотидов. Важно, что в то время как все члены этого набора содержат олигонуклеотиды, которые способны кодировать фрагмент пептида и таким образом потенциально содержат одну и ту же олигонуклеотидную последовательность в виде гена, который кодирует фрагмент пептида, только один член этого набора содержит нуклеотидную последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности этого гена. Так как этот член присутствует в составе набора и способен к гибридизации ДНК даже в присутствии других членов набора, можно использовать нефракционированный набор олигонуклеотидов таким же образом, когда использовали бы единичный олигонуклеотид для клонирования гена, который кодирует этот пептид.
Подходящий олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, который способен кодировать фрагмент гена альфа-подъединица LFA-I (или который является комплектным к такому олигонуклеотиду, или набору олигонуклеотидов), идентифицируется (с использованием вышеописанной процедуры), синтезируется и подвергается гибридизации с помощью хорошо известных в данной области средств на препарат ДНК или, более предпочтительно, с ДНК, производный из клеток человека, которые способны проявлять ген альфа-подъединицы KFA-I. Методика гибридизации нуклеиновой кислоты описана авторами Maniatis, T. et al. (In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbo Laboratories. Cold Spring Harbor, NY (1982) и Haymes. B. D. et al. (In: Nucleic Acid Hybrization, A Practical Approach, 2RL Press, Washington, DC (1985). Источник ДНК или сДНК, который используется, был обращен в отношении последовательностей альфа-подъединицы LFA-I. Такое обогащение может быть наиболее легко достигнуто с помощью сДНК, полученной экстрагированием РНК из клеток, которые производят высокие уровни альфа-подъединицы LFA-I.
Такая методика, как описано выше, или подобная ей обеспечили успешное клонирование генов для альдегид-дегидрогеназы человека (Hsu, L, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771-3775 (1985), фибронектина (Suzuki, S. et al. Eur. Mol. Biol. Organ I. 4:2519-2524 (1985)), гена рецептора эстрогена человека (Walter, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7889-7893 (1985)), активатора плазминогена типа ткани (Pennia, D. et al. Nature 301:214-221 (1983)) и комплементарной ДНК щелочной фосфатазы плаценты в период беременности человека (Кам, N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8715-8719 (1985)).
Используя генетический код (Watson, I. D. In Molecular Biology of the Gene, 3rd, W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park (1977)), может быть идентифицирован один или более различных олигонуклеотидов, каждый из которых был бы способен кодировать триптические пептиды альфа-подъединиц LFA-I. Вероятность истинной последовательности кодирования альфа-подъединицы LFA-I может быть оценена путем рассмотрения анормальных базовых взаимоотношений конъюгации и частоты, с которой в настоящее время используется взятый кодон (для кодирования частной аминокислоты) в эукариотных клетках. Такие правила применения кодонов описаны авторами Lathe, R. et al. J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Используя правила применения кодонов по Лату, идентифицирует одиночный олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, который содержит теоретически наиболее вероятную нуклеотидную последовательность, способную кодировать последовательности триптического пептида альфа-подъединицы LFA-I.
Олигонуклеотид или набор олигонуклеотидов, содержащий теоpетически наиболее вероятную последовательность, способную кодировать фрагменты альфа-подъединиц LFA-I, применяется для идентификации исследовательности комплектарного олигонуклеотида или набора олигонуклеотидов, который способен осуществлять гибридизацию до наиболее вероятной последовательности, или набора последовательностей. Олигонуклеотид, содержащий такую комплементарную последовательность, может быть использован в качестве детектора или идентификации и изолирования гена альфа-подъединицы LFA-I (Maniatis, T. et al. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Таким образом, в итоге настоящая идентификация последовательностей пептида альфа-подъединицы LFA-I позволяет идентификацию теоретически наиболее вероятной последовательности ДНК, или набора таких последовательностей, способных закодировать такой пептид. При построении олигонуклеотида, комплементарного к этой теоретической последовательности (или при построении олигонуклеотидов, комплементарного к набору наиболее вероятных олигонуклеотидов), получают молекулу ДНК (или набор молекул ДНК), способный действовать в качестве детектора для идентификации и изолирования гена альфа-подъединицы LFA-I.
Молекулы одиночного нитевидного олигонуклеотида, комплементарные к наиболее вероятным последовательностям кодирования триптического пептида альфа-подъединицы LFA-I, синтезировали с использованием процедур, которые хорошо известны специалистам в данной области (Belagagie, R. et al. J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979); Maniatis, T. et al. In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nierlich, D. P. et al. Eds. Acad. Press NY (1976); Wu. R. et al. Prog. Nucl. Acid, Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978); Кhorana, R. G. Science 203:614-625 (1979)). В дополнение к этому, синтез ДНК может быть осуществлен путем применения автоматических синтезаторов.
