√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
√»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ј “»¬Ќќ—“№ё α1 -“»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈…- “»ћќ«»Ќ a1, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я √»Ѕ–»ƒЌќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј-ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ a1 , –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  pThy, Ё —ѕ–≈——»–”ёўјя √»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёўјя ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ α ‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ- a1
√»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ј “»¬Ќќ—“№ё α1 -“»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈…- “»ћќ«»Ќ a1, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я √»Ѕ–»ƒЌќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј-ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ a1 , –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  pThy, Ё —ѕ–≈——»–”ёўјя √»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёўјя ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ α ‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ- a1

√»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ј “»¬Ќќ—“№ё α1 -“»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈…- “»ћќ«»Ќ a1, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я √»Ѕ–»ƒЌќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ- α -‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј-ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ a1 , –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  pThy, Ё —ѕ–≈——»–”ёўјя √»Ѕ–»ƒЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёўјя ј “»¬Ќќ—“№ё α1 - “»ћќ«»Ќ α ‘ј “ќ– Ќ≈ –ќ«ј ќѕ”’ќЋ≈… - “»ћќ«»Ќ- a1

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии и позвол€ет получить гибридный белок α1 -тимозин- α -фактор некроза опухолей -тимозин- a1 (“‘Ќќ-“). —ущность изобретени€: сконструирована in vitro рекомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ , содержаща€ ген, кодирующий синтез гибридного белка α1 -тимозин- α -фактор некроза опухолей- -тимозин- a1 . ѕолучен гибридный полипептид, обладающий активностью α1 -тимозин- α -фактор некроза опухолей-тимозин- a1 (“-‘Ќќ-“), обладающий широким спектром иммуномодулирующего действи€, путем создани€ плазмидной ƒЌ  pThy 325, кодирующей гибридный белок (“-‘Ќќ-“), проведением культивировани€ трансформантов при 37o— до поздней фазы эпокспоненциального роста, а затем до стационарной фазы при 41o—. ƒл€ очистки гибридного белка используют осадок, получившийс€ после лизиса клеток, который отмывают и раствор€ют в буфере, содержащем 6 ћ мочевины. 3 с. п. 2 з. п. ф-лы, 9 ил., 9 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

   — помощью яндекс:  

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2058390
 ласс(ы) патента: C12N15/28, C12N15/70, C07K19/00, C12P21/02
Ќомер за€вки: 92002679/13
ƒата подачи за€вки: 28.10.1992
ƒата публикации: 20.04.1996
«а€витель(и): √осударственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии
јвтор(ы): √алактионов ¬.√.; Ўмелев ¬.ј.; Ѕунина «.‘.; Ќосова Ћ.ё.; Ќовикова Ќ.».;  удр€вцева “.ё.;  оробко ¬.√.; Ѕолдырева ≈.‘.
ѕатентообладатель(и): √осударственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии и представл€ет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ƒЌ , содержащую ген, кодирующий синтез гибридного белка α1-тимозин-фактор некроза опухолей- α-тимозин- α1 (“-‘Ќќ-“).
»звестна плазмида рThy314, кодирующа€ гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин- α1 (‘Ќќ-“) и белки устойчивости к антибиотикам β -лактамазу и хлорамфениколацетилтрансферазу (за€вка на авт. св. N 4760812).
Ќедостатком использовани€ плазмиды рThy314 €вл€етс€ наличие в цитоплазме клеток, трансформированных этой плазмидой, нар€ду с гибридным белком ‘Ќќ-“ в равном по массе количестве белка хлорамфенилколацетилтрансферазы. ¬ы€влено, что плазмида р“hy314 нестабильна при культивировании штамма SG 20050 (р“hy314) в бульоне после хранени€ на плотных питательных средах.
–екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  pThy230 ( оробко ¬.Ќ. и др. Ѕиоорганическа€ хими€, 1992, т. 18, N 5, с. 646-659) кодирует синтез гибридного белка α1-тимозин-фактор некроза опухолей- (“-‘Ќќ). ”казанный гибридный белок обладает биологической активностью в тесте цитотоксичности на клетках 1-929 и предназначен дл€ выщеплени€ пептида, подобного α1-тимозину, за счет гидролиза кислотолабильной св€зи аспарагинова€ кислота пролин между аминокислотными последовательност€ми тимозина-α и ‘Ќќ.
