Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ГОМОЛОГИ 1α - ГИДРОКСИВИТАМИНА D3 С НЕНАСЫЩЕННОЙ БОКОВОЙ ЦЕПЬЮ, КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБСТВУЮЩАЯ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА
ГОМОЛОГИ 1α - ГИДРОКСИВИТАМИНА D3 С НЕНАСЫЩЕННОЙ БОКОВОЙ ЦЕПЬЮ, КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБСТВУЮЩАЯ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА

ГОМОЛОГИ 1α - ГИДРОКСИВИТАМИНА D3 С НЕНАСЫЩЕННОЙ БОКОВОЙ ЦЕПЬЮ, КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБСТВУЮЩАЯ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ И УСИЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: в медицине, как соединения, обладающие биологической активностью. Сущность изобретения: гомологи 1 Альфа-гидроксивитамина D3 с ненасыщенной боковой цепью, композиция, способствующая стимуляции и усилению дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека, содержит в качестве активного вещества гомологи 1 Альфа-гидроксивитамина D3. Способ стимулирования и усиления дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека включает введение по меньшей мере одного из гомологов 1-гидроксивитамина D3. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2057117
Класс(ы) патента: C07C401/00, A61K31/59
Номер заявки: 4742994/04
Дата подачи заявки: 18.04.1989
Дата публикации: 27.03.1996
Заявитель(и): Висконсин Алюмни Рисерч Фаундейшн (US)
Автор(ы): Гектор Ф. Делюка[US]; Генрих К. Шноес[DE]; Кейто Л. Перлман[US]
Патентообладатель(и): Висконсин Алюмни Рисерч Фаундейшн (US)
Описание изобретения: Изобретение относится к новым производным витамина D, проявляющим особую активность в стимулировании дифференциации злокачественных и здоровых клеток, конкретно к ненасыщенным в боковой цепи и с удлиненной боковой цепью аналогам 1 α 25-дигидроксивитамину D3 (1,25-(ОН)2D3), проявляющим селективность действия в качестве противоопухолевых средств за счет повышения активности в дифференциации злокачественных клеток и существенно сниженной активности в метаболизме кальция.
Активность витаминов D (витамины D3 или D2) в регулировании метаболизма кальция и нормального развития и роста костной ткани требует метаболизма основного витамина в определенные гидроксилированные формы. Установлено, что 1 α 25-дигидроксивитамин D3 (1,25-(ОН)2D3)-дигидроксилированный метаболит, образующийся обычно из витамина D3 в человеке или животном, представляет собой активное вещество, ответственное за стимуляцию переноса кальция в кишечнике и ресорбцию кальция из костей (костная мобилизация) с регулированием в результате общего содержания кальция в организме (такое связанное с кальцием действие метаболитов или аналогов витамина D в последующем будет называться общим термином кальцемическая активность или кальцемическое действие соединений). Некоторые структурные аналоги 1,25-(ОН)2D3, такие как 1 α-гидроксивитамин D3, 1 α-гидроксивитамин D2, 1 α 25-дигидроксивитамин D2 или фторзамещенные производные 1,25-(ОН)2D3 известны в качестве высокоактивных кальцемических средств, вследствие чего 1,25-(ОН)2D3 и его активные аналоги использовались или были предложены к использованию в качестве лекарств для профилактики или лечения различных нарушений метаболизма кальция в костной ткани, таких как почечная остеодистрофия, устойчивые к витамину D рахиты или остеопороз и связанные с ним заболевания.
Недавно обнаружено, что помимо своего хорошо известного кальцемического действия 1,25-(ОН)2D3 выполняет также и другие биологические функции. К примеру, было найдено, что 1,25-(ОН)2 D3 и близкие его аналоги (1 α -ОН-D3), 1,25-(ОН)2D2, фторзамещенные аналоги и т.д.) способны стимулировать клеточную дифференциацию [1,2] В частности, было найдено, что 1,25-(ОН)2 и его аналоги замедляют пролиферацию злокачественных клеток в культуре (например, клеток лейкемии человека) и стимулируют их дифференциацию от нормальных макрафагового типа клеток (такой тип активности в дальнейшем будет называться дифференциативной активностью производных витамина D). Вследствие их заметной активности в качестве стимулирующих дифференциацию средств такие производные витамина D потенциально применимы в качестве противораковых средств, их применение для лечения лейкемии человека действительно предлагалось [3] Хотя эти соединения высокоэффективны при дифференциации злокачественных клеток в культуре, тем не менее их столь же сильное кальцемическое действие in vivo ограничивает или препятствует их применению в качестве практических противораковых средств. Таким образом 1,25-(ОН)2 D3 и его фторированные производные являются чрезвычайно мощными средствами дифференциации клеток, но они также являются наиболее сильнодействующими соединениями с точки зрения кальцемической активности и в количествах, необходимых in vivo для эффективного использования в качестве противораковых (например, противолейкемических) средств, те же самые соединения могут привести к опасно высокому уровню кальция в крови вследствие присущей им кальцемической активности. Другие известные производные витамина D показывают аналогичную связь между дифференциативной и кальцемической активностями, так что их практическое применение в качестве протираковых средств также ограничено и опасно.
Эти наблюдения ясно указали на необходимость исследований и стимулировали такие исследования, связанные с поиском соединений с большей специфичностью и избирательностью действия в качестве противораковых средств, т.е. соединений с улучшенным соотношением дифференциативной/кальцемической активностей. Недавно проведенные работы привели к получению нескольких аналогов витамина D с усиленной дифференциативной активностью. Например, было найдено, что определенные гомологи 1,25-(ОН)2 D3, у которых боковая цепь удлинена на один атом углерода (в середине или на конце цепи), проявляют заметно более высокую дифференциативную активность (примерно в 10 раз выше) для клеток лейкемии в культуре по сравнению с самим 1,25-(ОН)2 D3 [4-6] Однако эти гомологи все еще остаются чрезвычайно сильными кальцемическими средствами с кальцемической активностью, примерно одинаковой с активностью 1,25-(ОН)2D3. Таким образом эти соединения характеризуются улучшенным соотношением дифференциативная/кальцемическая активности, но для них не преодолены затруднения, связанные с нежелательно сильным кальцемическим действием. Были получены и другие родственные витамину D соединения, обладающие дифференциативной активностью [7] но по своему строению они отличны от предлагаемых соединений.
Обнаружены родственные витамину D соединения, обладающие необходимой и перспективной активностью с точки зрения дифференциации в сравнении с их кальцемической активностью. Такие новые аналоги витамина обладают очень заметной активностью по замедлению пролиферации злокачественных клеток и стимулирования их дифференциации от нормальных моноцитного типа клеток (одинаковая или более высокая, чем у 1,25-(ОН)2 D3 активность), но эти соединения менее активны, чем 1,25-(ОН)2 D3 с точки зрения их кальцемического действия. Таким образом эти новые соединения обладают неожиданно улучшенным соотношением дифференциативной/кальцемической активностей, вследствие чего эти соединения являются предпочтительными средствами для лечения раковых заболеваний. Обладая высокой активностью по стимулированию дифференциации, но гораздо меньшей активностью в качестве кальцемических средств, данные соединения могут быть введены в организм без чрезмерного повышения уровня кальция в крови, в результате чего основная практическая проблема, связанная с высокой кальцемической активностью, оказывается преодоленной.
