Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
АНТИГЕН НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS
АНТИГЕН НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS

АНТИГЕН НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: в диагностических препаратах при диагностике нематодозов. Сущность изобретения: для получения вещества, обладающего высокой гемагглютинирующей активностью, из гомогената мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл методом препаративного электрофореза в 10 %-ном полиакриламидном геле в трисглициновой буферной системе (pH - 8,6) выделяют антиген нематоды Trichinella Spiralis с молекулярной массой от 16 до 20 кД. Элюирование белковой фракции проводят 5 мМ раствором NaHCO3. Полученное вещество обладает высокой гемагглютинирующей активностью и может быть использовано в гельминтологии в диагностических целях. 1 ил., 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2052994
Класс(ы) патента: A61K39/00
Номер заявки: 5040403/13
Дата подачи заявки: 29.04.1992
Дата публикации: 27.01.1996
Заявитель(и): Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Автор(ы): Васерин Ю.И.; Сивоволова И.А.; Нагорный С.А.
Патентообладатель(и): Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Описание изобретения: Изобретение относится к новому диагностическому препарату и может быть использовано в лабораторной практике для диагностики нематодозов.
Известные гемагглютинины различных вирусов, например гриппа, полиомы, пневмовирусов и т. д.(Вирусология./Под ред.Б. Мейхи, М. 1988) используются для диагностики вирусных заболеваний и не могут применяться в гельминтологии.
Известно вещество, обладающее геммагглютинирующей активностью. Это лектин, выделенный из стенки кишечника Ascaria lumbricoides.
Однако применение его в диагностических целях еще не известно.
Для получения вещества, обладающего высокой гемагглютинирующей активностью, из гомогената мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл методом препаративного электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в трисглициновой буферной системе (рН 8,6) выделяют антиген нематоды T.spiralis с молекулярной массой от 16 до 20 кД. Элюирование белковой фракции проводят 5 мМ раствором NaHCO3.
П р и м е р 1. Получение вещества. Белковые экстракты из мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл получают гомогенизацией в электрическом гомогенизаторе типа Поттера-Эльвегейма в 0,25 М растворе сахарозы с последующей ультразвуковой обработкой. Неразрушенные фрагменты трихинелл отделяют центрифугированием при 6-8 тыс. об/мин. В полученном супернатанте определяют концентрацию белка по методу Лоури. Супернатант в количестве 10 мг (по белку) фракционируют методом электрофореза в вертикальном 10%-ном полиакриламидном геле с толщиной 2 мм в трис-глициновой буферной системе (рН 8,6). Белковую зону с Rf 0,8-0,9 вырезают из гелевого блока и помещают в 5 мМ раствор NaHCO3 на 18 ч при 37оС. Экстрагируемый белок освобождают от геля, отжимая последний на фильтре "Владипор"-5 с помощью стеклянного шприца. В полученном белковом экстракте определяют концентрацию белка по методу Лоури. Жидкий белковый экстракт помещают для хранения в жидкий азот или подвергают лиофильной сушке.
П р и м е р 2. Изучение химической природы гемагглютинина нематоды. Trichinella spiralis.
Гемагглютинин нематоды T.spiralis является гликопротеидом с молекулярной массой 16-20 кД. Углеводная часть представлена N-ацетилгалактозамином и N-ацетилнейраминовой кислотой.
Изоэлектрическая точка рI 5,9±0,1. Максимум поглощения в УФ-спектре при 280 нм ( фосфатном буфере рН 7,2-7,4).
Выявленный гемагглютинин обладает гликозидазной (сиалидазной) активностью.
Выход гемагглютинина составляет 20-25% по отношению к белку гомогената трихинелл.
Гемагглютинин нематоды T.spiralis является группоспецифичным антигеном (торможение трихинеллезной и токсокарозной антисыворотками в реакции РТГА).
П р и м е р 3. Оценка гемагглютинирующей активности белковой фракции с молекулярной массой 16-20 кД, выделенной из гомогената нематоды.
