Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5ʹ-CTCTTC-3ʹ - Патент РФ 2054040
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5ʹ-CTCTTC-3ʹ
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5ʹ-CTCTTC-3ʹ

ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ САЙТ - СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5ʹ-CTCTTC-3ʹ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: микробиология и биотехнология. Техническая задача: выявление штамма - продуцента, обеспечивающего получение термостабильной сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5ʹ-CTCTTC-3ʹ, с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillu coalilans ВКПМ в - 6309 (116) - продуцент рестриктазы Bco 116 I, выделенный из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 8000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bco 116 I является изошизомером рестриктазы Bco 632 I и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2054040
Класс(ы) патента: C12N9/14, C12N9/14, C12R1:07
Номер заявки: 93003627/13
Дата подачи заявки: 22.01.1993
Дата публикации: 10.02.1996
Заявитель(и): Акционерное общество "Валпэк ЛТД"
Автор(ы): Репин В.Е.; Терещенко Т.А.; Лебедев Л.Р.
Патентообладатель(и): Акционерное общество "Валпэк Лтд"
Описание изобретения: Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-СТСТТС-3'.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического каротирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.
Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-AССТGC и 5'TССGGA-3' соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестрактаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'СТСТТС-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.
Известен штамм Enterobacter aerogenes, продуцирующий рестриктазу Ear I (сайт узнавания 5'СТСТТС-3') [2]
Недостатком данного штамма является термостабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.
Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Kl uyvera species 632, продуцирующий рестриктазу Ksp 632I [3]
Недостатками данного штамма является то, что продуцируемая им рестриктаза является термостабильной. Выход рестриктазы не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Для разрушения биомассы требуется специальное оборудование. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы которых встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'СТСТТС-3', с высоким выходом и активностью фермента.
Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus coagulans 116 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bco 116 I.
Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.
Полученный штамм Bacillus coagulans 116 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6309, а продуцируемая им рестриктаза названа Bco 116 I согласно общепринятой номенклатуре.
Штамм Bacillus coagulans характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, прямые 0,5-0,8 х х 2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.
Культуральные признаки.
Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментные колонки, блестящие, с ровным краем.
Оптимальная температура роста 60оС, рН 7,0-7,2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70оС или в лиофильно-высушенном состоянии.
Физиологические признаки.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 5% слабо растет на 0,002% азиде натрия и на cреде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре, если не добавлять в среду триптон; индолотрицателен.
Для культивирования Bacillus coagulans В-6309 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.
Выход целевого фермента 8000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10.000 ед/мл.
Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
возможность разрушать биомассу путем ультразвуковой дезынтеграции.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-СТСТТС-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bco 116 I, Bco 116 I и Ksp 632 I (Boehringer Mannheim) Ksp 632 I фаг лямбда представляет идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.
П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.
Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): пептон 10, дрожжевого экстракта (Difco) 5, глюкозы 5, воды дистиллированной остальное. Культивирование проводят при 60оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.
Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-СТСТТС-3'.
Выход фермента Bco 116 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДН фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60оС. Выход фермента составляет 8.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.
Фермент хранится при -20оС в глицерине.
Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
возможность разрушать биомассу путем ультразвуковой дезынтеграции.
Поскольку рестриктаза Bco 116 I имеет сайт узнавания 5'-СТСТТС-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Ksp 632 I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.
Формула изобретения: Штамм бактерий Bacillus coagulans ВКПМ-В-6309-продуцент сайт-специфической эндонуклазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5ʹ-СТСТТС-3ʹ.