Ќедостатком использовани€ плазмиды р“hy230 дл€ выщеплени€ α1-тимозина €вл€етс€ растворима€ форма гибридного белка, кодируемого этой плазмидой, что требует применени€ способов предварительной хроматографической очистки этого белка, затем его осаждени€ и последующего растворени€ в кислоте дл€ выщеплени€ тимозина. ѕредварительна€ очистка гибридного белка €вл€етс€ необходимым этапом, поскольку кислотный гидролиз суммы белков E. coli приведет к выщеплению множества пептидов, сравнимых по размерам с 1-тимозином, и затруднит его последующую очистку.
—пособ очистки ‘Ќќ включает последовательные этапы хроматографии синтезированного ‘Ќќ на гидрофобных носител€х (пористом стекле, фенил-сефарозе), анионообменниках при рЌ от 7,8 до 10 и аффинной матрице с иммобилизованным красителем (красный, зеленый, синий) в том же интервале значений рЌ.
—интезируемый в клетках микроорганизмов ‘Ќќ находитс€ в основном в растворимой форме, поэтому все процедуры очистки провод€тс€ без использовани€ денатурирующих агентов, таких как мочевина, гуанидингидрохлорид и др.
—пособы очистки гибридных белков на основе ‘Ќќ и тимозина неизвестны.
«адачей изобретени€ €вл€етс€
1) получение рекомбинантной плазмидной ƒЌ  р“hy325, кодирующей синтез нового гибридного белка α1-тимозин-α -фактор некроза опухолей-тимозина- α1 (“-‘Ќќ-“), обладающего широким спектром иммуномодулирующего действи€;
2) создание способа получени€ гибридного белка “-‘Ќќ-“, обеспечивающего стабильное наследование плазмиды в процессе культивировани€ и получение максимального синтеза гибридного белка;
ѕоставленна€ задача решаетс€
1) получением промежуточной плазмидной ƒЌ  pThy315, €вл€ющейс€ производной р“hy314 с делением гена хлорамфениколацетилтрансферазы, а затем рекомбинацией фрагментов плазмидных ƒЌ  р“hy315 и pThy230 in vitro. ѕри этом  рh1 Eco911 фрагмент размером 498 нуклеотидных пар плазмиды р“hy230, содержащий последовательность дл€ α1-тимозин, дипептида аспарагинова€ кислота-пролин и N-концевой части α -‘Ќќ, лигируетс€ с  рnI-Eco911 фрагментом размером 2,8 т. н. п. плазмиды р“hy315, содержащим последовательность дл€ —-концевой части α-‘Ќќ и α 1-тимозина, которому предшествует метиониновый остаток дл€ расщеплени€ бромоцианом. ¬ результате описанной рекомбинации получают плазмиду р“hy325, кодирующую синтез гибридного белка α-‘Ќќ с двум€ последовательност€ми α1-тимозина на N и —-концах ‘Ќќ.
2) поведением культивировани€ первичных трансформантов штамма SG 20050, которые засевают в бульон с 50 мкг/мл ампициллина сразу после трансформации клеток плазмидой р“hy325. ѕосле выращивани€ в бульоне около 100% клеток сохран€ют плазмиду. ѕо данным электрофореза количество гибридного белка в клетках достигает максимума в поздней фазе экспоненциального роста и выходе культуры на стационар.
ѕоскольку культивирование свежеполученных трансформантов €вл€етс€ не вполне технологичным, примен€ют другой вариант культивировани€. —вежеполученные трансформанты выращивают до экспоненциальной фазы роста, затем производ€т отбор культуры, добавл€ют стерильный глицерин до 40% и хран€т клетки при 20о— в течение нескольких мес€цев. ƒл€ последующих культивирований в ферментере используют в качестве посевного материала эти консервированные клетки;
3) проведением подбора и оптимизации состава питательного бульона дл€ культивировани€ штамма SG 20050 с плазмидой р“hy325 и получени€ максимального уровн€ синтеза гибридного белка;
4) проведением культивировани€ при 37о—, а в конце экспоненциальной фазы роста при Ќ 41о—, при этом получают гибридный белок “-‘Ќќ-“ в нерастворимой форме; проведением культивировани€ при температуре 30о—, при этом получают гибридный белок “-‘Ќќ-“ в растворимой форме;
5) использованием очистки гибридного белка в нерастворимой форме после лизиса клеток за счет а) отмывки осадка гибридного белка; б) растворени€ осадка гибридного белка в 6 ћ растворах мочевины;в) очистки гибридного белка в присутствии мочевины хроматографией на анионообменниках (ƒ≈-, ƒ≈ј≈-) и аффинных матрицах с иммобилизованным красителем (голубой); г) диализа раствора очищенного белка против забуференного физиологического раствора при рЌ 7,2-7,4.