Можно клонировать ген альфа-подъединица LFA-I из препаратов эукаристной ДНК, содержащие, как предполагается, этот ген. Для идентификации и клонирования гена, который кодирует белок альфа-подъединицы LFA-I, перебирают библиотеку ДНК или предпочтительно сДНК на ее способность осуществлять гибридизацию с вышеописанными детекторами олигонуклеотидов. Подходящие препараты ДНК (такие как ДНК генома человека) расщепляют с помощью энзимов или фрагментируют неудачу и связывают в рекомбинантные векторы. Способность этих рекомбинантных векторов осуществлять гибридизацию с вышеописанными детекторами олигонуклеотидов затем измеряется. Процедуры гибридизации описаны, например, автором Maniatis, T. Molecular Cloning A Labolatory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) или авторами Haymes, B. T. et al. Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach IRL, Press. Oxford, England (1985). Векторы, оказавшиеся способными на такую гибридизацию, затем анализируют для определения протяженности и природы последовательностей альфа-подъединицы LFA-I, которые они содержат. На основе чисто статистических анализов такой ген, который кодирует молекулу альфа-подъединицы LFA-I, мог бы быть идентифицирован недвусмысленно (с помощью скрининга гибридизации) с использованием детектора олигонуклеотида, имеющего только 18 нуклеотидов.
Клонированный ген альфа-подъединицы LFA-I, полученный по вышеописанному способу, может быть в действии связан с вектором экспрессии и вводится в прокариотные или эукариотные клетки для получения белка альфа-подъединицы LFA-I. Техника таких манипуляций описана авторами выше и хорошо известна в данной области.
Путем опеpационного связывания последовательности сДНК, кодирующей альфа-подъединицу молекулы LFA-I (или фрагмента этой последовательности), с функциональным промотором можно управлять экспрессией альфа-подъединицы LFA-I (или его функционального производного) в клетке или организме.
Молекулу нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, называют "способной к экспрессии" полипептида, если он содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат транскрипторную и трансляционную регуляционные информации, и такие последовательности операционно связываются с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют этот полипептид. Операционное связывание представляет собой сцепление, при котором последовательности регуляторной ДНК и та последовательность ДНК, которую требуется проявить, связаны таким образом, чтобы позволить экспрессию гена. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии гена, может меняться от организма к организму, однако обычно будет включать область промотора, которая в прокариотах содержит как промотор (который управляет началом транскрипции РКН), так и последовательности ДНК, которые, когда они транскрибированы в РНК, будут сигнализировать о начале синтеза протеина. Регуляторные области в клетках эукариста обычно будут включать область промотора, достаточную для управления началом синтеза РНК.
Две последовательности ДНК (такие как последовательность области промотора и последовательность кодирования альфа-подъединицы LFA-I) операционно сцеплены, если природа сцепления между обеими последовательностями ДНК
1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки считывания;
2) не нарушает способности последовательности области промотора к управлению транскрипцией последовательности кодирования альфа-подъединицы LFA-I;
3) не нарушает способность последовательности кодирования альфа-подъединицы LFA-I к транскрипции с помощью последовательности области промотора.
Таким образом, область промотора будет операционно связана с последовательностью ДНК, если промотор способен к осуществлению транскрипции этой последовательности ДНК.
Настоящее изобретение включает экспрессию альфа-подъединицы LFA-I (или его функционального производного) в клетках прокариота или эукариота. Для экспрессии альфа-подъединицы LFA-I (или его функционального производного) в клетке прокариота (такого, как например Е. Coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces и т. д.) необходимо операционным путем связывать последовательность кодирования альфа-подъединицы LFA-I с функциональным промотором прокариота. Такие промоторы могут быть либо составными элементами, либо, более предпочтительно, регуляционными (т. е. индицируемыми или депрессируемыми). Примеры составных промоторов включают промотор бактериофага λ промотор bla гена β -лактамазы рВР322, и промотор САТ гена хлорамфениколацетилтрансферазы рРР325, и т. д. Примеры индуцируемых прокариотных промоторов включают в себя большинство правых и левых промоторов бактериофага (РL и Рр), промоторы trp, rec A, Lac Z, Lac L и gal E. coli α-амилазу (Ulman, I. et al. J. Bacteriol 162: 176-182 (1985)) и σ-28 специфичные промоторы В. subtilis (Gilman, M. Z. et al. Gene 32:11-20 (1984)), промоторы бактериофагов Bacilli (Gryczan, T. I. In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc. NY, (1982)), и промоторы Streptomyces (Ward, J. M. et al. Mol. Gen. Genet 203: 468-478 (1986)). Промоторы прокариота рассмотрены авторами Glick, B. R. (J. Ind. Microbiol 1: 277-282 (1987); Сenatiempo, Y. (Biochimie 68:505-516 (1986)); и Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)).
Должная экспрессия в прокариотной клетке требует присутствия участка связывания рибосом выше последовательности, кодирующей ген. Такие участки связывания рибосом описаны, например, авторами Gold, L. et al. (Ann. Rev. Microbiol 35:365-404 (1981)).
Если требуется экспрессия в клетке эукариота, такой как дрожжи, грибы, клетки млекопитающих или клетки растений, тогда должно быть необходимо использовать промотор, способный управлять транскрипцией в таком эукариоте-хозяине. Предпочтительные промоторы эукариота включают промотор гена металлотиониена 1 мыши (Hamer, D. et al. J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); промотор ТК Неrpes Virus (Mc Knight. S. cell 31:355-365 (1982)); ранний промотор SV40 (Benoist, C. et al. Nature (London) 290:304-310 (1981)); промотор гена ga 14 дрожжей (Johnsonm S. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 79: 6971-6975 (1982); Silver, P. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955 (1984)).
