Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КОРИ
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КОРИ

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КОРИ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: С целью повышения выхода вирусного антигена Штамм Л-16В культивируют при заражающей дозе 0,5...0,05 ТЦД50 /кл на поддерживающей среде Игла или среде 199 в присутствии 3,0...9,0 об.% направленно введенных аминокислот из группы незаменимых или аминопептида. Выход вируса на 1-литровом матраце составляет 560 мл при титре 6,5 Ig ТЦД50/0,5 мл. 4 з. п. ф-лы, 4 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2053297
Класс(ы) патента: C12N5/00, A61K39/165
Номер заявки: 94031051/13
Дата подачи заявки: 28.07.1994
Дата публикации: 27.01.1996
Заявитель(и): Смородинцев Анатолий Александрович; Смородинцев Александр Анатольевич
Автор(ы): Смородинцев Анатолий Александрович; Смородинцев Александр Анатольевич
Патентообладатель(и): Смородинцев Анатолий Александрович; Смородинцев Александр Анатольевич
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении коревой вакцины.
Известны способы получения коревой вакцины из штаммов-продуцентов: штамма Шварца, Эдмонстон-Загреб, САМ-70, АIК-С (S. J. Clements, et al. Research into alternative measles vaccines in the 1990's World Health Organization, EPI/GEN/88.11).
Недостатком способов культивирования этих штаммов является их длительное пассирование на тканевых культурах человека, что в свою очередь снижает репродукционную активность и, как следствие, вызывает снижение иммуногенной активности получаемой из него вакцины.
Основные характеристики процесса получения коревой вакцины определяются технологией культивирования штаммов определенных видов.
В этой связи известно, что штаммы Шварца, АIК-С и САМ-70 выращивают в культуре фибробластов куриных эмбрионов, а Эдмонстон-Загреб в диплоидной культуре человека (C. J. Clements et. al. указанная работа). Других технологических сведений авторами не обнаружено.
Также известны два отечественных штамма: Ленинград-16 и Ленинград-16В (Л-16 в соответствии с регламентом N 196-74 вакцины коревой культуральной живой сухой, изменение N 175/4, 1988 г. и его разновидность Л-16В в соответствии с ГКВ N 2277).
Так штамм Л-16 культивируют по известному способу в поддерживающей среде 199 с одной из следующих добавок: 0,4% альбумина; 5% сорбита и антибиотиков; 5% аминопептида. (способ-прототип).
Штамм Л-16В получен пассированием прототипного штамма Л-16, взятого спустя 22 года хранения в коллекции производственных штаммов, в тканевой культуре фибробластов эмбрионов перепелок (ФЭП) при пониженной температуре, а именно 30оС. Селекция была проведена авторами по критерию отсутствия нейровирулентности, что проверялось на обезьянах, т. к. исходный штамм Л-16 содержит нейровирулентные вирусные частицы.
Однако известные способы культивирования указанных продуцентов дают низкий выход биомассы, что также снижает иммуногенную активность получаемой вакцины.
Целью изобретения является повышение выхода вирусной биомассы, т. е. повышение ее репродукционной активности.
Указанная цель достигается тем, что по способу культивирования вируса кори в поддерживающей среде, содержащей аминокислоты, культивируют вирус кори Л-16В в среде 199 или среде Игла с дополнительным введением аминокислот с их суммарным содержанием 3,0.9,0 об. при этом удельную заражающую дозу вируса устанавливают равной 0,5.0,05 ТЦД50/кл.
Кроме этого, амикокислоты вводят в виде аминопептида. Также вводят аминокислоты из группы незаменимых: валин, трионин и триптофан.
При этом группа незаменимых аминокислот содержится в следующих концентрациях, г/л; Валин 0,5.1,0 Трионин 0,5.1,0 Триптофан 0,5.0,8 Изолейцин 1,0.1,5 Лейцин 1,0.1,5 Лизин 1,0.2,0 Метионин 0,5.0,8 Фенилаланин 0,7.1,4
Кроме этого заражающую дозу вводят на пористом носителе.
По нашим данным, среда Игла для культивирования вируса кори не применялась. Предлагаемая удельная заражающая доза на порядок превышает известную, что по нашему мнению, неочевидно в отношении достижения вышеуказанной цели. Содержание аминокислот (3,0.9,0 об.) в данной рецептуре также обладает новизной. Совместное использование поддерживающей среды 199 с дополнительным направленным введением аминокислот ранее тоже не практиковалось.
Введение в поддерживающую среду недостающих аминокислот: валина, трионина и триптофана создает условия полноценного развития микроорганизмов и, следовательно, существенного увеличения суммарного выхода полезной вирусной биомассы.
Содержание аминокислот в поддерживающей среде в очень незначительных концентрациях до 100 мг/л создает качественный барьер между условиями выживания микроорганизмов и условиями их размножения. Соответствие последним необходимо с точки зрения их промышленного культивирования. Введение основных аминокислот из группы незаменимых, т. е. невоспроизводимых клетками, в приведенных выше концентрациях позволяет создать именно такие оптимальные условия.