Новые соединения с точки зрения их строения характеризуются, как имеющие ненасыщенность в боковой цепи гомологи 1,25-(ОН)2 D3 и боковая цепь удлинена внедрением двух или трех метиленовых звеньев в углеродную цепь. Соединения могут быть представлены нижеследующей общей формулой:

Конкретные и предпочтительные примеры таких соединений включают: 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3, т.е. соединения вышеприведенной формулы, где Х, Y и Z представляют водород и n=3, и 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3, т.е. соединение вышеприведенной формулы, где Х, Y и Z представляют водород и n=4.
Эти новые соединения родственны имеющему ненасыщенность в боковой цепи 24-гомовитамину D3 [4] Однако новые соединения отличны по своим структурным и биологическим показателям. Различие в строении заключается в наличии ненасыщенной боковой цепи, модифицированной внедрением двух или трех метиленовых звеньев, а с биологической точки зрения соединения характеризуются как очень сильные клеточные дифференциативные средства, не обладающие значительно сниженной кальцемической активностью.
Получение новых соединений. Способы синтеза новых соединений изобретения отражены схемами 1, 2 и 3. На схеме 1 получение промежуточного 1 α-гидроксивитамин D-22-альдегида, который в реакции с поставляющим боковую цепь соответствующим алкилфенилсульфоном (схема способа синтеза 2) образует целевые гомологи витамин D (например, соответственно соединения (25) и (26) Схема 3 иллюстрирует получение алкилфенилсульфонов, необходимых для образования боковой цепи. Экспериментальные подробности осуществления стадий химического процесса, отраженного схемами, приведены в нижеследующих конкретных примерах. Соединения, обозначенные арабскими цифрами (например, соединение 1,2,3 и т.д.) в примерах, относятся к формулам с теми же номерами на схемах.
Общие методики.
3 β -ацетокси-22,23-биснор-5-холевая кислота (1) получена от Steroids (Уилтон, NH). Все другие химикаты были лучшего качества продажными продуктами. Растворители очищены стандартными методами.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляют на предварительно покрытых силикагелем алюминиевых пластинках с УФ-индикацией с помощью ЕМ Science (Гиббстаун, шт. Нью-Йорк). Использованы следующие системы растворителей: А хлороформэтанол (85:15 об/об); В-гексан-этилацетат (1:1) и С-гексан-этилацетат (3:1).
Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляют с применением жидкостного хроматографа фирмы Waters Associates, снабженного системой подачи растворителя модели 6000А, универсальным инжектором модели 6VК и детектором с переменной длиной волны модели 450. Используют колонки Зорбакс-Сил (Phenomenex) (6,2 мм х 25 см и 10 мм х 25 см). Системы растворителей: А 3% 2-пропанола в гексане; В 2% 2-пропанола в гексане; С 6% 2-пропанола в гексане; D 10% 2-пропанола в гексане; Е 20% 2-пропанола в гексане. Для предварительного фильтрования образцов ВЭЖХ применяют патроны с силикагелем Сер-Пак (Waters Associates).
Масс-спектры при бомбардировке электронами (МС) записывались при 70 еV на масс-спектрометра Kratos MS-50 ТС, снабженном записывающей системой Kratos DS-55.
Ультрафиолетовые (УФ) спектры поглощения регистрировались в видимой области на спектрофотометре Hitachi модель 60-100.
Спектры в инфракрасной области регистрировались на спектрометре Nicolet МХ-1 ГТ-1Р с применением пленок маслянистых веществ или растворов в четыреххлористом углероде.
Спектры протонного магнитного резонанса (IH-ЯМР) снимались на приборе Bruker 270 при 400 или 50 МГц в растворах CDCl3, содержащих в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилан (ТМС).
П р и м е р 1. Синтез защищенного С-22 альдегида (соединение 18, схема 1).
Альдегид синтезируют по общей методике Kulner и др. (Tetr. Letters 28, 6129-32, 1987). Соединение (1) (10 г) растворяют в 420 мл 5%-ного КОН в метаноле, и раствор перемешивают 15 мин при комнатной температуре до прекращения обнаруживания исходного соединения с помощью ТСХ (система растворителей А). К полученному раствору по каплям прибавляют 160 мл 10%-ной серной кислоты в метаноле при перемешивании и образовавшуюся суспензию разбавляют 400 мл 1%-ной серной кислотой в метаноле. Смесь кипятят 48 ч для завершения этерификации (ТСХ, система растворителей А). Соединение (2) (сложный эфир) экстрагируют этилацетатом, органическую фазу промывают 5% NaHCO3, насыщенным NaCl и сушат над сульфатом магния. Полученное соединение (2) (0 г, 88%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору соединения (2) (4,4 г, 12 ммоля) в 135 мл сухого диметилформамида (ДМФА) добавляют имидазол (3,6 г, 52,8 ммоля), затем трет-бутилдиметилсилилхлорид (4 г, 26,4 ммоля). Раствор перемешивают 5 мин при комнатной температуре до момента образования объемистого осадка, после чего перемешивание продолжают еще 15 мин. Реакционную смесь экстрагируют гексаном (400 мл), промывают водой, насыщенным раствором NaCl и сушат над сульфатом магния. После испарения растворителя получают по данным ТСХ (система растворителей В) продукт (соединение (3), 5,3 г, 91%), использованный на следующей стадии без дополнительной очистки. Аналитический образец получают вытеснительной хроматографией с применением 2% этилацетата в гексане.