Как широко известно, трансляция мРНК начинается на кодоне, который кодирует первый метионин. По этой причине предпочтительно обеспечить, чтобы cвязь между промотором эукариота и последовательностью ДНК, которая кодирует альфа-подъединицу LFA-I (или его функциональную производную), не содержала никаких вмешивающихся кодонов, которые способны закодировать метионин (т. е. AUG). Присутствие таких кодонов приводит либо к образованию белка слияния (если кодон АUG находится в той же самой считывающей рамке, что и последовательность ДНК, кодирующая LFA-I), либо в мутации со сдвигом рамки считывания (если кодон AUG не находится в той же самой считывающей рамке, что и кодирующая исследовательность LFA-I).
Последовательность ДНК, которая кодирует белок LFA-I (или его функциональное производное), при операционном связывании с функциональным промотором предпочтительно вводится в клетку-реципиент любым путем из ряда пригодных: трансформация, трансфекция, конъюгация, слияние протопласта, электропорация и т. д.
Последовательность, кодирующая альфа-подъединицу LFA-I, и операционно сцепленный промотор могут быть введены в клетку-реципиент либо как невоспроизводящая ДНК (или РНК) молекула, которая может быть линейной молекулой, либо, более предпочтительно, замкнутой ковалентной кольцевой молекулой. Так как такие молекулы неспособны на автономную репликацию, экспрессия полипептида альфа-подъединицы LFA-I может произойти через транзисторную экспрессию введенной последовательности. В качестве альтернативы постоянная экспрессия может произойти через интегрирование введенной последовательности в хромосому-хозяина.
Предпочтительно введенная последовательность будет включена в плазмиду или вектор вируса, способный на автономную репликацию в хозяине-реципиенте. Любой из широкого разнообразия векторов может быть использован для этой цели. Важные факторы для выбора особой плазмиды или вектор вируса включают: легкость, с которой клетки реципиента, которые содержат вектор, могут быть опознаны и выбраны из тех клеток реципиента, которые не содержат этот вектор; число копий этого вектора, которое требуется в конкретном хозяине; и требуется ли иметь возможность челночного перемещения вектора между клетками хозяина различных видов. Предпочтительные прокариотные векторы включают плазмиды, такие как плазмиды, способные к репликации в Е. соli (такие как, например, рВR322, Col El, p. SC 101 рАСУС 184, пvх. Такие плазмиды, например, описаны авторами Maniatis, T. et al. (In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Плазмиды Bacillus включают рС194, рС221, рТ127 и т. д. Такие плазмиды описаны автором Gryczan, T. (In the Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), рр. 307-329). Подходящие плазмиды Streptomyces включают рIJ101 (Kendall K. J. et al. J. Bacteriol 169:4177-4183 (1987)), и бактериофаги Streptomyces, такие как фС31 (Сhater, K. F. et al. In: Sixth Inernational Symposium on Actynomyceteles Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungry (1986), рр. 45-54). Плазмиды Pseudomonas рассмотрены авторами John, J. F. et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), и Izaki, K. (Ipn. J. Bacteriol 33: 729-742 (1978)).
Предпочтительные плазмиды эукариот включают ВРV, вакцинию, SV 40, 2-микронный круг и т. д. или их производные. Такие плазмиды хорошо известны в данной области техники (Betstein, D. et al. Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, J. R. In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Life Cycle and Inturitance. Cold Spring Harbor; NY, р. 445-470 (1981); Broach, J. R. Cell 28:203-204 (1982); Bollon, D. P. et al. J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, T. In: Cell Biology: A Comprehensive Theatise, Vol. 3, Gene Expression, Acfdemic Press. NY. рр. 563-608 (1980)).
Как здесь используется, функциональное производное альфа-подъединицы LFA-I представляет собой соединение, которое обладает биологической активностью (функциональной или структурной), которая практически подобна биологической активности альфа-подъединицы LFA-I. Примеры биологической активности включают в себя способность связываться с ICAM-I, другим природным лигандом молекулы LFA-I, или с бета-подъединицей семьи LFA-I гликопротеидов. Такое связывание ингибировало бы относящиеся к адгезии случаи, такие как прикрепление лимфоцита к эндотелиальным клеткам, антиген-представляющим клеткам или клеткам-мишеням. Молекулу называют практически подобной другой молекуле, или обе молекулы обладают подобной биологической активностью. Функциональные производные альфа-подъединицы LFA-I включают как фрагменты, так и варианты альфа-подъединицы LFA-I. Выражение "фрагмент альфа-подъединицы LFA-I" считается относящимся к любому поднабору полипептидов этой молекулы. Выражение "вариант альфа-подъединицы LFA-I" считается относящимся к молекуле, практически подобной по структуре либо целой молекуле, либо ее фрагменту, при условии, что "вариант" имеет по крайней мере одну биологическую активность, которая либо подобна активности альфа-подъединицы LFA-I, либо ингибирующей по отношению к активности LFA-I. Таким образом, при условии, что молекула обладает по крайней мере одной биологической активностью, которая либо подобна активности LFA-I, либо ингибирует такую активность, она рассматривается как "вариант" альфа-подъединицы LFA-I, как это выражение используется в данном случае, даже если одна из молекул содержит одну или более аминокислот, не найденных в другой, или если последовательности аминокислотных остатков в обеих молекулах неидентичны. Таким образом, например, соединение, в котором отсутствует (или содержится) один или более аминокислотных остатков, найденных (или не найденных) в альфа-подъединице LFA-I рассматривалось бы как вариант альфа-подъединицы LFA-I, если бы это соединение обладало биологической активностью, подобной (или ингибирующей к) биологической активности альфа-подъединицы LFA-I. Выражение "биологическая активность" предполагается заключающим в себе каталитическую, так и структурную активности (т. е. способность связываться с другой молекулой, такой как ICAM-I, другой природный лиганд молекулы LFA-I, бета-подъединицы LFA-I или антитело LFA-I анти-альфа-подъединицы) и т. д.