Кроме того, для повышения выхода вируса используют в качестве добавок к поддерживающей среде аминопептид препарат, вырабатываемый на мясокомбинатах путем обработки тканей крупного рогатого скота ферментами-аминопептидазами, содержащимися в желудках коров. В результате получают непредсказуемый по составу набор коротких обрывков молекул белка: коротких пептидных цепочек, аминокислот, карбоксильная группа СООН одной аминокислоты соединена с аминогруппой NH2 другой амикокислоты. Все эти короткие цепочки не обладают антигенностью способностью стимулировать в организме образование антител. Но аминопептидная добавка снабжает питательную среду (поддерживающая среда + аминокислоты в любом виде) всеми 20 аминокислотами, необходимыми для роста и функционирования клеток при синтезе в них вируса, для строительства его белковой оболочки.
Введение заражающей дозы на пористом носителе вместе со значительным увеличением заражающей дозы (на порядок) позволяет существенно увеличить выход культивируемой вирусной биомассы за счет более развитой поверхности, задействуемой для образования продуцирующего клеточного монослоя.
По сравнению с прототипом изобретение имеет новую совокупность существенных признаков, т. е. отвечает критерию "новизны".
Совокупности отличительных признаков изобретения среди известных решений не обнаружено. Это позволяет нам утверждать, что изобретение соответствует критерию "существенности отличий".
Совокупность же общих и частных существенных признаков изобретения обеспечивает достижение цели изобретения.
П р и м е р 1.
В однолитровые матрацы с тканевой культурой ФЭП в ростовой среде 199 с добавлением 10 об. сыворотки крупного рогатого скота вносят вирус кори штамма Л-16В в заражающих дозах от 0,04 до 0,6 ТЦД 50/кл (для каждой заражающей дозы по 5 матрацев) и инкубируют в роллерах при температуре 35оС и скорости 0,3 об/мин до образования монослоя клеток, что происходит не позже чем на 3 сутки инкубирования. Затем ростовую среду удаляют, а монослой 6-кратно отмывают от сыворотки раствором Хенкса pH 7,4.
Далее в матрацы с зараженным клеточным монослоем добавляют по 160 мл поддерживающей среды Игла с 6 об. аминопептида или аминокислот из группы незаменимых и производят культивирование вируса в роллере при 35оС и 0,3 об/мин в течение срока сохранения тканевой культуры (этот срок в различных матрацах колеблется от 18 до 22 дней). По мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя, характерных для вируса кори (наблюдают под микроскопом), вируссодержащую жидкость сливают во флаконы и хранят под резиновой пробкой при минус 20оС для последующего использования, а в матрацы добавляют по 160 мл свежей поддерживающей среды Игла с вышеуказанным количеством аминопептида или аминокислот и культивируют при тех же условиях. Такую процедуру многократно повторяют. При этом интервал замены среды составляет 1-2 дня. При данных условиях число полезных съемов (циклов, в которых содержание вируса не менее 4 lgТЦД50/0,5 мл) не менее 5. Все операции способа выполняют в стерильных условиях.
Результаты культивирования приведены в табл. 1.
Как видно из табл.1, увеличение заражающей дозы в 10-30 раз по сравнению с прототипом позволяет на данной среде получить вирусную биомассу с титром 6,2-6,5 lgТЦД50/0,5 мл, тогда как при меньшей заражающей дозе (0,04 ТЦД 50/кл) этот титр составляет лишь 5,2 lgТЦД50/0,5 мл. Вместе с тем максимум выхода по объему (700-760 мл/матрац) достигается в диапазоне заражающих доз от 0,1 до 0,3 ТЦД 50/кл из-за повышения числа полезных съемов вируса (возможных циклов культивирования).
П р и м е р 2.
В 25 1-литровых матрацев с тканевой культурой ФЭП в ростовой среде 199 с добавлением 10 об. сыворотки крупного рогатого скота вносят вирус кори штамма Л-16В в заражающей дозе 0,2 ТЦД 50/кл и инкубируют как в примере 1. Далее в матрацы с зараженным клеточным монослоем добавляют по 160 мл поддерживающей среды Игла с 2,3; 5,8 и 13 об. аминопептида или указанной группы аминокислот (параметрический ряд Фибоначчи, используемый, как известно, для повышения точности однофакторного эксперимента), используя по 5 матрацев для каждого значения этого параметра.
Культивирование вируса осуществляют как в примере 1.
Результаты культивирования приведены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что при содержании аминопептида в поддерживающей среде Игла 5-8 об. урожай вируса максимальный и составляет 500 мл/матрац при титре 5,6-6,3 lgТЦД50/0,5 мл. Вне этого диапазона концентрации аминопептида выход вируса значительно меньше как по объему, так и по титру.
П р и м е р 3.
В 25 1-литровых матрацев вносят по 50 млн. клеток ФЭП в ростовой среде 199 с добавлением 10 об. сыворотки крупного рогатого скота. После формирования монослоя клеток ростовую среду удаляют, клеточный монослой отмывают от сыворотки как в примере 1 и заражают вирусом кори штамма Л-16В в тех же дозах, что и в примере 2. Остальные операции осуществляют как в примере 2.