Смесь соединения (3) (1 г, 2,1 ммоля) двубромистого олова (0,42 г, 1,5 ммоля) и безводного бикарбоната натрия (0,91 г, 10 ммолей) в 20 мл гексана кипятят 30 мин в атмосфере азота до исчезновения исходного соединения (3) (ТСХ, система растворителей С). Осадок отфильтровывают, а раствор сушат при пониженном давлении. Остаток вновь растворяют в 5 мл безводного ТГФ, добавляют тетрабутиламмонийбромид (0,06 г, 0,19 ммоля), и смесь перемешивают 30 мин при комнатной температуре в атмосфере азота. Затем добавляют раствор тетрабутиламмонийфторида (10 мл, 1 М в ТГФ), затем добавляют 0,7 мл с-коллидина, и смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляют еще 5 мл раствора тетрабутиламмонийфторида и перемешивание продолжают 3 ч. Добавляют эфир (50 мл), и органическую фазу промывают водой, холодной 1 н, НСl, 10% NaHCO3 и сушат над безводным сульфатом магния. Полученное соединение (3) (0,44 г, 58%) растворяют в бензоле, хроматографируют на силикагеле (70-230 меш, 30 г) и элюируют с помощью этилацетата в гексане. Аналитический образец получают ВЭЖХ (система А, 77 мл);
ИК (пленка): 1737, 1604, 1495, 1082, 1030 см-1;
УФ (3% 2-пропанола в гексане) γmax 262 нм ( ε 7000), γmax 272 нм ( ε 9800), γmax 282 нм ( ε 10500), γmax 293 нм ( ε 6000);
1Н-ЯМР (CICl3) δ 0,54 (3Н, с, 18-СН3), 0,94 (3Н, с, 18-СН3), 0,94 (3Н, с, 19-СН3), 1,22 (3Н, д, J 6 Гц, 2-СН3), 3,6 (1Н, м, 3-Н), 3,68 (3Н, с, СО2СН3), 5,42 (1Н, м, 6-Н), 5,58 (1Н, м, 7-Н), МС m/3 (относительная интенсивность): 358 (61), 340 (12), 325 (100), 299 (68), 271 (7), 253 (17), 237 (26), 211 (27), 143 (72), 119 (35).
Раствор соединения (4) (830 мг, 2,3 ммоля) в 350 мл смеси бензол-этиловый эфир (1:4 об/об) облучают при перемешивании 40 мин (4х10 мин) в атмосфере азота в охлаждаемой водой погруженной ячейке, снабженной барботером для азота и викоровым фильтром, с помощью УФ-лампы среднего диаметра На novia 608А36. Ход реакции контролируют с помощью ВЭЖХ с применением 2% 2-пропанола в гексане при 265 нм. Раствор испаряют при пониженном давлении, вновь растворяют в 100 мл абсолютного этанола и кипятят 3 ч в атмосфере азота. Затем раствор концентрируют, вновь растворяют в 1 мл 10% этилацетата в гексане и хроматографируют на силикагеле (70-230 меш, 30 г). Сложный эфир витамина (5) (298 мг, 36%) элюируют смесью 15% этилацетата в гексане. Аналитический образец получают ВЭЖХ (система В, Rv 94 мл);
ИК (пленка): 1738 см-1;
УФ (ЕtOH): γmax 264 нм, γmin 228 нм;
IН-ЯМР (CDCl3) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН3), 1,2 (3Н, д, J 7 Гц, 21-СН3), 3,66 (3Н, с, СО2СН3), 3,95 (1Н, м, 3-Н), 4,8 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19 Z-H), 5,05 (1Н, д, I 1,2 Гц, 19Е-Н), 6,03 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,23 (1Н, д, J 11 Гц, 6-Н), МС m/з (относительная интенсивность): М+ 358 (45), 340 (9), 325 (45), 299 (22), 253 (19), 237 (18), 136 (60), 118 (100).
Раствор соединения (5) (10 мг, 0,028 ммоля) в 5 мл сухого толуола охлаждают в атмосфере азота до -70оС в бане с сухим льдом в ацетоне. К охлажденному раствору по каплям при перемешивании добавляют диизобутилалюминийгидрид (ДИБАЛ-Н, 50 мкл, 25%-ный раствор в толуоле, 0,088 ммоля), реакционную смесь перемешивают 10 мин при -70оС, после чего медленно прибавляют метанол (2 мл). Смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, разбавляют этиловым эфиром и промывают 5%-ным НСl, 5%-ным NaHCO3, водой, насыщенным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом магния. Хроматографией на силикагеле (15% этилацетата в гексане) получают соединение (6) (4,9 мг, 54%) со следующими спектральными характеристиками. МС: 328 (М+, 29), 310 (5), 295 (31), 269 (11), 253 (6), 136 (47), 118 (86), 29 (100);
1Н-ЯМР (СDCl3) δ 0,59 (3Н, с, 18-СН3), 1,14 (3Н, д. J 7 Гц, 21-СН3), 4 (1Н, м, 3-Н), 4,81 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 5,05 (1Н, д, J= 1,2 Гц, 19 Z-H), 6,05 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,23 (1H, д, J=11 Гц, 6-H), 9,58 (1Н, д, J 3,8 Гц, 22-Н).
Дальнейшее элюирование колонки с силикагелем 5% 2-пропанола в гексане приводит к получению С-22-спирт (соединение (7), 2,7 мг, 29%).
Соединение (5) превращают в соединение (8) обработкой 20 ч при 4оС n-толуолсульфонилхлоридом в пиридине. Соединение (8) (102 мг, 0,2 ммоля) растворяют в мл безводного дихлорметана, и полученный раствор при перемешивании и 55оС прибавляют к метанольному раствору (15 мл) безводного бикарбоната калия (250 мг). Смесь перемешивают 24 ч при 55оС, после чего растворители удаляют при пониженном давлении, а остаток экстрагируют эфиром. Органическую фазу промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Полученное соединение (9) (50 мг, 68%) очищают хроматографией на силикагеле с применением 20% этилацетата в гексане.
К суспензии двуокиси селена (9 мг, 0,8 ммоля) в 2 мл сухого метиленхлорида добавляют гидроперекись трет-бутила (112 мкл, 3 М раствор в толуоле, 0,34 ммоля), смесь перемешивают при комнатной температуре в азоте до образования прозрачного раствора. Затем добавляют безводный пиридин (12 мкл, 0,15 ммоля) и вслед соединение (9) (50 мг), растворенное в 2 мл безводного дихлорметана. Смесь перемешивают в атмосфере азота 30 мин, добавляют холодный раствор 10% бикарбоната натрия (2 мл) и экстрагируют эфиром. Органическую фазу промывают холодным 10%-ным раствором бикарбоната натрия, ледяной водой и сушат над безводным сульфатом магния. Хроматографией на силикагеле (10-20% этилацетата в гексане) получают 12,5 мг соединения (10), которое тут же растворяют в 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, полученный раствор нагревают при перемешивании 15 мин при 55оС в азоте. Реакционную смесь переносят на лед, экстрагируют эфиром и промывают ледяным насыщенным раствором бикарбоната натрия. Объединенные эфирные экстракты промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Аналитические образцы (5,7Е) и (5Е, 7E) изомеров соединений (11) (12) соответственно получены препаративной ВЭЖХ в отношении 2,5:1.
Соединение 11. ВЭЖХ: Rv 68 мл;
УФ (Е107Н): γmax 264 нм, γmin 227 нм, A264 2,07; A 227.
1Н-ЯМР (СDСl3) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН3), 1,2 (3Н, д, J 6,5 Гц, 21-СН3), 2,04 (3Н, с, 3 β-ацетил), 3,66 (3Н, с, 22-СО2СН3), 4,4 (1Н, м, 1-Н), 5,2 (1Н, м, 3-Н), 5,01 (1Н, уш.с, 19Е-Н), 5,34 (1Н, уш, с, 19Z-H), 6,01 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,33 (1Н, д, J 10 Гц, 6-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 416 (М+, 4), 356 (100), 338 (21), 251 (13), 134 (95).
