Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13- ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2- ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13- ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2- ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13- ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2- ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология, химико-фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: получение 18-карбобкси-20(карбоксиметил)-8-этенил -13- этил-2,3-дигидро-3,7,12,17 - тетраметил-21Н,23Н порфин -2- пропионовой кислоты или ее солей. Получение хлорина e6 осуществляют при использовании в качестве сырья биомассы цианобактерий, например, рода Spirulina, полученной путем выращивания в условиях искусственного или солнечного освещения на питательных средах, имеющих рН 8,0 - 12,0, с предварительной обработкой биомассы спиртовым раствором щелочи. Полученный спиртовой экстракт хлорофилла обрабатывают кислотой с получением феофитина a. Феофитин промывают неполярным растворителем, например гексаном, и подвергают омылению до образования целевого продукта, который осаждают обработкой соляной кислотой. 4 з.п. ф-лы.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2054476
Класс(ы) патента: C12N1/12, C07D487/22
Номер заявки: 93036361/13
Дата подачи заявки: 14.07.1993
Дата публикации: 20.02.1996
Заявитель(и): Малое индивидуальное предприятие "Вета"
Автор(ы): Альбицкая О.Н.; Ашмаров В.В.; Мещерякова А.Л.
Патентообладатель(и): Мещерякова Аделия Леонидовна
Описание изобретения: Изобретение относится к органической химии, а именно к улучшенному способу получения порфиринов, в частности к способу получения хлорина е6(18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигид- ро-3,7,12,17- тетраметил-21н, 23н. порфин-2-пропионовой кислоты) или ее солей, которые могут найти применение в химико-фармацевтической промышленности.
Хлорин е6 относится к классу растительных порфиринов, получаемых на основе хлорофилла . Известно, что растительные порфирины, в том числе хлорофилл и его производные, являются фармакологически активными соединениями и могут быть использованы в медицинской практике, в том числе как фотосенсибилизаторы для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний. В настоящее время известны способы получения хлорина е6, основанные на химических превращениях хлорофилла в целевой продукт.
В частности, наиболее распространен способ получения хлорина е6путем обработки хлорофильного экстракта, полученного из соевых бобов, 30%-ной соляной кислотой с получением смеси феофорбидов и , которую затем обрабатывают 0,5%-ным метанольным раствором щелочи в вакууме. Целевой продукт извлекают из реакционной массы с помощью эфира.
Известен также способ получения хлорина е6 из листьев крапивы. Для этого листья крапивы заливают этанолом. В результате получают экстракт, содержащий смесь хлорофиллов и . Экстракт обрабатывают концентрированной соляной кислотой, в результате чего из каждой формы хлорофилла, содержащейся в экстракте, образуется соответствующая форма феофитина и . Последующее щелочное омыление разных форм феофитина приводит к образованию в реакционной массе как минимум двух продуктов хлорина е6 и родина g7. Соотношение этих продуктов составляет 4:1 соответственно. Наряду с этими основными продуктами в реакционной смеси присутствуют их эфиры, а также фитинные остатки.
Для выделения хлорина е6 из смеси продуктов реакционную смесь сначала нейтрализуют концентрированной соляной кислотой до рН 7,0, а затем добавляют дополнительно концентрированную соляную кислоту в количестве, соответствующем солянокислому числу хлорина е6. При этом из реакционной смеси извлекают 2/3 растворенного в ней хлорина е6.
Расход концентрированной соляной кислоты на очистку хлорина е6составляет 120 мл на 1 л реакционной смеси, а всего на получение 1 г хлорина расходуют 2,5 л концентрированной соляной кислоты.
По указанному способу получают 1 г хлорина е6 из 1 кг сухих листьев крапивы, при этом чистота продукта составляет от 30% до 60% основного вещества. Для получения более чистого целевого продукта используют метод колоночной хроматографии окиси алюминия (элюент-метиленхлорид:бензол (2 к 1)).
Таким образом, в известных методах получения хлорина е6 на первой стадии технологического цикла используются экстракты хлорофилла, полученные из хлорофиллсодержащих частей высших растений или зеленых водорослей. Известно, что все зеленые растения содержат несколько форм хлорофилла, а именно хлорофиллы и . При этом соотношение отдельных форм хлорофилла у разных растений неодинаково и зависит от приспособляемости растений к различным условиям освещения. У "светолюбивых" растений соотношение хлорофиллов и в листьях составляет в среднем 3:1, у "теневыносливых" оно уменьшается.
При обработке зеленых растений органическими растворителями извлекаются все формы хлорофилла ( и ) и при последующей обработке этих экстрактов образуется либо смесь феофорбидов и (по первому способу), либо смесь феофитинов и (как указано во втором способе), что в конечном счете приводит к образованию смеси хлорина е6 и родина g7.