Гемагглютинирующую активность определяют при помощи реакции гемагглютинации в стандартных 96-луночных планшетах с V-образными лунками (Ленинград) методом двухкратных серийных разведений выделенной белковой фракции. Для реакции используют 0,33% и 1,0% формалинизированные эритроциты барана в 0,3% -ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на фосфатно-солевом буфере (3ФР) рН 7,2-7,4. Условия проведения реакции: комнатная температура (20-22оС); время выдерживания реакции 60 мин, дополнительное подтверждение учета результатов через 24 ч.
Типичный результат титрования гемагглютинина трихинелл приведен в таблице.
На чертеже показано титрование гемагглютинина нематоды Т.spiralis, 1-й ряд контроль 1% формалинизованных эритроцитов барана; 2-й ряд ГА из гомогената кишечных трихинелл; 3-й ряд ГА из гомогената мышечных трихинелл.
Гемагглютинин нематоды Т.spiralis агглютинирует 0,33% или 1% формалинизированные эритроциты барана при концентрации белка 100-200 мкг/мл (для кишечной формы трихинелл) и 200-400 мкг/мл (для мышечных личинок трихинелл) или при титрах 16-32 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ).
П р и м е р 4. Использование гемагглютинина нематоды Trichinella spiralis в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Выделенный из гомогената нематоды T.spiralis гемагглютинин может быть использован в диагностических исследованиях на нематодозы в реакции торможения гемагглютинации.
Постановка реакции.
1. Титрование гемагглютинина. С выделением гемагглютинином предварительно ставят реакцию гемагглютинации, как описано в примере N 3 для определения ГА (гемагглютинирующего)-титра антигена. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.
Для титрования сывороток в РТГА используют 4 ГА-единицы гемагглютинина нематоды Т.spiralis. Таким образом, если ГА-титр гемагглютинина нематоды Т. spiralis равняется 32, то для обнаружения антител к нему необходимо развести антиген в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 24-48 ч при 4оС.
2. Предварительная обработка сыворотки.
Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемагглютинации и естественные агглютинины. Поэтому сыворотки перед постановкой реакции должны быть обработаны адсорбцией на каолине, а затем адсорбцией на эритроцитах того вида, который используют в реакции.
3. Проведение реакции торможения гемагглютинации.
С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки с равным объемом 0,3% БСА в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). В каждую лунку с разведенной сывороткой вносят по одному объему ГА-антигена из гомогената нематоды T.spiralis, содержащего 4 ГА. Параллельно ставят контроль сыворотки и контроль ГА-антигена с 0,3 БСА. Планшет закрывают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Спустя это время во все заполненные лунки вносят по 2 объема 0,33 суспензии формалинизированных эритроцитов барана в 0,3 БСА на 3ФР. Планшеты ставят на 1-2 ч (или на ночь) при комнатной температуре. Просматривая планшеты, определяют титр специфических антител в исследуемой сыворотке, который представляет собой обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация. Наличие специфических антител (антигемагглютининов) в исследуемой сыворотке считают доказанным при титре 1:16 и выше.
Таким образом, предлагаемое вещество обладает высокой гемагглютинирующей активностью и может быть использовано в гельминтологии в диагностических целях.
Формула изобретения: АНТИГЕН НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS, обладающий гемагглютинирующей активностью, проявляющейся в области рН 7,2 - 8,0 и сопровождающийся гликозидазной (сиалидазной) активностью, выделенной из смеси белков, полученной при гомогенизации нематоды Trichinella spiralis, имеющий следующие свойства:
-мол. м. 16 - 20 кД (при определении методом аналитического электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и использовании в качестве маркеров тиреоглобулина (330 кД), феритина (220 кД), каталазы (60 кД), альбумина (67 кД), овальбумина (43 кД), лактатдегидрогеназы (36 кД), лактальбумина (14,4 кД);
- изоэлектрическая точка pI 5,9 ± 0,3 (при определении турбидиметрическим методом);
-наличие углеводного остатка, дающего окрашивания с антронсерной кислотой;
-спектры: максимум поглощения в УФ при 280 нм (в фосфорном буфере с рН 7,2 - 7,4).