6) использованием очистки гибридного белка в растворимой форме после лизиса клеток за счет а) очистки гибридного белка в присутствии мочевины последовательными хроматографи€ми на фенил-сефарозе, анионообменниках (ƒ≈-, ƒ≈ј≈-) и аффинных матрицах с иммобилизованным красителем (голубой); б) диализа раствора очищенного белка против забуференного физиологического раствора при рЌ 7,2-7,4.
ѕри использовании перечисленных признаков достигаютс€ следующие технические результаты:
1) получают новую плазмидную ƒЌ  р“hy325 (фиг. 1), кодирующую синтез нового гибридного белка “-‘Ќќ-“ (фиг. 3-7);
2) предложенный способ позвол€ет получать воспроизводимые результаты, обеспечивает стабильное 100%-ное наследование плазмид и высокий уровень синтеза гибридного белка (30-40% от общего клеточного белка). ”казанный результат не достигаетс€ при использовании дл€ последующих культивирований клеток, достигших стационарной фазы роста на плотной или в жидкой питательной среде;
3) предложенный способ позвол€ет получать максимальный (указанный выше) уровень синтеза гибридного белка и не требует дополнительного поддержани€ оптимального рЌ в процессе культивировани€;
4) культивирование при повышенной (до 41о—) температуре позвол€ет получать гибридный белок в нерастворимой форме и проводить его очистку после лизиса клеток, не использу€ хроматографические методы, и непосредственно раствор€ть его в кислотах дл€ выщеплени€ тимозина, причем из каждой молекулы гибридного белка получаетс€ две молекулы тимозина;
5) гибридный белок, полученный предложенным способом, имеет чистоту не менее 95% по данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натри€ (ѕјј√-ƒ—Ќ) и позвол€ет получать “-‘Ќќ-“ в растворе дл€ использовани€ в качестве иммуномодулирующего препарата;
6) сравнительное излучение (пример 8) с использованием широкого набора иммунологических тестов указывает на то, что белок “-‘Ќќ-“ при отсутствии цитотоксичности усиливает активность естественных киллерных клеток, фагоцитоз, антителопродукцию, реакции гиперчувствительности замедленного типа, дифференцировку лимфоцитов “-хелперов, что позвол€ет использовать его в качестве иммуностимулирующего препарата, превосход€щего ‘Ќќ, тимозин α1 и гибридные белки “-‘Ќќ, ‘Ќќ-“.
Ќа фиг. 1 изображена схема получени€ рекомбинантной плазмидой ƒЌ  р“yh325. ќбозначени€ сайтов рестриктаз: T Eco RI, Ec Eco911, C Clal, H Hind III, K KpnI, X Xba I;
на фиг. 2 электрофореграмма в 15% ѕјј√-ƒ—Ќ лизатов клеток E.coli SG 20050, содержащих плазмиды: I pThy315, 2 pThy230, 3 pThy325, 4 маркеры молекул€рных масс белков;
фиг. 3, 4 аминокислотна€ последовательность гибридного белка “-‘Ќќ-“ (выделена жирным шрифтом) и нуклеотидна€ последовательность гена, кодирующего синтез этого гибридного белка;
на фиг. 5 -7- аминокислотные последовательности белков; курсивом выделена последовательность, соответствующа€ тимозину, α1, жирным шрифтом фактору некроза опухолей α
на фиг. 8 вли€ние препаратов белков на поглотительную функцию макрофагов;
на фиг. 9 вли€ние тимозина α1, ‘Ќќ и гибридных белков на процесс образовани€ антителопродуцирующих клеток.