Недостатками известных способов получения хлорина е6 являются сложность технологического процесса, использование больших объемов концентрированной соляной кислоты (2,5 л на 1 г хлорина е6), небольшой выход и низкая чистота целевого продукта (из 1 кг сухих листьев крапивы получают 1 г хлорина е6, чистота которого не выше 60%), использование хроматографического способа очистки целевого продукта. Кроме того, учитывая сложную экологическую обстановку, не исключена возможность загрязнения растительного сырья пестицидами и другими ядохимикатами, и использование спонтанно выросшей биомассы зеленых растений в качестве источника хлорофилла может привести в конечном счете к загрязнению медицинских препаратов.
Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта, существенное снижение расхода коррозионно-опасной соляной кислоты и получение целевого продукта чистотой не ниже 90% без использования хроматографической очистки.
Это достигается предлагаемым способом получения хлорина е6, заключающимся в том, что в качестве исходного сырья используют биомассу цианобактерий обычно рода Spirulina, преимущественно выращенных на свету в контролируемых условиях на искусственных питательных средах, имеющих водородный показатель от 8,0 до 12,0. Биомассу цианобактерий обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, преимущественно при соотношении вода:спирт как 1 к 2-3 и концентрацией щелочи 10-2-10-3 н. отфильтровывают и экстрагируют хлорофилл "а" этиловым спиртом. Объединенные экстракты обрабатывают органической или соляной кислотой, образовавшийся феофитин отфильтровывают, промывают неполярным органическим растворителем, обычно гексаном.
Щелочной гидролиз феофитина проводят в отсутствие кислорода воздуха в спиртовой среде при нагревании. При этом образуются щелочные соли хлорина. После охлаждения реакционную смесь доводят соляной кислотой до рН 6,0-7,0 (расход кислоты 50-55 мл на 1 л реакционной массы, образовавшийся осадок хлорина е6 отфильтровывают, промывают и сушат до постоянного веса. Хлорин е6 может быть переведен в соли обычными приемами.
Использование предлагаемого способа позволяет повысить выход целевого продукта по меньшей мере в 3 раза и получить продукт с чистотой не ниже 90% Кроме того, расход концентрированной соляной кислоты сокращен приблизительно в 10 раз.
Для удаления водорастворимых белков, углеводородов и других примесей биомассу цианобактерий предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, например, при соотношении воды и спирта 1 к 2-3 и концентрации щелочи 10-2-10-3 н. Для повышения выхода целевого продукта целесообразно согласно заявляемому изобретению использовать биомассу цианобактерий, содержащую (по сухому остатку) 2,0-4,5 мас. хлорофилла формы , 46-62 мас. белков, 4-9 мас. липидов, 10-20 мас. углеводов, 10-12 мас. зольных элементов.
Дальнейшие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа получения хлорина е6 и конкретных примеров осуществления этого способа.
В соответствии с заявленным изобретением получение 18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12, 17- тетраметил-21н.23н. порфин-2-пропионовой кислоты, называемой хлорин е6, осуществляют из вещества, содержащего хлорофилл только формы из биомассы цианобактерий, получаемой при их культивировании на искусственных питательных средах, в условиях солнечного или искусственного освещения.
Монокультуру цианобактерий выращивают в специальных ферментерах закрытого типа, исключающих заражение зелеными водорослями, а следовательно, и попадание в биомассу хлорофилла формы .
Использование хлорофиллсодержащего растительного сырья стандартного состава, выращенного в альгологически и экологически чистых условиях, гарантирует получение высокой чистоты хлорина е6, свободного от следов тяжелых металлов и других примесей, вызванных загрязнением окружающей среды. Это обстоятельство особенно важно при производстве медицинских препаратов.
Биомассу цианобактерий целесообразно обрабатывать горячим водно-спиртовым раствором щелочи, например, при температуре 40-60оС, соотношении воды и спирта 1 к 2-3 и концентрации щелочи 10-2-10-3 н. При такой обработке происходит разрушение клеточных оболочек, удаляются низкомолекулярные фракции углеводов и водорастворимые белки, которые затрудняют последующую экстракцию хлорофилла и загрязняют экстракт, а следовательно, целевой продукт. Биомассу после обработки экстрагируют этиловым спиртом, извлекая хлорофилл . На полученный экстракт воздействуют минеральной или органической кислотой, например уксусной или соляной, для образования в реакционной массе феофитина , который выделяют фильтрованием.
Полученный феофитин , выход которого составляет 10 г из 1 кг биомассы цианобактерий, промывают неполярным растворителем, например гексаном, для удаления каротиноидов и липидов с поверхности кристаллов феофитина .