Соединение 12.
ВЭЖХ: Rv 78 мл;
УФ (ЕtOH): γmax 267 нм, γmin 227 нм, А267 3,51; А227
1Н, ЯМР (СDCl3) δ 0,56 (3Н, с, 18-СН3), 1,2 (3Н, д, J 6,5 Гц, 21-СН3), 2,04 (3Н, с, 3 β-ОАс), 3,66 (3Н, с, 22-СО2СН3), 4,5 (1Н, м, 1-Н), 5,3 (1Н, м, 3-Н), 4,99 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,13 (1Н, уш, с, 19Z-Н), 5,81 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,56 (1Н, д, J 10 Гц, 6-Н).
При получении в больших масштабах изомеры (11) и (12) могут быть также успешно и эффективно разделены с использованием малеинового ангидрида по методике (патент США N 4554106).
К раствору соединения (11) (2 мг) в 0,5 мл сухого толуола при -70оС и перемешивании в атмосфере азота прибавляют диизобутилалюминийгидрид (15 мкл, 1,5 М раствор в толуоле), смесь перемешивают 10 мин при -70оС, после чего для разложения металлоорганического комплекса медленно прибавляют метанол. Смесь нагревают до комнатной температуры и экстрагируют этиловым эфиром. Органическую фазу промывают водой и сушат над безводным сульфатом магния. Препаративной ВЭЖХ (система Е) получают соединения (13) и (14). Для соединения (13) получены следующие спектральные данные. МС:
344 (М+, 22), 326 (13), 311 (2), 285 (4), 269 (4), 152 (29) 134 (100);
1Н-ЯМР (СDCl3) δ 0,59 (3Н, с, 18-СН3), 1,15 (3Н, д, J 7 Гц, 21-СН3), 4,2 (1Н, м, 3-Н), 4,4 (1Н, м, 1-Н), 4,99 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19-Н), 5,31 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 6,02 (1Н, д, J 11 Гц, 7-Н), 6,36 (1Н, д, J 11 Гц, 6-Н), 9,56 (1Н, д, J 4 Гц, 22-Н).
К перемешиваемому раствору соединения (II) (100 мг, 0,24 ммоля) в этиловом эфире (10 мл) добавляют 0,1 н раствор КОН в метаноле (10 мл) и перемешивают 90 мин при комнатной температуре до исчезновения исходного соединения (ТСХ, система растворителей В). Соединение (15) выделено стандартной процедурой экстрагирования (этилацетат, насыщенный раствор NaCl, безводный сульфат магния) в виде бесцветного масла (86,2 мг, 96%).
Смесь имидазола (250 мг, 3,6 ммоля) и трет-бутилдиметилсилилхлорида (250 мг, 1,6 ммоля) в ДМФА (2 мл) добавляют к перемешиваемому раствору соединения (15) (86,2 мг, 0,23 ммоля), полученную однородную смесь перемешивают 15 мин при 55оС до исчезновения исходного соединения (ТСХ, система растворителей В). Продукт выделяют экстрагированием реакционной смеси гексаном. Органический экстракт промывают рассолом и сушат над безводным сульфатом магния. Фильтрованием гексанового раствора сырого продукта через патроны с силикагелем Сеп-Пак получают соединения (16) (136 мг, 98%).
ИК (пленка): 2974, 2930, 1736, 1447, 1286, 1258, 1150, 1085 см-1;
УФ (гексан): γmax 264 нм, γmin 227 нм, А264 1,91 А227
1Н-ЯМР (СDCl3) δ 0,07 (12Н, с, Si(CH3)2), 0,55 (3Н, с, 18-СН3), 0,86 (18Н, с, С(СН3)3), 1,2 (3Н, д, J 6-8 Гц, 21-СН3), 3,65 (3Н, с, 0-СН3), 4,18 1Н, м, 3-Н), 4,36 (1Н, м, 1-Н), 4,84 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Z-H), 5,16 (1Н, д, J 1,2 Гц, 19Е-Н), 5,96 (1Н, д, J 11,2 Гц, 7-Н), 6,19 (1Н, д, J 11,2 Гц, 6-Н); МС m/3 (интенсивности нормализованы к m/e 248): 602 (М+, 10), 470 (59), 413 (7), 338 (10), 248 (100).
К перемешиваемому раствору соединения (16) (136, 2 мг, 0,23 ммоля) в абсолютном ТГФ (5 мл) в атмосфере аргона при 0оС прибавляют литийалюминийгидрид (25 мг, 0,65 ммоля), образовавшуюся суспензию перемешивают 15 мин при 0оС, избыток литийалюминийгидрида разлагают прикапыванием 10% воды в ТГФ. Затем суспензию разбавляют 10 мл ТГФ и перемешивание продолжают еще 15 мин при комнатной температуре. Продукт выделяют обычной экстракцией этилацетатом. Соединение (17) получено с выходом 91% в виде бесцветного масла (118,4 мг).
ИК (пленка): 3450, 2952, 2886, 1447, 1258, 1105, 1085, 834 см-1;
УФ (ЕtOH): γmax 264 нм, γmin 227 нм, А 264 1,57; А227
1Н-ЯМР (СDCl3) δ 0,0 (12Н, с, Si-CH3), 0,53 (3Н, с, 18-СН3), 0,85 (18Н, с, Si-C(CH3)3), 1,04 (3Н, д, J 6,4 Гц, 21-СН3), 3,37 и 3,63 (1Н и 1Н, каждая м, 22-СН2), 4,17 (1Н, м, 3-Н), 4,35 (1Н, м, 1-Н), 4,84 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,16 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 6 (1Н, д, J=12,2 Гц), (7-Н), 6,21 (1Н, д, J 12,2 Гц, 6-Н); МС m/3 (интенсивности нормализованы к m/3 248): 574 (М+, 17), 442 (67), 383 (11), 308 (17), 248 (100).
К перемешиваемому раствору ДМСО (50 мкл, 0,7 ммоля) в 3 мл дихлорметана при -60оС в атмосфере азота прибавляют по каплям раствор оксалилхлорида (30 мкл, 0,34 ммоля) в 0,5 мл дихлорметана, полученный раствор перемешивают 10 мин при -60оС, после чего медленно прибавляют раствор соединения (17) (27 мг, 0,05 ммоля) в 1 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при -60оС, добавляют 0,2 мл триэтиламина и перемешивают еще 5 мин. Образовавшееся соединение (18) экстрагируют этиловым эфиром, органический экстракт промывают насыщенным раствором NaCl и сушат над безводным сульфатом магния. Фильтрованием через силикагель Сеп-Пак получают чистый по данным ТСХ продукт (17 мг, 62%).