ѕ р и м е р 1. ѕлазмидные ƒЌ  рThy315 и р“hy230 в количестве 10 мкг каждой раствор€ют в 100 мкл буфера, содержащего 50 мћ NaCl, 10 мћ MgCl2, 10 мћ трис-Ќ—l, рЌ 7,5 и 3 мћ β-меркаптоэтанола. ƒобавл€ют по 10 ед. активности рестриктазы  рnI и ≈со 91 I, инкубируют при 37о— в течение 1 ч. ѕосле инкубации реакцию останавливают эктракцией 200 мкл смеси равных объемов фенола и хлороформа. ƒЌ  осаждают, добавл€€ 1 мкл 5 ћ NaCl и 250 мкол 96%-ного этанола. ѕосле инкубации при 20о— в течение 1 ч и центрифугировани€ 10 мин при 8000 g спирт сливают. ƒЌ  высушивают под вакуумом и раствор€ют в 200 мкл буфера, содержащего 66 мћ трис-HCl, рЌ 7,5, 5 мћ MgCl2, 1 мћ ј“– и 5 мћ дитиотрейтола. ƒобавл€ют 10 ед. активности “4 ƒЌ -лигазы и инкубируют 18 ч при 15о—, 25 мкл этой смеси используют дл€ трансформации компетентных клеток ≈. coli HB 101 и выделени€ плазмидных ƒЌ , как указано выше. ѕлазмиды из различных клонов анализируют электрофорезом в 0,7%-ной агарозе, отмеча€ те, у которых подвижность больше чем у р“hy230 и меньше или равна pThy315. ѕровод€т анализ с помощью рестриктаз Hind III, Xba I, Eco RI, Eco 91 I, Bg III, Xho I и –st I при раздельном и совместном гидролизе в услови€х, как указано выше. ќтбирают варианты плазмидной ƒЌ , аналогичные р“hy315 с вставкой фрагмента ƒЌ  размером 0,1 т.п.н. расположенного между Cla I и Xho I сайтами; при этом должны быть сохранены Tco 91 I, Bg III, Bam HI сайты, присутствующие в р“hy230. —хема конструировани€ плазмиды р“hy325 и ее рестрикционна€ карта показаны на фиг. 1. ¬ыбранную указанным способом плазмиднуюб ƒЌ р“hy325 и ƒЌ  плазмид р“hy315 и р“hy230 трансформируют в клетки штамма E. coli SG 20050 по методике, приведенной выше. ¬ыращенные клетки анализируют на наличие гибридного белка в 15% ѕјј√-ƒ—Ќ. —пектр и количество синтезируемых белков показаны на фиг. 2.
ѕ р и м е р 2.  ультивирование дл€ получени€ гибридного белка “-‘Ќќ-“.
¬ыращивают штамм E. coli SG 20050 в 5 мл LB при 37о— в течение ночи. –азвод€т культуру свежим LB в 50-100 раз и раст€т на качалке при 37о— до оптической плотности при 590 нм, равной 0,2-0,3. ≈сли оптическа€ плотность более 0,3, культуру развод€т свежим LB до 0,1 и подращивают 30 мин. ѕеренос€т 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4о— 5000 g в течение 10 мин. —упернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 ћ CaCl2, охлажденного на льду. »нкубируют клетки 20 мин на льду. ќсаждают клетки 10 мин при 5000 об/мин, 4о—. —упернатант сливают, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 ћ CaCl2, охлажденного на льду.   компетентным клеткам можно добавить стерильный глицерин до 15% и хранить клетки дл€ трансформации до трех мес€цев при 70о—. ѕеренос€т 3 мл компетентных клеток в холодную пробирку и добавл€ют 5-10 мкг плазмидной ƒЌ  р“hy325. »нкубируют на льду 1 ч. ѕеренос€т пробирку на 42о— 5 мин. ѕеренос€т клетки в колбу с 100 мл подогретого до 37о— L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37о— 1-1,5 ч. «аполн€ют ферментер вместимостью 10 л L-бульоном объектом 7 л с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. ѕрогревают ферментер до необходимой температуры и внос€т посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформаторов.  ультивируют при необходимой температуре, 250-300 об/мин с продувкой воздуха 0,5 л/мин на л бульона. ѕри достижении стационарной фазы роста бульон сливают, берут пробу дл€ определени€ уровн€ синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% ѕјј√-ƒ—Ќ.  летки отдел€ют центрифугированием или микрофильтрацией и используют дл€ выделени€ гибридного белка. Ёкспериментально определено, что при культивировании штамма SH 20050 (р“hy325) при 30о— практически весь гибридный белок синтезируетс€ в клетках в растворимой форме; при 37о— около 50% в нерастворимой; при 41-42о— около 90% гибридного белка находитс€ в клетках в нерастворимой форме.
ѕ р и м е р 3. »спользование консервированных клеток трансформированного штамма ≈. coli дл€ культивировани€ и получени€ гибридного белка.