Результаты культивирования приведены в табл. 3.
Из таблицы 3 видно, что при содержании аминопептида или аминокислот в поддерживающей среде Игла 5-8 об. урожай вируса максимальный и составляет 550 мл/матрац при титре 5,5-6,2 lgТЦД 50/0,5 мл. Вне этого диапазона концентрации аминопептида или аминокислот выход вируса снижается как по объему, так и по титру.
П р и м е р 4.
Клеточную культуру ФЭП в 10 матрацах заражают вирусом Л-16В как в примере 1.
В 5 матрацах в качестве поддерживающей среды используют среду Игла с добавлением 5 об. аминопептида или аминокислот, а в остальных 5 матрацах вирус культивируют с использованием среды 199 с тем же количеством аминопептида или аминокислот.
Другие условия культивирования устанавливают по примеру 1.
Результаты культивирования приведены в табл. 4.
Как видно из табл. 4, при равных заражающих дозах выход вируса на среде Игла больше чем на среде 199 как по объему, так и по концентрации.
П р и м е р 5.
Сравнительное культивирование штаммов Л-16 и Л-16В.
5 1-литровых матрацев с клеточной культурой ФЭП заражают вирусом кори Л-16 (штамм-прототип) в дозе 0,01 ТЦД50/кл. Другие 5 матрацев заражают вирусом кори Л-16В в дозе 0,1 ТЦД50/кл.
Для культивирования штамма Л-16 используют поддерживающую среду 199 с 5 об. аминопептида или аминокислот, а для штамма Л-16В среду Игла с тем же количеством питательной добавки.
Условия съема вирусосодержащей жидкости и культивирования как в примере 1.
Средний выход вируса Л-16 с одного матраца составляет 360 мл при титре 5,2 lgТЦД50/0,5 мл, а вируса Л-16В 560 мл при титре 6,5 lgТЦД50/0,5 мл.
Собранные вируссодержащие материалы объединяют поштаммно, добавляют стабилизатор (желатин с сахарозой из расчета конечной концентрации 1 об.), разводят средой Игла до концентрации 4,5 lgТЦД50/0,5 мл, разливают в ампулы и лиофильно высушивают.
В результате получают 36000 доз вакцины штамма Л-16 и 526000 доз вакцины штамма Л-16В в одной дозе 2000 ТЦД50/0,5 мл).
В данном примере объем вакцины из штамма Л-16В в 14 раз больше, чем из прототипного.
Все приведенные примеры отрабатывались на пористых и обычных носителях. В качестве пористых структур использовалось микро-и макропористое стекло, а также ферментеры с частицами латекса или цитодексов. Во всех случаях использования пористых носителей было достигнуто до 15-40% прироста полезной биомассы.
П р и м е р 6.
Штамм Л-16В культивируют как в примере 1 при заражающей дозе 0,2 ТЦД50/кл. Выращенный вирус контролировали иммунизацией 83 серонегативных детей в возврате 1 год и старше. Сероконверсия (образование специфических антител) выявлена у 100% привитых. По данным РТГА средняя геометрическая титра антител у этих детей равна 6,44 log2.
Реактогенность вакцинного вируса не превышает нормы, регламентированной НТД. Специфическая реакция на введение вакцины (кратковременные катаральные явления и гиперемия зева) наблюдалась у 7 детей.
При сравнении с иммуногенностью прототипной вакцины из штамма Л-16 сероконверсия отмечена у 97,9% из 46 привитых серонегативных детей. Средняя геометрическая титра антител составила 6,05 log2, что ниже иммуногенности вакцины из штамма Л-16В.
Как пояснено приведенными примерами, предлагаемый новый способ культивирования коревой вакцины обеспечивает по сравнению с прототипом повышение выхода вируса по титру и обмену, что позволяет в 20 раз увеличить выход вакцины. При этом получаемый целевой продукт обладает более высокой иммуногенностью и, следовательно, отвечает критерию "положительный эффект".
Формула изобретения: 1. СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КОРИ в поддерживающей среде, содержащей аминокислоты, отличающийся тем, что культивируют штамм вируса кори Л-16 или Л-16В в среде 199 или среде Игла с дополнительным введением аминокислот с их суммарным содержанием 3,0-9,0 об.%, при этом удельную заражающую дозу вируса устанавливают равной 0,5 - 0,05 ТЦД50/кл.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминокислоты вводят в виде аминопептида.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводят аминокислоты из группы незаменимых: валин, трионин и триптофан.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что группа незаменимых аминокислот содержится в следующих концентрациях, г/л:
Валин - 0,5 - 1,0
Трионин - 0,5 - 1,0
Триптофан - 0,5 - 0,8
Изолейцин - 1,0 - 1,5
Лейцин - 1,0 - 1,5
Лизин - 1,0 - 2,0
Метионин - 0,5 - 0,8
Фенилаланин - 0,7 - 1,4
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что заражающую дозу вводят на пористом носителе.