ИК (пленка), 2954, 2929, 2884, 2857, 1727, 1472, 1375, 1256, 1085, 909, 880, 835 см-1;
ЯМР (СНСl3) δ 0,0 (12Н, с, Si-CH3), 0,6 (3Н, с, 18-СН3), 0,88 (18Н, с Si-C(CH3)3), 1,11 (3Н, д, J 6,9 Гц, 21-СН3), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 4,93 (1Н, уш.с, 19Z-H), 5,19 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 6,07 (1Н, д, J 10 Гц, 7-Н), 6,26 (1Н, д, J 10 Гц, 6-H), 9,54 (1Н, д, J3Гц, 22-Н);
УФ (гексан): γmax 264 нм, γmin 227 нм, А264 1,9, А227.
МС m/3 (интенсивности относительно m/3 248): 572 (М+, 13), 440 (53), 383 (11), 308 (14), 248 (100); точная молекулярная масса, вычисленная для С34Н60О3Si2 572,4081, найдено 572, 4117.
Улучшенные выходы альдегида (18) при проведении стадии окисления в следующих условиях. К перемешиваемому раствору 25 мкл (0,36 ммоля) диметилсульфоксида в 0,25 мл безводного дихлорметана при -60оС в атмосфере аргона прибавляют по каплям раствор 15 мкл (0,17 ммоля) оксалилхлорида в 0,75 мл безводного дихлорметана и после перемешивания смеси 10 мин при -60оС медленно прибавляют раствор 20,3 мг (0,035 ммоля) спирта (17) в 0,5 мл безводного дихлорметалла с быстрым ополаскиванием дополнительными 0,2 мл безводного дихлорметана. Смесь перемешивают 30 мин при -60оС и при той же температуре добавляют 0,3 мл (2,15 ммоля) триэтиламина. Смесь перемешивают еще 5 мин, нагревают до 0оС и экстрагируют эфиром. Эфирную фазу промывают рассолом и сушат (MgSO4). Фильтрованием через силикагель Сеп-Пак получают соединение (18) в виде бесцветного масла, которое очищают с помощью ВЭЖХ (Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% ЕtОAc в гексане) и получают чистый альдегид (18) (19 мг, 96% ), исходный спирт выделен только в виде следов (0,12 мг).
П р и м е р 2. Введение боковой цепи. Синтез 24-дигомо-1 α 25-дигидрокси-22-дегидровитамина D3 (cоединение 25, схема 2).
(а) Получение гидроксисульфона (19).
К перемешиваемому раствору 31 мг (84 мкмоля) 2-метил-6-(фенилсульфонил)-2-(триэтилсилиокси)гексана (соединение 31, схема 3) в 300 мкл безводного тетрагидрофурана (содержит 1,10-фенантролин в качестве индикатора) в атмосфере аргона при -78оС добавляют 13 мкл (90 мкмоль) диизопропиламина и затем 70 мкл Buli (1,3 М в гексане) (91 мкмоль), перемешивают 30 мин в тех же условиях, затем добавляют 6 мг С-22-альдегида (соединение 18) (10 мкмоль) в 300 мкмл безводного тетрагидрофурана и перемешивают 1 ч при -78оС. Смесь разлагают добавлением 1 мл насыщенного раствора NH4Cl, нагревают до 0оС и экстрагируют этилацетатом. Экстракт промывают водой, рассолом и сушат над MgSO4, фильтруют и испаряют. Препаративной ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,6х25 см, система растворителей 10% этилацетата в гексане) получают 0,6 мг непрореагировавшего альдегида и 6,6 мг гидроксисульфона (19) в виде смеси эпимеров (выход 77%).
(b) 24-дигомо-1, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3 (25)
К перемешиваемому раствору гидроксисульфона (19) (3,3 мг) в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют насыщенный раствор Na2HPO4 (1 мл) и затем безводный порошкообразный Na2HPO4 (160 мг). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 30 мин и охлаждают до 0оС. Затем добавляют свежеприготовленную 5%-ную амальгаму натрия (около 400 мг) и перемешивают 16 ч при 5оС. Смесь разбавляют 5 мл гексана, и перемешивание продолжают еще 15 мин. Растворители декантируют, твердое вещество промывают гексаном (3х5 мл), к объединенному органическому раствору добавляют лед и насыщенный раствор NaCl, органический слой отделяют и пропускают через патрон с Сеп-Пак в виде гексанового раствора. Очисткой ВЭЖХ получают 2 мг (71%) защищенного Δ22 -24-дигомо-1,25-(ОН)D3 (21) и небольшое количество 22-гидроксидированного продукта (22) (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% EtOAс в гексане). Защищенный триол (21) (2 мг) растворяют в 1 мл абсолютного ТГФ и к полученному раствору добавляют тетрабутиламмонийфторид (50 мкл 1 М раствор в ТГФ). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 1 ч при 50оС, затем добавляют эфир (8 мл), и органическую фазу промывают насыщенным раствором NaCl. Растворители удаляют, остаток растворяют в 10% 2-пропанола в гексане и фильтруют через окись кремния Сеп-Пак. ВЭЖХ (20% 2-пропанола в гексане, колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см) получают 0,6 мг целевого дигомопроизводного (25).
УФ (EtOH): γmax 264 нм, γmin А228 нм, А264 1,87 А228.
1Н-ЯМР (СDCl3) δ 0,55 (3Н, с, 18-СН3), 1 (3Н, д, J 6,6 Гц, 21-СН3), 1,23 (5Н, с, 26, 27-СН3), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 5 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,32 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,29 (2Н, м, 22-Н и 23-Н), 6,01 (1Н, д, J 11,3 Гц, 7-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 442 (М+, 15), 424 (23), 406 (33), 391 (7), 287 (11), 285 (10), 269 (27), 251 (23), 152 (33) 134 (100), 116 (6), 59 (20); точная молекулярная масса, вычисленная для С29Н46О3 442, 3446, найдено 442, 3441.
П р и м е р 3. Введение боковой цепи. Синтез 24-тригомо-1 α 25-дигидрокси-22- дегидровитамина D3.
Соединение 26 (схема 2).
(а) Получение гидроксисульфона (20).
К перемешиваемому раствору 58 мг (151 мкмоль) 2-метил-7-(фенилсульфонил)-2-(триэтилсилилокси)гептана (соединение 35, схема 3) в 500 мкл абсолютного тетрагидрофурана (содержащего 1,10-фенантролин в качестве индикатора) в атмосфере аргона при -78оС добавляют 23 мкл (160 мкмоль) диизопропиламина и затем 106 мкл н-BuLi (1,5 М в гексане) (160 мкмоль). Раствор перемешивают в тех же условиях 30 мин, после чего добавляют 7 мг С-22-альдегида (соединение 18) (12 мкмолей) в 300 мкл абсолютного тетрагидрофурана и перемешивают 1 ч. Смесь разлагают при -78оС добавлением 1 мл насыщенного раствора NH4Cl, нагревают до 0оС и экстрагируют этилацетатом. Экстракт промывают водой и рассолом, сушат над безводным MgSO4, фильтруют и испаряют. Препаративной ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, система растворителей 10% этилацетата в гексане) получают 0,4 мг непрореагировавшего альдегида и 7,5 мг гидроксисульфона (20) в виде смеси эпимеров (78%).