“рансформаци€ штамма ≈. сoli SG 20050, плазмидой и культивирование свежеполученных трансформантов провод€т, как в примере 2, за исключением: а) в экспоненциальной фазе роста штамма производ€т отбор культуры, добавл€ют стерильный глицерин до 40% и хран€т клетки при (-20)-(-40)о— в течение нескольких мес€цев. ƒол€ последующих культивирований в 10 л ферментере используют в качестве посевного материала консервированные клетки трансформированного штамма.  летки, выросшие до стационарной фазы роста, непригодны дл€ последующих культивирований; б) дл€ культивировани€ в большом объеме клетки в экспоненциальной фазе роста из 10 л ферментов используют как посевной материал дл€ инокул€ции в 100 или 250 л ферментер.
ѕ р и м е р 4. ѕодбор состава питательного бульона дл€ культивировани€.
—остав использованных сред представлен в табл. 1.  ультивирование провод€т в колбах при 37о— в течение 18 ч. ƒл€ засева в каждый питательный бульон используют свежеполученные трансформанты (пример 2) или консервированные клетки (пример 3). –езультаты культивирований представлены в табл. 2.
ѕолученные данные однозначно показывают, что пептон, дрожжевой экстракт и хлористый натрий €вл€ютс€ необходимыми и достаточными компонентами дл€ получени€ биомассы клеток и синтезируемого ими гибридного белка.
ƒл€ оптимизации состава питательного бульона проведены культивировани€ с варьированием количества компонентов, как указано в табл. 3.
— использованием математических методов планировани€ экспериментов проведен расчет оптимального состава питательного бульона. ѕредсказанный состав и полученные результаты приведены в табл. 4.
¬ качестве оптимального выбран состав бульона 1 (табл. 4), обеспечивающий высокий уровень роста клеток и синтез гибридного белка и содержащий наименьшие количества компонентов. ”казанный состав бульона обеспечивает также устойчивый рЌ в процессе культивировани€, что позвол€ет исключить необходимость подтитровки щелочью или кислотой.
ѕ р и м е р 5. ¬ыделение и очистка гибридного белка “-‘Ќќ-“, синтезированного в нерастворимой форме.
 летки штамма SG 20050 с плазмидой р“hy325, выращенные до поздней фазы экспоненциального роста при 37о—, а затем до стационарной фазы при 41о—, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4о—, в течение 10 мин. Ѕульон сливают, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мћ трис-HCl рЌ 7,5 мћ Na2-Ёƒ“ј и 1 мћ феноксиметилсульфонилфторида, из расчета на 1 г клеток 10 мл буфера.  летки разрушают каким-либо способом (например, замораживанием-оттаиванием или импульсами ультразвука три раза по 40 с, или продавливанием в замороженном состо€нии через фильеру French прессе или ’-прессе). Ћизат центрифугируют 10 мин при 4о—, 5000 g. Ќадосадочную жидкость сливают, к осадку добавл€ют лизирующий буфер из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивают. ѕовтор€ют центрифугирование. —упернатант сливают, осадок раствор€ют в 6 ћ мочевине того же объема. ѕовтор€ют центрифугирование. Ќадосадочна€ жидкость представл€ет собой раствор гибридного белка “-‘Ќќ-“ около 60-70%-ной электрофоретической чистоты. ѕолученный раствор белка хроматографируют на носител€х ƒЁAЁ, уравновешенных 25 мћ ацетатным буфером рЌ 5,8 с 7 ћ мочевиной. –аствор белка в 6 ћ мочевине титруют уксусной кислотой до рЌ 5,8 и нанос€т на колонку. «агрузка на 100 мл носител€ около 50 мл раствора гибридного белка. ѕромывают сразу после нанесени€ белка равным по объему колонки 25 мћ ацетатным буфером рЌ 5,8 с 7 ћ мочевиной и 80 мћ NaCl; затем п€тью объемами того же буфера, с 250 мћ NaCl собирают фракции. јликвоты из фракций по 20 мкл анализируют электрофорезом в 15% ѕјј√-ƒ—Ќ. ‘ракции, содержащие гибридный белок, очищают хроматографией на "голубой" агарозе с привитым красителем Cibacron Blue F3GA. Ќоситель уравновешивают 25 мћ Na-ацетатным буфером рЌ 5,5 с 7 ћ мочевиной и 250 мћ NaCl. ‘ракции с ƒЁјЁ объемом до 200 мл нанос€т на колонку с 30 мл носител€. Ёлюируют гибридный белок 30 мћ Na-фосфатным буфером с градиентом рЌ 7,0-7,8 в присутствии 0,4 ћ NaCl и 7 ћ мочевины. ѕолучают белок не менее 95%-ной электрофоретической чистоты. ‘ракции, содержащие гибридный белок, диализуют при 4-8о— в течение 18 ч против 100 объемов 150 мћ NaCl, 10 мћ Na-фосфата рЌ 7,2-7,4. «амен€ют буфер на свежий и диализуют еще несколько часов. Ѕелок хран€т при -20о—.