Для получения функциональных производных альфа-подъединицы молекулы LFA-I необходимо только осуществить мутагенез ДНК, РНК или (более предпочтительно) последовательность сДНК, которая кодирует альфа-подъединицу LFA-I. Мутагенез может быть либо случайным, либо специфичным к участку. Кроме того, мутагенез может быть либо спонтанным, либо индуцированным, с применением химической радиоактивной или рекомбинантной методики.
На фиг. 1 показан профиль разделения ЖХВД с обращенной фазой триптических пептидов альфа-подъединицы LFA-I. Элюирование управлялось через оптическую плотность на 280 нм (нижний профиль) и на 214 нм (верхний профиль). Пептиды, обозначенные пятном, были подвергнуты микросеквентации белков. Линия поперек профиля указывает на процентную величину ацетонитрила.
На фиг. 2 показана карта ограничения клонов сДНК альфа-подъединицы LFA-I. Участки ограничения это Bal I (BI), Bam HI (B), Bgl II (BO), Cla I (C), Eco RI (R), Hinc II (H), Hru I (N), Pst I (P), Sca I (Sc) и Sma I (S). Показаны стрелки, указывающие на стратегию секвенации.
На фиг. 3 показан нуклеотид и производная аминокислотная последовательность альфа-подъединицы LFA-I. Последовательности триптических пептидов и трансмембранная область подчеркнуты соответственно толстой и теневой линиями. Предполагаемые участки фосфорилирования серина обведены кружком. Нуклеотиды в нетранслированной 3'-й области, которые подчеркнуты, соответствуют последовательности Alu I.
На фиг. 4 показано построение в линию внутренних дубликаций альфа-подъединицы LFA-I. Последовательность, расположенная по бокам согласованной зоны, показана над расположенными в линию дупликациями, в то время как двухвалентный связывающий участок согласованной зоны и предварительно описанные участки для связывания показаны внизу. Звездочка указывает, что в связывании катиона участвует свыше одного атома кислорода.
На фиг. 5 показано расположение в линию альфа-подъединицы LFA-I человека с другими членами семьи супергена интегрина и N-окончание альфа-подъединицы LFA-I мышей. Остатки, общие для LFA-I и для по крайней мере одного интегрина, взяты в рамку. Область вставки лейкоцита значительна. Связи гомологичных дупликаций, содержащие участки для связывания двухвалентных катионов, показаны треугольниками. Участок дробления протеазы в альфа-подъединицах рецептора ЕСМ указан со скобками. Трансмембранная область подчеркнута.
П р и м е р 1. Очистка альфа-подъединицы LFA-I. LFA-I выражается на поверхностях лимфоцитов SKW3. Молекула альфа-подъединицы LFA-I очищалась из клеток с помощью аффинной хроматографии моноклонального антитела. Моноклональное антитело ТS 1/22, которое направлено против альфа-подъединицы LFA-I, очищали и соединяли (с использованием цианбромида) с СL-4BS Sepharose (Pharmacia) при 2 мг моноклонального антитела на 1 мл упакованного слоя. Клетки SKW3 (42,2 г) полученные из коллекции культур MIT, лизировали в 300 мл буфера лизиса (Kurzinger, K. et al. J. Biol. Chem. 257:12412-12418 (1982)) и затем лизат вращали при 16 000 х g в течение 2 ч. Затем всплывшее вещество последовательно пропускали через предварительную колонку активированной и резко охлажденной СL-4ВS Sepharose, а потом через колонку с ТS 1/22 Sepharose. Колонку NS 1/22 последовательно промывали (Kuzinger, K, et al. J. Biol. Chem. 257:12412-12418 (1982), и элюировали альфа-подъединицу LFA-I с 50 мМ триэтиламина, 0,5 М NaCl, 0,1% Triton Х-100, 1 мМ, иодацетамида, 10 ед/мл апротинина и 0,025% NaN3, рН 11,5, а затем рН немедленно нейтрализовали. Фракции, содержащие альфа-подъединицу LFA-I, собирали, подвергали лиофилизации и осаждали в 5 объемах этанола при -20оС на всю ночь.