(b) 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3 (26).
К перемешиваемому раствору гидроксисульфона (20) (7,5 мг) в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют насыщенный раствор Na2HPO4 и затем 160 мг безводного Na2HPO4 в виде порошка. Смесь перемешивают 30 мин в атмосфере аргона и затем охлаждают до 0оС. Добавляют свежеприготовленную 5% амальгаму натрия (около 400 мг) и перемешивают 16 ч при 5оС. Затем смесь разбавляют 5 мл гексана, перемешивание продолжают еще 15 мин. Растворители декантируют, твердый продукт промывают гексаном (3х5 мл), объединенную органическую фазу промывают рассолом, отделяют, сушат и испаряют. Остаток пропускают через патрон Сеп-Пак в смеси 10% этилацетата в гексане. Очисткой с помощью ВЭЖХ получают 2,12 мг защищенного Δ 22-24-тригомо-1,25-(ОН)2D3 (23) и 1,33 мг 22-гидроксилированного продукта (24) (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 10% этилацетата в гексане). Соединение 23 (2,1 мг) растворяют в 1 мл абсолютного тетрагидрофурана и к полученному раствору добавляют 5 мкл тетрабутиламмонийфторида в тетрагидрофуране (1 М раствор). Смесь перемешивают в атмосфере аргона 1 ч при 50оС, затем добавляют эфир и органическую фазу промывают рассолом. Эфирную фазу сушат над безводным MgSO4, фильтруют и испаряют. Остаток растворяют в 30% 2-пропанола в гексане и пропускают через Сеп-Пак. Очисткой с помощью ВЭЖХ (колонка Зорбакс-Сил, 9,4х25 см, 20% 2-пропанола в гексане) получают целевое тригомо-производное 26 (0,8 мг),
УФ (ЕtОН): γmax 264 нм, γmin 228 нм, А264 1,81; А228
1Н-ЯМР (CDCl3) δ: 0,56 (3Н, с, 18-СН3), 1 (3Н, д, J 6,6 Гц, 21-СН3), 1,23 (6Н, с, 26, 27-СН3), 4,23 (1Н, м, 3-Н), 4,43 (1Н, м, 1-Н), 5 (1Н, уш, с, 19Z-H), 5,32 (1Н, уш, с, 19Е-Н), 5,29 (2Н, м, 22-Н и 23-Н), 6,01 (1Н, д, J 11,3 Гц, 7-Н); МС m/3 (относительная интенсивность): 456 (М+, 11), 438 (50), 420 (30), 402 (8), 287 (10), 269 (23), 251 (23), 152 (35), 134 (100).
П р и м е р 4. Синтез вводимого в виде боковой цепи сульфона (схема 3).
(а) Получение остатка сульфона боковой цепи.
К раствору метилмагнийбромида (12,9 мл, 3М раствор в эфире) в 25 мл сухого ТГФ при -10оС и интенсивном перемешивании прибавляют по каплям в течение 30 мин в атмосфере аргона раствор 4-хлорвалерилхлорида 27 (Aldrich 3 г, 19,2 ммоль). Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры (около 2 ч), разлагают водой и нейтрализуют разбавленной соляной кислотой. Смесь экстрагируют эфиром, объединенные органические слои промывают водой и сушат над сульфатом натрия. После удаления растворителя и разгонки остатка в вакууме получают хлорзамещенный спирт 28 в виде бесцветной жидкости (2,1 г, 70%). Хлорзамещенный спирт 28 (1,5 г, 10 ммоль) в безводном диметилформамиде (5 мл) добавляют к перемешиваемому раствору тиофенола (1,32 г, 12 ммоль) и трет-бутоксида калия (1,32 г, 11,3 ммоль) в безводном диметилформамиде (25 мл). Реакционную смесь перемешивают сутки при комнатной температуре, после чего раствор распределяют между дихлорметаном и водой. Органический слой промывают водным карбонатом натрия, водой и сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель испаряют в вакууме, а сырое масло очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью гексан-этилацетат. Получено 2,2 г (98%) сульфида 29 в виде бесцветной жидкости. Сульфид 29 (1,01 г, 4,5 ммоль) растворяют в сухом дихлорметане (40 мл) и к полученному раствору порциями при перемешивании и произвольном охлаждении добавляют 3-хлорнадбензойную кислоту (2,5 г, 11,6 ммоль; Aldrich 80-85%). Реакционную смесь перемешивают 2 ч и затем разлагают 10%-ным раствором бикарбоната натрия. Объединенные органические экстракты промывают водным сульфитом натрия и рассолом и сушат над сульфатом магния. Растворитель удаляют в вакууме и очисткой сырого масла вытеснительной хроматографией с элюированием смесями гексан-этилацетат получают сульфон 30 (1,1 г, 97%) в виде бесцветной жидкости. К перемешиваемому раствору сульфона 30 (1,3 г, 5,1 ммоль) и имидазола (1,5 г, 22,7 ммоль) в сухом диметилформамиде (50 мл) добавляют триэтилсилилхлорид (1,15 г, 7,7 ммоль), после чего смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре и разбавляют дихлорметаном. Смесь промывают водным раствором хлорида аммония и водой, органические слои сушат над сульфатом натрия и испаряют в вакууме. Остаток очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле. Первым гексаном вымывается гексаэтилдисилоксан. Триэтилсилилзащищенный сульфон 31 (1,8 г, 97%) элюируется смесью гексан-этилацетат (9:1) в виде бесцветной жидкости.
ИК (чистое вещество): 3045, 2940, 1440, 1360, 1130, 1020 см-1.
1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 0,518 (6Н, к, J 6,2 Гц, Si-CH2), 0,899 (9Н, т, 1 6,2 Гц, Si C-CH3), 1,142 (6Н, с, СН3), 1,307-1,462 (4Н, м), 1,655-1,738 (2Н, м, 4-Н), 3,08-3,122 (2Н, м, 2-Н), 7,567 (2Н, т, J 6,8 Гц, мета-Н-арил), 7,648 (1Н, т, J 6,8 Гц, пара-Н-арил), 7,916 (2Н, д, J 6,83 Гц, орто-Н-арил); МС (Е1, 70 еV) m/3 (относительная интенсивность) 372 (М+, 2), 341 (100), 229 (2), 227 (18), 173 (24), 103 (22), 75 (45), 55 (33).
(b) Получение используемого в качестве боковой цепи сульфона (35).