ѕ р и м е р 6. ¬ыделение и очистка гибридного белка “-‘Ќќ-“, синтезированного в растворимой форме.
ѕолучение лизата клеток, выращенных при 30о—, провод€т, как описано в примере 5. ѕосле центрифугировани€ супернатант, содержащий раствор белка “-‘Ќќ-“, титруют уксусной кислотой до рЌ 5,8. ƒобавл€ют небольшими порци€ми сухой сульфат аммони€ до 28% насыщени€. »нкубируют 30 мин при комнатной температуре, центрифугируют 8000 g 10 мин. —упернатант сливают, добавл€ют сухой сульфат аммони€ до 33% насыщени€ (на 30 мл носител€ около 100 мл белка). ѕромывают колонку сразу после нанесени€ белка 25 мћ Na-ацетатным буфером рЌ 5,8, а затем элюируют белок 6 ћ раствором мочевины в том же буфере. ‘ракции, содержащие гибридный белок, очищают на колонках с носителем ƒ≈ј≈, затем "голубой" агарозой и диализуют, как указано в примере 5.
ѕ р и м е р 7. ѕроверка структуры гибридного белка “-‘Ќќ-“.
¬звешивают осадок влажного белка, полученного как в примере 5, до этапа растворени€ в 6 ћ мочевине; 5-7% от него составл€ет масса гибридного белка. ѕровод€т электрофорез образца гибридного белка в 15 или 17,5% ѕјј√-ƒ—Ќ с использованием маркеров молекул€рных масс белков. “-‘Ќќ-“ имеет молекул€рную массу по подвижности в геле около 24 кƒа (фиг. 2).
ƒл€ определени€ выщепл€емых последовательностей тимозина провод€т гидролиз гибридного белка в кислоте с добавлением или без добавлени€ бромоциана. Ѕелок раствор€ют в 60% муравьиной кислоте до концентрации 5-10 мг/мл, добавл€ют 1/10 объема 1,1 ћ трифторуксусной кислоты и твердый бромоциан из расчета 1 мг на 2 мг (100 эквивалентов). »нкубируют при температуре 37-40о— в темноте в течение 24 ч с перемешиванием. –азвод€т реакционную смесь 5 объемами бидистиллированной воды, упаривают на роторном испарителе до начального объема при 40о—. ƒобавл€ют 5 объемов воды и повтор€ют упаривание. ƒобавл€ют равный объем бидистиллированной воды, титруют 0,1 н. NaOH до рЌ 5-6. ќбразовавшийс€ хлопьевидный осадок отдел€ют центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. ќбразцы осадка и надосадочной жидкости анализируют электрофорезом в 20% ѕјј√-ƒ—Ќ. ќсадок содержит белок с мол.м. около 17 кƒа, что соответствует молекул€рной массе выщепл€емого ‘Ќќ. ¬ надосадочной жидкости наход€тс€ выщепленные пептиды с мол.м. около 3 кƒа (фиг. 5-7).
√ибридный белок “-‘Ќќ-“ состоит из 216 аминокислотных остатков (определ€етс€ по нуклеотидной последовательности гена методом —енгера фиг. 3, 4). ћолекул€рна€ масса гибридного белка 23782 ƒа. јминокислотный состав: 19 Ala 2 Cys 3 His 2 Met 12 Thr 8 Arg 10 Gln 11 Ile 4 Phe 2 Thp 8 Asn 22 Glu 20 Leu 11 Pho 7 Tyr 13 Asp 11 Gly 14 Lys 19 Ser 18 Val »зоэлектрическа€ точка: рI 4,5.
ѕ р и м е р 8. ќпределение иммунобиологических свойств гибридного белка.
¬ качестве контролей используют следующие препараты белков: фактор некроза опухолей α (‘Ќќ) (изготовитель Ќѕќ "‘ермент", г. ¬ильнюс); тимозин- α 1 химически синтезированный (изготовитель ¬Ќ»» ќ„Ѕ, г. —анкт-ѕетербург).
Bли€ние препаратов белков на активность макрофагов.