Очищенный белок разбавляли, алкилировали (Law, S. K. A. et al. EMBO J. 6:915-919 (1987)) и подвергали препаративному гель-электрофорезу с додецилсульфатом натрия полиакриламидным гелем. Полоса, соответствующая альфа-подъединице LFA-I, подвергалась визуализации с помощью IM KCI, отрезалась и подвергалась электроэлюированию (Pellegrino, M. A. et al. Cein Immunol. Immunopath. 3:324-333 (1975)). Очищенную альфа-подъединицу лиофилизировали и осаждали в 4 объемах этанола при -20оС всю ночь. Гранулы осадка вновь переводили в суспензию и обрабатывали 1%-ным трипсином (Wong, W. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:7711-7715 (1985)).
Триптические фрагменты затем изолировали с помощью ЖХВД (Bekman) на колонке с обращенной фазой С4 (Vydac). Пептиды элюировали на 0-60%-ном градиенте ацетонитрила в 1% трифторуксусной кислоты. Повторно хроматографировали изокритически несколько пиков в концентрации ацетонитрила, определяемой следующим уравнением:
F (0,9E) 2,
где F обозначает объемный процент ацетонитрила в иократических условиях для пептида, который элюировали при проценте Е при линейном градиенте (Lathe, R. et al. J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)). Пики собирали в 1,5-миллиметровые полипропиленовые пробирки и концентрировали до менее чем 50 мкл. Восемь пиков подвергали микросеквенации. Последовательность одного пептида, L64, использовали для синтеза простого олигонуклеотида согласно информации авторов Lathe, R. et al. (J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)): 5'-GGGATGTTGTGGTCATGGATGGTGGGGTCAAT-3'.
В общем, LFA-I вначале изолировали из SKW3, клеточной лини Т лимфома, в виде лизата с помощью аффинной хроматографии моноклонального антитела с использованием антитела, направленного против альфа-подъединицы. Фракции додецилсульфата натрия полиакриламидного геля после гельэлектрофореза проявляли альфа- и бэта-подъединицы. Альфа-подъединицу затем очищали препаративным гельэлектрофорезом с додецилсульфатом натрия и полиакриламидным гелем, а очищенную альфа-подединицу обрабатывали трипсином, после чего пептиды изолировали с помощью ЖХВД с обращенной фазой. Последовательность пептида из девяти пиков определяли с помощью микросеквенации (фиг. 1). Последовательность пептида, которая имела самую низкую избыточность кодона, использовали для определения последовательности единичного олигонуклеотида, в которой использовались обычно встречающиеся кодоны человека (Lathe, R. el al. J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)). Последовательности триптических пептидов альфа-подъединицы LFA-I показаны в таблице.
П р и м е р 2. Клонирование сДНК.
Рекомбинанты (5 ˙ 105) из λgt 10 библиотеки, выбранные в отношении вставок сДНК, превышающих 3 кб и произведенные из ФМК (форбол-миристиновая кислота)-индицированных клеток Н 60 (Corbi, A. et al. EMBO I. 6:4023-4028 (1987)), высеивали на чашки при плотности 50000 рекомбинантов на чашку в 150 мм. Библиотеку увеличивали (Woo, S. L. C. Met, Enzymol, 68:389-395 1979)), и фильтры из нитроцеллюлозы обрабатывали согласно информации авторов Benton и Davis (Benton, W. D. et al. Science 196:180-182 (1977)). Фильтры подвергали предварительной гибридизации в 6 x SSC (0,6 M NaCl, 0,06 М цитрата натрия), 0,05% натрийфосфата и натрийпирофосфата, 0,5% додецилсульфата натрия, 1 x Denhardt и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося в течение ночи при 42оС. Единичная последовательность олигонуклеотида (последовательность показана выше) была помещена с помощью γ-32р-АТР c использованием полинуклеотидкиназы. Фильтры гибридизировали на всю ночь в буфере предварительной гибридизации при 42оС и затем последовательно промывали в 6 x SSC, 0,05% натрийпирофосфата в течение 15 мин при 50оС. Фильтры экспонировали на предварительно кратковременно засвеченную ХАР-5 плетку от 6 до 20 ч. Фаги, которые дали сигналы на сдвоенных фильтрах, очищали от тромбоцитов. Их вставки сДНК измерялись по размерам электрофорезом на агарозном геле.
Образец олигонуклеотида с 32 мономерными звеньями использовали для изолирования двадцати клонов из библиотеки сДНК λgt 10, выбранной по размерам, составленной из ФМК-стимулированных клеток спинного мозга (Corbi, A. et al. EMBO J. 6:4023-4028 (1977)). Эти клетки предварительно демонстрировали, что синтезируют альфа-подъединицу LFA-I (Miller, L. I. et al. I. Immynol. 139: 842-847 (1987)). Размер вставок определяли, и подвергали рестрикционному картированию самый длинный клон, λ 5L5 (фиг. 2). Этот клон содержал последовательность нуклеотида, соответствующую олигонуклеотидному образцу (85% идентичность наилучшему предлагаемому образцу). Последовательность нуклеотида также кодировала триптический пептид, который определяли микросеквенацией (16 из 16 остатков) и который включая образец олигонуклеотида и простирался за его пределы. Однако этот клон не кодировал весь белок, так как в отрытой решетке считывания присутствовали не все последовательности триптического пептида. Фрагмент EcoRI 5' 1,0 кb от λ 5L 5 использовали для повторного скрининга других 5 x 105 рекомбинантов. Дополнительные 14 клонов идентифицировали, и клон λ3RI имел идентичную карту рестрикции в перекpывающихся областях и содержал дополнительный фрагмент 1,0 кb 5'. Нуклеотидную последовательность этого дополнительного фрагмента определяли (фиг. 2).
