Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: в медицине. Сущность изобретения: уропорфирин получают ферментативной трансформацией 5-аминолевулиновой кислоты, которую осуществляют препаратом биомассы клеток Arthrobacter globiformis ВКМ-658, полученным путем обработки клеток ацетоном, охлажденным до температуры ниже минус 20oС (ацетоновый порошок). 2 ил., 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2054485
Класс(ы) патента: C12P17/16
Номер заявки: 92009671/13
Дата подачи заявки: 04.12.1992
Дата публикации: 20.02.1996
Заявитель(и): Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Автор(ы): Быховский В.Я.; Зайцева З.И.; Радина В.П.; Румянцева В.Д.; Миронов А.Ф.; Малков М.А.; Полатовская О.Г.; Барабанщикова Г.В.
Патентообладатель(и): Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к методам получения порфиринов путем микробиологического синтеза. Оно может быть использовано в медицине, где порфирины можно использовать как стандарты при анализе эндогенных порфиринов, в качестве люминесцентной метки при проведении иммуноанализа; в пищевой промышленности как красители; в других отраслях промышленности в качестве катализаторов окислительно-восстановительных реакций, каталитической реакции передачи цепи при радикальной полимеризации и аналитических реагентов при обнаружении ионов тяжелых металлов.
Известны способы получения смеси порфиринов, содержащей уропорфирин и копропорфирин, путем культивирования бактерий рода Arthrobacter hyalinus Arthrobacter pascens. Дальнейшее разделение порфиринов проводится высаживанием их из культуральной жидкости при различных значениях рН. Копропорфирин III выпадает в осадок в интервале рН 4-6, а уропорфирин III высаживают при рН 1-4. Эти методы не дают высокой степени очистки обоих порфиринов.
Согласно другому способу те же культуры в присутствии L-цистеина продуцируют уропорфирин III, время инкубации составляет от 2 до 30 дней. Недостатками этих способов являются длительный срок инкубирования, сопряженный с возможностью заражения культуры посторонней микрофлорой, а также образование смеси порфиринов, содержащей от 4 до 8 свободных карбоксильных групп, разделение которой потребовало создания специального полимерного носителя.
Наиболее близким решением, выбранным за прототип, является способ получения уропорфирина, основанный на энзиматической трансформации 5-аминолевулиновой кислоты, осуществляемой препаратом, полученным путем обработки биомассы трехсуточной культуры Propionibacterium shermanii M-82 ацетоном, охлажденным до -20оС. Содержание уропорфирина составило 20 мг/л в расчете на 5-АЛК. Соотношение изомеров уропорфирина I и III, определенное с помощью ВЭЖХ, составило 4:1.
Недостатком этого метода является низкое содержание уропорфирина в культуральной жидкости, что затрудняет его выделение прямым осаждением и требует применения ионообменных смол, талька и других материалов.
Целью изобретения является повышение содержания уропорфирина в культуральной жидкости, создание устойчивого ферментного препарата, подлежащего длительному хранению (до 3 месяцев) для использования его по мере надобности.
Предлагаемый способ заключается в том, что ферментативную трансформацию 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) осуществляют сухим препаратом биомассы культуры Arthrobacter globiformis BKM-658 (известный коллекционный штамм, применяется как продуцент копропорфирина, авт. св. СССР N 1482946), приготовленным путем обработки клеток этой культуры ацетоном, охлажденным до -20оС и ниже. Саму культуру выращивают в течение 6 сут при 28оС на среде, содержащей кукурузный экстракт или пептон. По окончании выращивания культуры клетки отделяют, промывают, центрифугируют. Отмытые клетки обрабатывают ацетоном, охлажденным до (-20)- (-25)оС и ниже. Осадок ("ацетоновый порошок") отфильтровывают, сушат, хранят при -5оС. Ферментный препарат с 5-АЛК инкубирую в фосфатном буфере в течение 48 ч. При этом происходит трансформация 5-АЛК (I) в уропорфирин (II),
III
содержание которого в культуральной жидкости составляет 200-220 мг/л. Способ позволяет получать уропорфирин, свободный от других карбоксилсодержащих порфиринов с достаточно высоким выходом, сокращает время инкубирования и расход сырья. Синтезируемый продукт состоит из смеси изомеров стадии I и III. С помощью метода ВЭЖХ установлено, что соотношение изомеров I и III уропорфирина составляет 4: 1. Наличие в смеси только уропорфирина и отсутствие копропорфирина показано с помощью физико-химических методов.
Последовательность операций осуществления данного способа изложена в примере.
П р и м е р 1. Культуру Arthrobacter globiformis BKM-658 выращивают в течение 6 сут при 28оС на среде следующего состава, глюкоза 1% кукурузный экстракт 6% аммоний сернокислый 0,1% Выращивание проводят в колбах Эрленмейера на 750 мл, заполненных 100 мл опытной среды, на качалках со скоростью встряхивания 180 об/мин. рН среды 7,2-7,4. Всего в опыте было 10 колб с общим объемом среды 1,0 л. Через 3 сут. выращивания проводят корректировку рН среды до 7,2-7,4 с помощью 10%-ного раствора бикарбоната натрия. Одновременно вносят 1,0% глюкозы. Эта процедура повторяется ежедневно до окончания культивирования.