К раствору метилмагнийбромида (14 мл 3 М раствора в эфире) в абсолютном тетрагидрофуране при -10оС и интенсивном перемешивании в атмосфере аргона в течение 15-20 мин прибавляют раствор 6-бромгексаноилхлорида (32) (3,8 г, 2,8 мл, 18 ммоль) в абсолютном тетрагидрофуране (10 мл). Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, охлаждают до 0оС и осторожно разлагают разбавленной (1:1) соляной кислотой. Смесь экстрагируют эфиром, объединенные органические слои промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и после испарения получают бромзамещенный спирт (33) в виде бесцветного масла (3,6 г, 94%).
Бромзамещенный спирт (3,4 г, 16 ммоль) обрабатывают в течение 4,5 ч при 70оС натриевой солью бензолсульфиновой кислоты (3,3 г, 20 ммоль) в абсолютном диметилформамиде. Затем смесь переносят на лед, экстрагируют дихлорметаном, промывают 1 н НСl, водой 10%-ным раствором NaHCO3, cушат над безводным MgSO4, фильтруют и после испарения получают сульфон (34), который очищают вытеснительной хроматографией на силикагеле с элюированием 40-50% этилацетата в гексане, получают сульфон с примесью соответствующего сульфинатного эфира (4,18 г, 98%). МС m/3 270 (М+), 255 (М+ -15), 77, 59.
К перемешиваемому раствору сульфона (34) (4 г, 14 ммоль) и имидазола (3,8 г, 55 ммоль) в безводном диметилформамиде (13 мл) прибавляют триэтилсилилхлорид (4,6 г, 5,1 мл, 30 ммоль), реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, переносят в ледяную воду, экстрагируют эфиром, сушат над безводным MgSО4, фильтруют и испаряют. Остаток очищают вытеснительной хроматографией. Первым гексаном элюируется гексаэтилдисилоксан, 3% этилацетата в гексане элюируются сульфинатный эфир с примесью сульфона и 10% этилацетата в гексане элюируется чистый защищенный сульфон (35) (3,4 г, 60% ).
Анализ.
Вычислено для С20Н36О3SSi:
С 62,45 Н 9,43 S 38,34
Найдено, С 61,97 Н 9,45 S 38,34
МС m/3 (относительная интенсивность): 355 (100) (М+-29), 227 (15), 173 (35), 103 (43), 75 (95), 55 (23).
ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 0,54 (6Н, к, J7 Гц, Si-CH2), 0,94 (9Н, т, J 8 Гц, Si-C-CH3), 1,15 (6Н, с, СН3), 1,31-1,36 (4Н, м), 3,08-3,12 (2Н, м, 2-Н), 7,57 (2Н, т, J 6,8 Гц, мета-Н-арил), 7,66 (1Н, т. пара-Н-арил), 7,92 (2Н, д, J 6,8 Гц, орто-Н-арил).
Биологическая активность.
Новый гомолог (25) испытан на дифференциативную и кальцемическую активности с использованием апробированных известных методик. Методики проведения испытаний и полученные результаты более подробно описываются в нижеследующих примерах.
П р и м е р 5. Определение дифференциативной активности дигомо-производного (25) по отношению к клеткам ЛЧ-60 (Таблица 1).
Степень дифференциации клеток лейкемии человека 60 (ЛЧ-60) под действием испытуемых соединений определялась тремя независимыми способами, а именно: NBT-восстановление, фагоцитоз и активность эстеразы. Первые два испытания осуществлены по методикам [4] Третье испытание с определением неспецифической активности кислотной эстеразы в качестве мерила дифференциации проводят по методике, прилагаемой к тест-набору 90 фирмы Сигма (Sigma Chemical Corp. Сан-Луис, МО) (Оstrem и др. Proc. Nate, Acad, Sci. VSA 84, 2610-2614 (1987); Ostrem и др. I.Biol.Chem. 262, 14164-14171 (1987). Полученные результаты приведены в табл. 1. Данные представлены как процент дифференциации клеток в результате обработки 1,25-(ОН)2D3 (использован для сравнения в качестве стандарта) в различных концентрациях или испытуемым производным витамина D).
При этом отмечается назкая кальцемическая активность.
П р и м е р 6. Кальцемическая активность дигомо-производного (25).
(а) Активность по переносу кальция в кишечнике. (Таблица 2)
Отнятых от сосков самцов крыс, полученных от компании Харлан-Спраг Доули из Медисона, шт. Висконсин, кормят рахитогенной пищей с низким содержанием кальция (0,02 мас. Са, 0,3 мас. Р), описанной Suda и др. (J.Nutr. 100, 1049-1052, 1970). Крысы получают такое в общей сложности 4 недели произвольно. В конце третьей недели зверьков разделяют на группы по 6 крыс в каждой группе. Одна из групп получала ежедневно инъекции носителя (0,1 мл 0,95% пропиленгликоля и 5% этанола) внутрибрюшинно в течение того же периода времени, но с добавкой одной из следующих доз: 12,5 нг или 25 нг 1,25-(ОН)2D3 или 24-дигомо-1 α 25-дигидрокси-22-дегидровитамина (соединение 25). Зверьков умерщвляют через 24 ч после введения последней дозы, кишечник извлекают и дуоденальные сегменты используют для определения переноса кальция в кишечнике по методике Halloran, DeLuca (Arch. Biochem. Biophys. 208, 477-486, 1981). Полученные результаты приведены табл. 2.
(b) Определение костной мобилизации кальция (табл. 3).
Самцов крыс, отнятых от сосков и полученных от компании Харлан-Спраг Доули, кормят пищевой с низким содержанием кальция (0,02 мас. Са, 0,3 мас. Р) и дефицитом витамина D, описанной Suda и др. (I.Nutr 100, 1049-1052, 1970) в течение 4 недель. В конце третьей недели зверьков делят на группы по 6 крыс в каждой, каждая группа получает определенные дозировки (табл. 3), растворенные в 0,1 мл 85% пропиленгликоля и 5% этанола. Контрольная группа получает только применяемый в качестве растворителя носитель. Другие группы получают указанные дозировки 1,25-(ОН)2D3 или дигомо-производного (25) ежедневно в течение 7 дней. В конце 7-ми дневного периода введения соединений по атомному поглощению определяют содержание кальция в сыворотке крови. Результаты двух таких экспериментов приведены в табл. 3.
Представленные в табл. 1 данные показывают, что дигомо-аналог 25 явно более активен по сравнению с 1,25-(ОН)2D3 в стимулировании дифференциации клеток лейкемии от нормальных моноцитовых клеток. Например, при концентрации 1х10-8 молярной 1,25-(ОН)2D3 создает дифференциацию клеток в 55-61% а соединение (25) при той же концентрации создает дифференциацию в 78% С учетом того, что концентрация 1х10-7 молярной для 1,25-(ОН)2D3 необходимо для достижения той же степени дифференциации (примерно 90%), которая достигается при концентрации дигомо-аналога в 5х10-8 (примерно 92%), можно сделать вывод о том, что аналог (25) примерно в 5 раз более активен, чем 1,25-(ОН)2D3 в качестве дифференциативного средства.
