Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ - Патент РФ 2051961
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: микробиология. Сущность применения: отбор активных культур микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков, представляющих экологическую опасность, осуществляют за счет того, что качественную оценку способности микроорганизмов разрушать ксенобиотик производят с помощью визуального наблюдения уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов, изменяющегося за счет цветной реакции с реактивом 2, 3, 5-трифенилтетразолий хлорида, добавленного в среду на чашки Петри и восстанавливающегося из бесцветной соли в трифенилформазан красного цвета под действием фермента дегидрогеназы, проявляющего свою активность в процессе разложения ксенобиотика. Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для оценки самоочищающей способности почвы при интенсивном применении пестицидов. 3 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2051961
Класс(ы) патента: C12N1/00, C12N1/14, C12N1/20, C12Q1/00, C12Q1/32
Номер заявки: 5046125/13
Дата подачи заявки: 04.06.1992
Дата публикации: 10.01.1996
Заявитель(и): Институт микробиологии АН Республики Молдова (MD)
Автор(ы): Гранатская Татьяна Алексеевна[MD]; Плацында Виолетта Аркадьевна[MD]; Дворникова Татьяна Прокофьевна[MD]; Сирецану Людмила Федоровна[MD]
Патентообладатель(и): Институт микробиологии АН Республики Молдова (MD)
Описание изобретения: Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу выявления и отбора активных культур микроорганизмов, разлагающих ксенобиотики, представляющие экологическую опасность и может быть использовано для быстрой оценки самоочищающей способности почвы при интенсивном применении пестицидов.
Известные способы выявления и отбора включают выделение микроорганизмов непосредственно из почвы (воды) или из накопительных культур и оценку их способности трансформировать или разлагать ксенобиотики.
Однако эти методы трудоемки и длительны по времени, при их осуществлении расходуется значительное количество химических реактивов, что не позволяет использовать их для ускоренного скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков. Другие методы качественной оценки основаны на специфичности отдельных ксенобиотиков и не могут быть использованы для решения общих задач отбора микроорганизмов-деструкторов.
Наиболее близким по своей технической сущности аналогом к заявляемому является способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ, согласно которому агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли и ксенобиотик, засевают выделенными культурами микроорганизмов, выращивают их, затем обрабатывают культуральную среду водным раствором фенола и учитывают зоны просветления вокруг выросших колоний.
Задача изобретения сокращение времени и упрощение процесса выявления и отбора микроорганизмов-деструкторов пестицидов, снижение расхода химических реактивов для удешевления метода.
В известном способе готовят плотную питательную среду, содержащую ксенобиотик (как источник питания и энергии), засевают выделенные культуры микроорганизмов на эту среду, культивируют посев, а затем проводят анализ результатов путем обработки индикаторным раствором (фенолом) и учета зон просветления вокруг выросших колоний, которые и свидетельствуют о наличии микроорганизмов-деструкторов.
Предложенный способ отличается от известного тем, что посев проводят на питательную среду Е-8, куда вводят ксенобиотик и дополнительно вводят индикатор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). О наличии микроорганизмов-деструкторов будет свидетельствовать зона красного цвета, указывающая на образование восстановленного трифенилформазана (ТФФ) под действием микробной дегидрогеназы.
Использование в качестве реагента для индикации дегидрогеназной активности соли тетразолия известно.
Сопоставительный анализ заявляемого решения с аналогом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что качественную оценку способности микроорганизмов разрушать ксенобиотик, осуществляют с помощью визуального наблюдения за изменением уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов по размерам зоны их роста на плотной питательной среде Е-8, окрашенной за счет цветной реакции с реактивом ТТХ, добавленного в среду и восстанавливающегося из бесцветной соли в соединении ТФФ красного цвета при окислительно-восстановительных реакциях микробного разложения ксенобиотика.
Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". В аналоге качественную оценку способности микроорганизмов использовать ксенобиотик как источник питания и энергии проводят путем выращивания их и последующей обработки культуральной среды 3-5%-ным раствором фенола.
В заявляемом способе введение дополнительно в среду Е-8 на чашки Петри реактива ТТХ для обнаружения фермента дегидрогеназы, катализирующего окислительно-восстановительные реакции органических веществ, и образование красного окрашивания свидетельствует о деструкции ксенобиотика. Максимум окрашенной зоны по сравнению с контролем свидетельствует о максимуме дегидрогеназной активности микроорганизмов-деструкторов, а следовательно, и о деструкции ксенобиотика. Таким образом, выявление микроорганизмов-деструкторов в заявляемом техническом решении ведется визуально по уровню их дегидрогеназной активности. Это позволяет сделать вывод о соответствии нового отличительного признака критерию "изобретательский уровень".
Предлагаемый способ выявления микроорганизмов-деструкторов пестицидов реализуется следующим образом.
Готовят питательную среду Е-8 следующего состава, г/л: KH2PO4 0,7; (NH4)2HPO4 1,5; MgSO4 0,8; NaCl 0,5; агар 20,0; рН 5,5-5,7 (для грибных культур), рН 6,6-6,7 (для бактериальных культур). Среду стерилизуют в автоклаве при 3/4 атм. 20 мин. Для проявления дегидрогеназной активности в охлажденную после стерилизации среду стерильно добавляют 1% -ный раствор 2,3,5-ТТХ.