П р и м е р 3. Картирование рестрикции и секвенация нуклеотида.
Карты рестрикции отобранных клонов определяли с помощью дваоных и частичных резюме (Maniatis, T. et al. (In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1982)). Фрагменты рекстрикции подвергали субклонированию либо в М13m р18 и М13m р 19 (Messing, J. Met. Enzymol. 101:20-78 (1983)), либо в рGEM-3Z, 4Z или 7Z (Promega). Уничтожение фрагментов в рCEM осуществляли с использованием Экзонуклеазы III и SI (Henikoff, S. Gene 28:351-359 (1984)). Секвенация представляла собой метод обрыва цепи дидеокси (Sanger, F. el. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 74: 5463-5467 (1977)). Последовательность кодирования, нетранслированные области 5' и 3' определяли в 100; 83,1 и 33,7% в обеих ориентациях соответственно.
Клоны перекрытия сДНК содержали 5139 нуклеотидов (фиг. 3). Имеется открытая рамка считывания из 3510 нуклеотидов, нетранслированная область 5' и 94 нуклеотидов и нетранслированная область 3' из 1536 нуклеотидов, которая содержит участок полиаденилирования 15 нуклеотидов перед поли (А+) хвостовой частью. Внутри нетранслированной области 3' имеется типичная дубликация AluI, состоящая из двух тандем-связанных последовательностей, каждая из которых заканчивается изобилующим А сегментом (Hardman, N. Biochem. I. 234:1-11 (1986)). Последовательность ALu имеет длину в 304 нуклеотида и идентична на 78,8% обычной последовательности семьи Alu.
П р и м е р 4. Южное и Северное пятно.
Южное пятно было получено так, как описано авторами Corbi, A. et al. (J. Exper. Med. 167:1597-1607 (1988)). Электрофорезу подвергали 20 мкг/мл общей клеточной РНК, выделенной из клеток SKW 3, U 937, IB4 или ЕJ, на 1,0%-ном формальдегидном геле и переносили на нитроцеллюлозу (B: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York).
Нейлоновую мембpану (образец Zeta (Bioard)) подвергали предварительной гибридизации в 2 x SSC, 1 x раствор Денхардта, 0,1% додецилсульфата натрия и 10 мкг/мл ДНК спермы сельди. Образец Eco RI 1,8 кb из окончания 5' клона с ДНК, λ3RI, был помечен путем переноса метки и использовался как датчик.
Северное пятно в результате анализа проявило сообщение в 5,5 кb в SKW3, U 937 и клетках IB4, но сигнал не детектировался в клетках EJ. Распределение клеток находится в хорошем соответствии с размером клона сДНК и проявлением клеточной поверхности LFA-I. Анализ южного пятна с использованием фрагмента EcoRI-Bam HI с 1,2 кb 5' из клона λ2L 2 давал гибридизацию до двух фрагментов по 10 и 8 кb (Corbi, A. et al. J. Exp. Med. 167:1597-1607 (1988)). Клон генома, изолизованный из библиотеки косиидов, имеет эти два фрагмента идентичной длины. Эти фрагменты являются смежными и свидетельствуют о том, что LFA-I представляет собой единичный копировальный ген.
П р и м е р 5. Анализ с помощью компьютера.
Поиски гомологии и выравнивание последовательностей. Вначале использовали программу Microgenie ДНК (Beckman), FASTP (Wilber abd Sigman) на NBRF и NEN базах данных (National Biomedical Research Foundation, Washington DC) и FASTP с использованием базы данных SWISS-PROT (Bionet). Эти построения в линию затем оптимизировали с применением ALIGN (NBRF) (5585) и GENALIGN (Bionet).
Гидрофобность определяли с использованием программы Microgenie ДНК, также как и PEP-P L OT (5792) (Компьютерная группа Генетики Университета Висконсина). Анализ гидрофобности аминокислотной последовательности продемонстрировал, что альфа-подъединица LFA-I представляет собой типичный трансмембранный белок с последовательностью сигнала гидрофобности, экстраклеточным доменом, простой гидрофобной трансмембранной областью и короткой цитоплазмической хвостовой частью. N-терминальный остаток LFA-I человека идентифицировали по гомологии с N-терминалом мышиной LFA-I имеет 55%-ную идентичность с мышами LFA-I на первых 30 аминокислотах. Классический сигнальный пептид с последовательностью согласованной зоны (Ala-X-Ser/Pro) для пептидазы дробления предшествует N-терминальной последовательности. Имеется три предлагаемых участка инициирования транскрипции вверх по потоку (АТС) в рамке. Применение первого участка стимуляции в позиции 89 нуклеотида обычно является предпочтительным (Kozak, M. Nucl. Acid Res. 12:857-872 (1984)) и дает сигнальную последовательность с двадцатью пятью остатками, с несколькими полярными группами вблизи от N-терминальных остатков, что обычно находят в сигнальных последовательностях (Von. Heijne, G. J. Molec. Biol. 173:243-251 (1984)). Все 117 аминокислот, определенные микросеквенацией триптических пептидов, были найдены в транслированной открытой рамке считывания, подтверждая аутентичность клонов сДНК. Взятые вместе, эти находки свидетельствуют о том, что альфа-подъединица LFA-I имеет сигнальную последовательность аминокислоты 29 + N-терминального типа, экстраклеточный домен из 1063 остатков, трансмембранный домен из 29 аминокислот и С-терминальную цитоплазматическую хвостовую часть из 53 аминокислот.