Напротив, дигомо-производное проявляет очень низкую кальцемическую активность по сравнению с 1,25-(ОН)2D3. Этот вывод подтверждается данными, приведенными в табл. 2 и 3. Данные по переносу кальция в кишечнике, представленные в табл. 2, показывают, например, что известный своей активностью метаболит 1,25-(ОН)2D3 вызывает очень значительную реакцию (по сравнению с контролем) при введении в дозировках 12,5 или 25 нг/день в течение 7 дней. Однако, в случае нового дигомо-производного (25) необходима дозировка в 125 нг/день в течение 7, чтобы вызвать реакцию, но даже при таких высоких дозировках реакция умерена и составляет примерно половину от реакции, вызванной 1,25-(ОН)2D3 при дозировке в 10 раз выше. Таким образом, согласно данному испытанию новое дигомо-производное по меньшей мере в 10 раз менее активен, чем 1,25-(ОН)2.
Тот же вывод можно сделать на основании результатов по костной мобилизации кальция, приведенных в табл. 3. В этом случае дозировки в 125 и 250 нг/день (вводимые в течение 7 дней) дигомо-аналога (25) необходимы для достижения той же степени реакции, что и создаваемые 1,25-(ОН)2D3 соответственно в дозировках 12,5 и 25 нг. Примечателен и тот факт, что повышение дозировки дигомо-производного (до 500 нг/день) не вызывает дальнейшего роста, но даже несколько уменьшает реакцию по костной мобилизации кальция (табл. 3). Во втором опыте, отраженном в табл. 3, 1,25-(ОН)2D3 вновь вызывает очень значительную реакцию (в сравнении с контролем) в дозировках 12,5 и 15 нг/день при отсутствии активности со стороны дигомо-аналога в дозировке 125 нг/день. В третьем опыте, в котором дигомо-аналог испытывался в интервале дозировок вплоть до 1000 нг/день, соединение не вызывает никакой реакции по костной мобилизации кальция при любых дозировках, что указывает на отсутствие активности у соединения по повышению содержания кальция в сыворотке крови за счет костной ткани. Таким образом, результаты по костной мобилизации находятся в полном соответствии с данными по переносу кальция, приведенными в табл. 2, которые ясно показывают, что новый дигомо-аналог 25 во много раз менее активен, чем 1,25-(ОН)2D3 по своему кальцемическому действию.
Тот же характер проявления активности наблюдается и для тригомо-производного (26) предлагаемого изобретения. Это соединение обладает в высшей степени благоприятным и неожиданно повышенным отношением дифференциативная (кальцемическая активности за счет проявления заметной активности в стимулировании дифференциации клеток ЛЧ-60 без заметной реакции (в сравнении с контролем) по повышению содержания кальция в крови крыс.
Такой тип проявления активности это то, что требуется для соединения, предназначенного для применения в качестве дифференциативного средства для лечения раковых заболеваний. Целевая активность, т.е. клеточная дифференциация злокачественных клеток, ярко выражена, в то время как нежелательная активность, а именно кальцемическое действие, неожиданно понижено, в результате чего достигается очень значительно повышенное отношение дифференциативная кальцемическая активности. Известное соединение 1 α -гидрокси- витамины D эффективно в качестве терапевтического средства для лечения лейкемических заболеваний (патент США N 4391802). На основе приведенных данных биологических испытаний можно сделать вывод, что новые гомо-производные предлагаемого изобретения при их введении в тех же дозировках, что и соединений прототипа, будут оказывать от ложного отсутствия до менее, чем в одной десятой части нежелательного кальцемического действия, характерного для соединений прототипа, и тем самым снимают проблемы, связанные с возникновением чрезмерно высоких концентраций кальция в крови подвергаемых лечению субъектов. Таким образом, предлагаемые соединения являются эффективным практическим воплощением концепции дифференциативной терапии раковых заболеваний, и характер проявления активности со стороны этих соединений однозначно предполагает, что они окажутся предпочтительными терапевтическими средствами при таком лечении.
Для лечебных целей предлагаемые соединения могут быть приготовлены в виде растворов в приемлемом растворителе или в виде эмульсий, суспензий или дисперсий в приемлемых или неядовитых растворителях или носителях, или в виде пилюль, таблеток или капсул известными стандартными способами. Такие составы могут также включать другие фармацевтически приемлемые и неядовитые наполнители, такие как стабилизаторы, антиокислители, связующие средства, красители, эмульгаторы и вкусовые добавки. Предложенная композиция содержит в качестве активного начала гомолог 1-гидроксивитамина D в количестве 0,5-50 мкг.
Соединения предпочтительно вводятся в виде инъекций или внутривенным вливанием приемлемых стерильных растворов, или в виде пероральных доз через пищеварительный тракт. При лечении лейкемии человека производные гомовитамина вводятся больным в дозировках, достаточных для стимулирования дифференциации лейкемических клеток от макрофагов.
Мягкая желатиновая капсула содержит: 0,25 мл три-лауринтриглицерида, 5 мкг 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитами- на D3.
Жидкая композиция для орального введения содержит 1 мл пропиленгликоля; 100 мкг 24-тригомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамина D3; 10 мкг альфа-токоферола.
Композиция для нанесения на кожу содержит: 1 г пальмового масла; 20 мкг 24-дигомо-1,25-дигидрокси-22-дегидровитамина D3.
Формула изобретения: Гомологи 1α - гидроксивитамина D3 с ненасыщенной боковой целью общей формулы

где n = 3 или 4,
обладающие стимулирующим и усиливающим дифференциацию злокачественных клеток лейкемии человека действием.
2. Гомологи 22-гидрокси-23-фенилсульфонил витамина D3 общей формулы

где X, Y, Z - одинаковые или различные, водород или три(низший алкил)силильная группа;
n = 3 или 4,
в качестве промежуточных продуктов для получения гомологов 1α - гидроксивитамина D3.
3. Композиция, способствующая стимуляции и усилению дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека, содержащая активное вещество и фармацевтическими приемлемый наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества оно содержит гомологи 1α - гидроксивитамина D3, 24-дигомо- 1α, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3, 24-тригомо-1α, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3 в количестве 0,5 - 30 мкг.
4. Способ стимуляции и усиления дифференциации злокачественных клеток лейкемии человека, включающий введение производных витамина D3, отличающийся тем, что используют по меньшей мере один из гомологов 1α-гидроксивитамина D3 общей формулы

где n = 3, 4.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что гомологом является 24-дигомо-1α, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3.
Способ по п. 4, отличающийся тем, что гомологом является 24-тригомо-1α, 25-дигидрокси-22-дегидровитамин D3.