По окончании выращивания культура из 10 колб объединяется в одной емкости и клетки отделяют на центрифуге с охлаждением (4оС) при 5000 об/мин в течение 15 мин. Отделенные клетки промывают 3-4 раза по 500 мл 0,05 М калий-натрий-фосфатным буфером (рН 7,2-7,4), содержащим хлорамфеникол в количестве 20 мг/100 мл буфера. Отмывание проводят до полного отсутствия флуоресценции в ультрафиолетовом свете порфиринов, представленных в основном копропорфирином III, в промывных водах. Центрифугирование во всех случаях проводят на центрифуге с охлаждением (4оС).
Отмытые клетки суспендируют в 150 мл вышеупомянутого фосфатного буфера (консистенция густой сметаны) и при помешивании вливают в стакан с 2,0 л ацетона, предварительно охлажденного в камере с сухим льдом до -25оС. Полученный осадок после 30-минутного выдерживания при -25оС и помешивании отделяют на воронке Бюхнера и тщательно отмывают охлажденным до -25оС ацетоном до отсутствия флуоресценции порфиринов в фильтрате.
Препарат переносят с воронки Бюхнера на чашку Петри и высушивают в эксикаторе, заполненном безводным хлористым кальцием и парафином, при 4оС.
В результате из 1,0 л растущей культуры Arthrоbacter globiformis было получено 60 г сырой биомассы, а из последней 7,0 г конечного сухого препарата ("ацетонового" порошка).
1,0 г ацетонового порошка растирают в фарфоровой ступке в 250 мл КNa-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 20 мг/100 мл хлорамфеникола и 60 мг/100 мл восстановленного глутатиона.
После 30 мин прединкубации вышеупомянутой смеси при 37оС в нее вносят 5-АЛК в количестве 30 мг/100 мл и продолжают инкубацию в течение 48 ч при 37оС.
По окончании инкубации добавляют к смеси раствор трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 5% Смесь выдерживают на холоду (4оС) в течение 1 ч и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Осадок отделяют и в супернатанте определяют содержание порфиринов. В данном примере 50 мг в 250 мл супернатанта. Последний разбавляют в 3 раза дистиллированной водой.
К 750 мл водного раствора порфирина добавляют 40%-ный раствор едкого натра до рН 3,0. Оставляют на сутки при (4оС), выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой с рН 3,0 и сушат в эксикаторе над серной кислотой. Полноту высаживания уропорфирина из культуральной жидкости проверяют спектрофотометрически по полосе Соре. Высушенный уропорфирин этерифицируют смесью метанол серная кислота (95:5, v/v) в течение 1 сут. Реакционную массу разбавляют водой, октаметиловый эфир уропорфирина экстрагируют хлороформом и очищают хроматографией на окиси алюминия III степени активности (проявитель хлороформ). После упаривания растворителя вещество перекристаллизовывают из смеси хлороформ метанол (1:5, v/v). Вес 39 мг (что соответствует содержанию в исходном растворе 280 мг/л): т.пл. 300-302оС. Т.пл. ОМЭ уропорфирина III 265oC, т. пл. ОМЭ уропорфирина I 302oC. Электронный спектр, λмакс. (ε х 10-3), нм: 404 (217), 500 (15,74), 534 (9,45), 570 (6,87), 625 (4,17). Масс-спектр, м.в.рассч. 943,0; м.в.найд. 942,2. Найдено, C 61,00; H 5,78; N 5,87. C48H54N4O16. Вычислено, C 61,14; H 5,77; N 5,94.
ТСХ на пластинках "Алуфол" в системе хлороформ гексан (4:1) Rf 0,65. На пластинках "Силуфол" в системе хлороформ метанол (9,5:0,5) Rf 0,4.
Для установления изомерного состава ОМЭ уропорфирина его омыляют 25%-ной соляной кислотой. Идентификацию проводят с кислотами уропорфирина I и уропорфирина III фирмы Sigma и образцом, полученным из пера турако на пластинках "HPTLC Kieselgel 60F 254" в системе хлороформ метанол вода (65:25:4) и на пластинках с целлюлозой в системе 2,6-лутидин вода (5:3,5), насыщ. парами NH3. Оказалось, что уропорфирин, полученный микробиологическим путем, является смесью изомеров уропорфирина. Окончательная идентификация изомерного состава уропорфирина подтверждена с помощью ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе НР 1090М (Hewlett Packard) в условиях разделения. Колонка ODS Hypersil, 5 мкм, 2,1 х 100 мм. Скорость потока 0,25 мл/мин. Элюент: A 1 M ацетат аммония, рН 5,18; Б метанол.
На фиг.1 и 2 приведены хроматограммы смеси стандартов порфиринов уропорфиринов I, III; копропорфиринов I, III; протопорфирина IX (фиг.1) и изомеров уропорфирина I, III (фиг.2) (таблица).
Формула изобретения: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОПОРФИРИНА, предусматривающий ферментативную трансформацию 5-аминолевулиновой кислоты сухим препаратом биомассы клеток микроорганизмов, полученным обработкой клеток ацетоном, охлажденным до температуры ниже минус 20oС, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют культуру Arthrobacter globiformis ВКМ-658.