В опытах использовали культуры микроорганизмов, выделенные из почв участков с многолетним внесением сим-триазиновых гербицидов и фунгицида ридомила. На одну чашку можно посеять 4-12 культур микроорганизмов.
Статистически достоверные результаты получены при 5-7 повторностях каждого варианта.
П р и м е р 1. Опытный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится раствор гербицида атразина 0,6 мг/л (из расчета 1,5 кг/га д.в.) и по 20 мл среды Е-8 с ТТХ для определения дегидрогеназной активности. Контрольный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится по 20 мл среды Е-8 с ТТХ, но без атразина.
Чашки Петри экспонируют при комнатной температуре до полного застывания среды. На поверхность готовой среды опытного и контрольного вариантов производят посев уколом 6-ти суточной грибной культуры. Посевы инкубируют в термостате при 28оС. Через 3, 6, 9, 12, 18 суток производят учет цветной реакции на дегидрогеназную активность исследуемого микроорганизма, измеряя диаметр окрашенной зоны.
Как видно из табл. 1, максимум диаметра окрашенной зоны культуры N 47 достигается через 12 суток и составляет в опытных вариантах 32 мм, в контрольных 12 мм. Величина диаметра окрашенной зоны культуры N 176 не превышает 11 мм за тот же период времени.
П р и м е р 2. Опытный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится раствор фунгицида ридомила 3,2 мг/л (из расчета 8 кг/га д.в.) и по 20 мл среды Е-8 с ТТХ для определения дегидрогеназной активности. Контрольный вариант. В стерильные чашки Петри стерильно вносится по 20 мл среды Е-8 с ТТХ, но без ридомила.
Чашки Петри экспонируют при комнатной температуре до полного застывания среды. На поверхность готовой среды опытного и контрольного вариантов размещают стерильные полые цилиндры диаметром 5 мм, в которые производят посев по 20 мкл суспензии 3-суточной бактериальной культуры (разведение 102, оптимальная плотность 0,10 нм). Посевы инкубируют в термостате при 28оС. Через 3, 6, 9, 12 суток производят учет цветной реакции на дегидрогеназную активность исследуемого микроорганизма, измеряя диаметр окрашенной зоны.
Как видно из табл. 1, максимум диаметра окрашенной зоны культуры N 165 достигается на 9-ые сутки и составляет 18 мм, а культуры N 162 всего 8 мм. В контрольном варианте диаметр окрашенной зоны 5 мм.
Таким образом, исследуемые культуры микроорганизмов при наличии в среде ксенобиотиков атразина и ридомила проявляют различные уровни дегидрогеназной активности, что свидетельствует о различной способности этих культур разлагать ксенобиотики.
Для проверки достоверности предложенного способа провели исследования изменения суммарной дегидрогеназной активности в клетках тех же микроорганизмов после внесения в среду атразина и ридомила спектрофотометрическим методом.
Из табл. 2 видно, что дегидрогеназная активность культур микроорганизмов N 47 и N 165 выше, чем в контроле на 40% для атразина и на 11,2% для ридомила. Культуры N 176 и N 162 не активны по отношению к данным ксенобиотикам, о чем говорит понижение дегидрогеназной активности по сравнению с контролем.
Способность выделенных из почвы микроорганизмов разлагать атразин и ридомил проверялась также в жидкой минеральной среде Е-8 в колбах при перемешивании на качалке, убыль пестицидов в среде определяли количественно газохроматографическим или спектрофотометрическим методами (табл. 3).
Данные табл. 3 показывают, что разложение атразина осуществляет культура N 47, ридомила N 165, т.е. те же микроорганизмы, уровень дегидрогеназной активности которых значительно повышается при наличии в среде пестицидов (табл. 1).
Следовательно, данные табл. 2 и 3 подтверждают достоверность результатов, полученных по предлагаемому способу и представленных в табл. 1.
Таким образом, показатель уровня дегидрогеназной активности микроорганизмов также можно использовать для выявления культур-деструкторов пестицидов.
Использование предлагаемого способа выявления культур-деструкторов ксенобиотиков обеспечивает следующие преимущества: позволяет выделить штаммы микроорганизмов, обладающих деструктивной активностью по отношению к пестицидам, представляющим экологическую опасность, и вследствие этого создать микробиологическую базу для охраны окружающей среды от загрязнения; значительно, от 1,5-8,0 месяцев до 9-12 суток, т.е. в 5-8 раз сокращается время выявления и отбора микроорганизмов, способных активно разрушать ксенобиотик, за счет сокращения числа аналитических операций; отпадает необходимость в использовании для анализа дорогостоящего оборудования; среди существующих методов выявления и отбора активных культур микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков, являющихся одним из источников загрязнения окружающей среды, предлагаемый способ более дешевый и простой.
Формула изобретения: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ КСЕНОБИОТИКОВ, включающий приготовление плотной питательной среды с ксенобиотиком, посев на нее исследуемой культуры микроорганизмов и культивирование с последующей оценкой их способности разлагать ксенобиотик по образованию видимой в присутствии индикатора зоны, отличающийся тем, что посев осуществляют параллельно на среду Е-8 с ксенобиотиком и контрольную среду без ксенобиотика, а в качестве индикатора используют соль 2,3,5-тетрафенилтетразолия хлорида, которую предварительно вводят в среду, оценку проводят по образованию зоны красного цвета и выявляют микроорганизмы-деструкторы ксенобиотиков при увеличении окрашенной зоны по сравнению с контролем.