Семь дупликаций из 49-63 аминокислот находятся в пределах экстраклеточного домена. Степень внутренней идентичности и статической значимости среди этих внутренних дупликаций является наивысшей среди последних трех дупликаций, 24-33% с р < 10-2 до <10>-6. Центральная область этих трех последних дупликаций имеет соответствие с несколькими двухвалентными катионными участками связывания (фиг. 4). Предшествующие исследования показали, что Mg 2+ с самого начала или при более низкой концентрации в сочетании с Са2+ необходим для функциональной целостности белка. (Rothlein, R. et al. J. Exper. Mеd. 163: 1132-1149 (1986)). Гомология этих трех тандемных дупликаций с участками связывания двухвалентного катиона свидетельствует о том, что LFA-I связывает двухвалентные катионы. Дупликации I-IV не имеют участка связывания двухвалентного катиона согласованного типа, а сохранили расположение по бокам области. Эти структурные аналогии создают возможность того, что эти дупликации увеличиваются при событии удвоения.
Зрелый белок имеет Мг 126,193, и двенадцать N-связанных участков гликозилирования (Asn-X-Thr/Ser) размещены в экстраклеточном домене. Предшествующие исследования показали, что по крайней мере пять из этих участков гликолизировали и имеют олигосахариды с Мг 5000-10000 Да, что типично для комплексного N-связанного карбогидрата (Dahms, N. M. J. Immunol. 134:3978-3986 (1985)). Поэтому применение 5-10 из этих участков гликолизирования предсказывало бы молекулярный вес, согласованный с молекулярным весом, как определено электрофорезом с додецилсульфатом натрия полиакриламидным гелем.
Определение N-терминала мышиного LFA-I (Girma, J.-P. et al. Blood 70: 605-611 (1987)) и первичная структура обычной бета-подъединицы р15,95 LFA-I (Мас-I) показали, что альфа-подъединица LFA-I является членом надсемейства интегрина. Альфа-подъединица LFA-I имеет удивительную гомологию (35%-ная идентичность) с альфа-подъединицами р150,95 и Мас-I в меньшей степени с альфа-подъединицами рецепторов ЕСМ (идентичность 25%). С другой стороны, FNR, VNP и IIb идентичны на 40% В дополнение к этому, интегрины лейкоцитов также содержат вставку из примерно 200 аминокислот вблизи N-терминальной области белка, которая не присутствует во всех трех рецепторах ЕСМ с секвенацией (фиг. 5). Кроме того, область, в которой происходит участок расщепления протеазы в VNR, FNR и gp IIb/IIIa, отсутствует в LFA-I, также как и альфа-подъединицы р150,95 и Мас-I, и коррелирует с отсутствием протеолитической обработки альфа-подъединиц LFA-I. Как целое эти структурные признаки определяют два подсемейства интегринов альфа-подъединицы, интегринов лейкоцитов и интегринов ЕСМ.
Все альфа-подъединицы семейства интегрина имеют тандемные дупликации, подобные LFA-I, которые содержат предполагаемые участки связывания двухвалентного катиона (Corbi, A. et al. EMBO J. 6:4023-4028 (1987), Ponz, M. et al. J. Biol. Chem. 262:8476-8482 (1987), Suzuki, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 8614-8618 (1986), Argaves, W. S. et al. J. Cеll Biol. 105: 1183-1190 (1987), Ruoslanti, E. et al. Science 238:491-497 (1987)). Однако только три этих дупликаций в LFA-I и р150 содержат предлагаемые участки связывания металла, в то время как все четыре из этих дупликаций в рецепторах ЕСМ содержат участки связывания металла. Предполагаемые участки связывания двухвалентного катиона LFA-I и другие интегрины являются родственными, но не идентичными предварительно описанным участкам связывания двухвалентных катионов неотъемлемых белков мембран. Существует несколько типов участков связывания двухвалентных катионов. Первый набор участков имеет чередующуюся структуру D-X-D(N)-X-D-(N). Эти участки обнаружены в Тропонине С, парвальбумине (5256) и белке связывания галактозы среди других. Эти участки образуют структуру петли ЕГ и имеют 6-7 участков хелатообразования. Предлагаемые участки связывания на LFA-I и другие интегрины также имеют первичную структуру D-X-D(N)-X-D(N) с числом С остатков между хелатирующими остатками, которые сохраняются. Однако остаток в положении заменяется гидрофобным остатком. Кроме того, винтовая альфа-спираль до и после участка связывания кальция оказывается отсутствующей на участках интегрина (Сorbi, A. et al. EMBO J. 6: 4023-4028 (1987)). Значение этого изменения неизвестно, однако может частично объясняться предпочтительностью этих участков в Мо2+.