ƒл€ изучени€ вли€ни€ гибридных белков на фагоцитоз используют спектрофотометрический метод регистрации уровн€ поглощени€ длины волны возбуждени€ гемоглобина фагоцитируемых эритроцитов. ¬ 96-луночные планшеты внос€т клетки перитонеального экссудата. ѕосле процесса адгезии планшеты отмывают от неприлипших клеток.  летки за 2 ч до внесени€ эритроцитов барана инкубируют с анализируемыми белками в дозах от 0,32 . 10-6 ћ. ѕо завершении реакции поглощени€ эритроцитов лунки отмывают от незахваченных клеток и клеточный монослой лизируют. Ћизат спектрофотометрируют при длине волны 405 нм. ƒанные представлены в относительных единицах как отношение показателей экстинкции опытных групп к контрольной.
–езультаты экспериментов по вли€нию препаратов белков на поглотительную функцию магрофагов представлены на фиг. 8. ѕрофиль вли€ни€ тимозина в зависимости от дозы на фагоцитоз показывает отсутствие выраженного эффекта. »ндекс стимул€ции не превышает 1,2 при дозе 0,32 . 10-6 ћ. ‘Ќќ имеет снижающийс€ дозозависимый профиль активизации фагоцитоза при увеличении концентрации. ”меренное стимулирующее вли€ние при различных дозах оказывает гибридный белок “-‘Ќќ. Ќаиболее выраженным эффектом обладают гибриды ‘Ќќ-“ и “-‘Ќќ-“; индекс стимул€ции фагоцитоза при их концентрации 0,32 . 10-6 ћ достигает 1,8-2,0, при этом нет про€влени€ пр€мой дозозависимости.
¬ли€ние препаратов белков на интенсивность антителопродукции.
ƒл€ анализа интенсивности антителопродукции мышей внутрибрюшинно иммунизируют эритроцитами барана в дозе 5 . 107 клеток и одновременно ввод€т исследуемые препараты в дозах 0,32 . 10-8 и 0,32 . 10-7 ћ. ѕосле иммунизации определ€ют количество аителообразующих клеток (јќ ) среди 106 клеток селезенки.
–езультаты изучени€ представлены на фиг. 6 в виде индекса стимул€ции как отношение количеств јќ  в опыте к контролю.  ажда€ величина представлена средним значением из трех опытов и достоверна при – 95% “имозин усиливает в дозозависимой форме продукцию антител (индекс стимул€ции 2,01). ‘Ќќ вли€ет на процесс накоплени€ јќ . √ибридные белки ‘Ќќ-“ и “-‘Ќќ про€вл€ют выраженное стимулирующее вли€ние только при дозе 0,32 . 10-7 ћ; индекс стимул€ции 2,22 и 2,69 соответственно. Ќаиболее сильным стимулирующим действием обладает “-‘Ќќ-“ дл€ обеих исследованных доз; индекс стимул€ции 2,2 и 2,78 соответственно.
¬ли€ние препаратов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.
ƒл€ изучени€ вли€ни€ препаратов белков на реакцию гиперчувствительности замедленного типа мышей иммунизируют эритроцитами барана с одновременным введением исследуемых белков в дозе 107 ћ. Ќа четвертые сутки после первичной иммунизации мышам в подушечку одной из задних лап ввод€т разрешающую дозу антитела. ¬ подушечку противоположной лапы среду (контроль реакции). „ерез 24 ч микрометром измер€ют толщину "опытной" и "контрольной" лап. ќтношение величин в процентах указывает на величину реакции. ƒл€ оценки модифицирующего действи€ исследуемых белков используют коэффициент, представл€ющий собой отношение величины реакции в опытной группе (получавшей белок) к контрольной группе (белок не ввод€т).
–езультаты исследовани€ вли€ни€ препаратов на реакцию √«“ суммированы в табл. 5.
»з полученных результатов видно, что препараты ‘Ќќ, ‘Ќќ-“ тимозина α1 не оказывают какого-либо вли€ни€ на интенсивность реакции √«“; более того, гибридный белок “-‘Ќќ даже несколько ее снижает. ¬ тоже врем€ белок “-‘Ќќ-“ значительно, до 70% усиливает ответ.
¬ли€ние препаратов белков на активность естественных киллерных клеток.