Затем очищенный феофитин растворяют и подвергают омылению щелочью в отсутствие кислорода, например, в токе азота. При этом в реакционной массе образуется целевой продукт хлорин е6. Для выделения хлорина е6 реакционную смесь нейтрализуют соляной кислотой, взятой согласно изобретению в количестве 50-55 мл на 1 л реакционной массы до выпадения кристаллов хлорина е6, которые отделяют фильтрованием.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать из 1 кг биомассы цианобактерий 3,5 г хлорина е6 с чистотой не менее 90% при расходе концентрированной соляной кислоты в количестве 220 мл на 1 г целевого продукта, что в 10 раз меньше количества кислоты, используемого в способе-аналоге.
П р и м е р 1. Биомассу цианобактерий рода Spirulina выращивают в закрытом стеклянном ферментере в условиях солнечного или искусственного освещения на жидкой питательной среде, представляющей собой водный раствор солей, содержащих макро- и микроэлементы, необходимые для интенсивного культивирования цианобактерий. Питательная среда имеет водородный показатель от 8,0 до 12,0. Источником углерода служит углекислый газ, периодически вводимый в питательную среду. После достижения в суспензии определенной концентрации клеток (2,5-3,0 г/л) биомассу цианобактерий отделяют от питательной среды фильтрованием. 1 кг полученной таким образом биомассы цианобактерий с влажностью 75-80% заливают 2,5 л подогретого до 60оС щелочного раствора этилового спирта, полученного при растворении 4 г NaHCO3 в 1 л дистиллированной воды и последующем смешении с этиловым спиртом в соотношении 1:3 соответственно.
Смесь биомассы с указанным раствором перемешивают в течение 3-5 мин, после чего фильтруют. Биомассу на фильтре трижды экстрагируют этиловым спиртом, экстракты, содержащие хлорофилл , суммируют и обрабатывают ледяной уксусной кислотой из расчета 1,5 мл на 1 л экстракта. Образовавшиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают гексаном. Выход феофитина составляет 10 г.
Феофитин в количестве 10 г растворяют в 3 л спирта при кипячении в токе азота, добавляют 400 г КОН и проводят реакцию омыления в течение 10 мин. После этого смесь нейтрализуют раствором, содержащим 45 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л реакционной смеси, до образования кристаллов хлорина е6.
Реакционную смесь фильтруют. Кристаллы сушат на воздухе без доступа света. Чистота полученного продукта 92%
П р и м е р 2. Используют биомассу цианобактерий, полученную в условиях, аналогичных указанным в примере 1.
1 кг названной биомассы цианобактерий заливают 1,5 л щелочного раствора этилового спирта, который получают при растворении 40 мл 1 н. NaOH в 1 л дистиллированной воды и последующем смешивании с этиловым спиртом в соотношении 1 к 2 соответственно.
Смесь биомассы с указанным раствором перемешивают в течение 3-5 мин, фильтруют, биомассу трижды экстрагируют этиловым спиртом для извлечения хлорофилла . Экстракты объединяют и добавляют по 1,2 мл концентрированной HCl на каждый литр экстракта. Образующиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают на фильтре гексаном. Выход феофитина составляет 10 г. 10 г феофитина растворяют в 3,3 л этилового спирта при кипячении, затем добавляют 400 г КОН и проводят реакцию омыления в течение 10 мин в вакууме. После этого реакционную смесь нейтрализуют раствором соляной кислоты до рН 6-7. Расход концентрированной соляной кислоты при этом составляет 55 мл.
Кристаллы хлорина е6 из реакционной смеси фильтруют и сушат. Вес полученного хлорина 3,6 г. Чистота полученного продукта 91%
П р и м е р 3. Используют биомассу цианобактерий, полученную в условиях, аналогичных указанным в примере 1, при культивировании штамма Spirulina species Fr-A 127.
Спиртовой экстракт хлорофилла получают, как указано в примере 1. На 1 л этого экстракта добавляют 2 мл 1,0 н. щавелевой кислоты. Образующиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают на фильтре гексаном. Выход феофитина составляет 9,7 г.
Полученный феофитин омыляют, как указано в примерах 1 и 2. Выход хлорина е6 составляет 3,3 г при чистоте 90%
Формула изобретения: 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13-ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2-ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ, включающий экстракцию хлорофилла из растительного сырья, обработку экстракта кислотой с последующим щелочным гидролизом и выделением целевого продукта в виде кислоты или соли, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют биомассу цианобактерий, которую предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, после обработки экстракта хлорофилла кислотой получаемый продукт отфильтровывают и промывают неполярным органическим растворителем и подвергают щелочному гидролизу в вакууме.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют биомассу цианобактерий рода Spirulina.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что используют биомассу цианобактерий рода Spirulina, выращенных на свету в контролируемых условиях на питательных средах, имеющих pH 8,0 - 12,0.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве щелочи используют гидроксиды или карбонаты щелочных металлов.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного органического растворителя используют гексан.