Поиск в банках данных NBRF и Swiss-Protein показал, что этот специфический домен семейства LFA-I, на который мы будем ссылаться как домен L, имеет значительную гомологию с доменом AIVWF человека, фактором комплемента человека В и с белком матрицы коллагена цыпленка. Эти аналоги простираются по всей длине домена. Так как VWF имеет три домена дупликации А (А1, А2, А3) (5790), домен в факторе В комплемента аналогичен подобному домену в компоненте 2 комплемента (С2) (5789), а СМР имеет две дупликации (5778), домен LFA-I сравнивали со всеми этими доменами с использованием программы ALIGN. За исключением С2, все эти линейные ряды были статистически значимыми.
Эти сходства подразумевают возможный функциональный домен для LFA-I. Во-первых, домен А1 из VWF связывается с гликопротеином 1 и гепарином (5646), в то время как домены А1 и А3 участвуют в связывании с коллагеном. Во-вторых, гомологический домен в факторе В размещен на С-терминальной стороне участка расщепления, в котором фактор В расщепляется до фактора Во, и на N-терминальной стороне серинпротеазы (Mole, I. E. et al. J. Biol. Chem. 259: 3407-3412 (1984), Bently, D. R. Biochem. J. 239:339-345 (1986)). Этот домен поэтому находится в области, которая, как ожидалoсь бы, взаимодействует со своим лигандом, С3. Структура белка матрицы коллагена частично была определена и имеет две дупликации, разделенные последовательностью типа фактора эпидермального роста (Argaves, W. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 464-468 (1987)). СМР взаимодействует с коллагеном (Argaves, W. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:464-468 (1987)) и с протеогликаном хряща (Paulisson. M. et al. Collagen Rev. Res. 4:219-229 (1984)). LFA-I. Мас-I и р150,95 недавно были локализованы в хромосоме 16рII (Сorbi, A. et al. J. Exper. Med. 167:1597-1607 (1988)). Структурное подобие и близкость генов, кодирующих альфа-подъединицы интегрина лейкоцита, свидетельствуют о том, что примордиальный ген воспроизводился и приводил к созданию по крайней мере двух ветвей альфа-подъединиц интегрина, интегринов лейкоцита и интегринов ЕСМ. Домен со 180 аминокислотами оказался вставленным в примордиальный ген альфа-подъединицы интегрина лейкоцита и затем воспроизводился ген, который приводил к получению LFA-I, Мас-I, и р150,95. Подобие этих доменов домену L семейства LFA-I свидетельствует о том, что этот домен L может быть функциональным доменом. Кроме того, эти гомологии предполагают, что примордиальный домен оказался вставленным в несколько белков и затем выявлял различные функции распознавания в гемостазе, активации комплемента и имунной реакции.
Эти структурные различия между обеими группами интегринов альфа-подъединицы коррелируют с различием в участке распознавания доменов функций, так как содержащие RGD пептиды будут блокировать связывание FNR и gpIIb/IIIa со своими соответствующими лигандами (Ruoslahti, E. et al. Science 238:491-497 (1987)), в то время как пептид RG DS не будет ингибировать взаимодействие LFA-I с ICAM-1. Вопреки лигандам интегринов ЕСМ, сам ICAM-1 не имеет последовательности пептида RGD и является членом подсемейства гена иммуноглобулина. Как структурные, так и функциональные данные свидетельствуют о том, что подсемейство интегрина может быть разделено на два подсемейства альфа-подъединиц. Эти структурные и функциональные свойства альфа-подъединиц, ассоциированные с β2 однако не могут быть уникальными для их подсемейства, так как несколько других альфа-подъединиц интегрина могут иметь структурные характеристики, подобные семье LFA-I, такие как отсутствие протеолитического расщепления (Charo, I. F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:8351-8355 (1986)).
Выяснение структуры альфа-подъединицы обнаружило новое эволюционное взаимоотношение среди альфа-подъединиц интегрина и подсказало возможный функциональный домен, а также продемонстрировало, что альфа-подъединица LFA-I принадлежит к надсемейству интегрина, но обладает добавочным доменом. Этот домен L имеет функциональное значение. Так как участок распознавания LFA-I не является RGD, домен L может быть с функциональной значимостью в альфа-подъединице LFA-I, также как и других интегринах лейкоцита, Mас-I и р150,95. Однако, так как LFA-I вовлечен в значительное число функций лейкоцита и может иметь больше одного лиганда (Rothlein, R. et al. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)), возможно, что более одного функционального домена существует в альфа-подъединице LFA-I.
Формула изобретения: СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО α СУБЪЕДИНИЦУ РЕЦЕПТОРА АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТА L FA 1, заключающийся в том, что lgt 10 библиотеку кДНК, полученную из клеток HLBO, индуцированных комплексом форбола и миристиновой кислоты, подвергают скринингу с использованием в качестве зонда 32-мерного олигонуклеотида 5ʹ-GGG ATGTTGTGG TCA TGG AT GGTGGG CTC AAT = 3ʹ, выделяют клон, гибридизирующийся с олигонуклеотидом, получают EcoRI-фрагмент размером 1,0 кв выделенного клона, библиотеку кДНК подвергают повторному скринингу с помощью того же зонда и выделяют клон, содержащий дополнительный 5ʹ -фрагмент размером 1,0 кв.