јктивность естественных киллерных клеток (≈  ) определ€ют у мышей линии —¬ј (18-20 г). ∆ивотным за три дн€ до выделени€ клеток ввод€т анализируемые препараты белков в дозе 5 . 10-8 ћ. ¬ качестве мишеней цитотоксической активности ≈   используют клетки миелолимфомы мыши Jack-1, меченные 3Ќ-уридином. —пленоциты мышей и клетки-мишени берут в соотношении 25:1 и 50:1. —месь клеток инкубируют 4 ч, отмывают и перенос€т на фильтры дл€ счета импульсов в 1 мин (срm). ÷итотоксический индекс рассчитывают по формуле
÷.» 100% где срmK счет контрольных лунок с опухолевыми клетками-мишен€ми;
срm 0 счет опытных лунок с опухолевыми клетками-мишен€ми и спленоцитами.
ќ вли€нии препаратов на активность ≈   суд€т по коэффициенту активности как отношени€ показател€ ≈   в опыте (введение препарата) к контролю (препарат не ввод€т). ƒанные суммированы в табл. 6.
–езультаты показывают, что препараты белков, за исключением ‘Ќќ-“ и “-‘Ќќ-“, не оказывают вли€ни€ на про€вление киллерного действи€ ≈  . ‘Ќќ-“ обеспечивает усилие только при большей дозе эффекторов. ¬ то же врем€ “-‘Ќќ-“ значительно усиливает функциональную активность киллеров при различных соотношени€х эффектор мишень.
¬ли€ние препаратов белков на процессы дифференцировки лимфоцитов.
»зучение вли€ни€ препаратов белков на процессы дифференцировки лимфоцитов провод€т по трем антигенам “-лимфоцитов антиген I-го класса главного комплекса гистосовместимости мышей Ќ-2 , рецепторы —D4 (маркер “-хелперов) и CD8 (маркер “-киллеров). ѕосле инкубации клеток тимуса с соответствующим препаратом белка внос€т моноклональные антитела: анти-Ќ-2 , анти-13“4 (анти-CD4) или анти-Lyt 2 (анти-CD8). ”ровень св€зывани€ моноклональных антител вы€вл€ют кроличьими антителами к IgG мыши, меченными пероксидазой. –еакцию с субстратом оценивают по оптической плотности при длине волны 492 нм. Ёффективность реакции рассчитывают как отношение экстинкции опытных групп к контрольным за вычетом фона (сорбци€ кроличьих антител), меченных пероксидазой, на интактных клетках). »ндекс стимул€ции рассчитывают по формуле
». — где Do оптическа€ плотность в опыте при добавлении препарата белка, моноклональных и меченных антител;
Dф оптическа€ плотность без добавлени€ моноклональных антител;
Dк оптическа€ плотность без добавлени€ препарата белка.
–езультаты, полученные при исследовании процессов дефференцировки лимфоцитов с использованием моноклональных антител, представлены в табл. 7.
¬се препараты в зависимости от дозы усиливают в разной степени экспрессию антигена Ќ-2 . “ак тимозин α1, использованный в данном случае в качестве контрол€, демонстрирует известный факт усилени€ клеточной экспрессии антигена Ќ-2 , про€вл€€ себ€ как фактор дифференцировки тимоцитов. ‘Ќќ (второй положительный контpоль) усиливает экспрессию данного антигена при небольших дозах и слабо снижает его представительство на клетках при использовании больших концентраций. ¬ то же врем€ ‘Ќќ-“ за исключением самой низкой дозы увеличивает экспрессию антигена Ќ-2  в дозозависимой форме, близкой к тимозину α1.√ибридный белок “-‘Ќќ способен усиливать экспрессию при использовании всех проверенных доз. Ќаибольший эффект усилени€ экспресс антигена Ќ-2  во всех дозах наблюдаетс€ при использовании гибридного белка “-‘Ќќ-“.
јнализ экспрессии маркера дифференцировки “-хелперов CD4 под действием препаратов белков показал, что тимозин α1 усиливает его экспрессию в дозах 5 .10-12 5 . 10-10 ћ. ‘Ќќ увеличивает его уровень при меньшей и снижает при большей дозе. ‘Ќќ-“ и “-‘Ќќ оказывают незначительное вли€ние на выражение этого антигена. √ибрид “-‘Ќќ-“ наиболее значительное усиление выражени€ CD4 про€вл€ет в дозе 5 . 10-14ћ (почти в 2 раза), при этом большие дозы не оказывают воздействи€. ѕрепараты белков способны обеспечить дифференцировку тимоцитов по линии созревани€ “-хелперов. ѕричем, эта активность наиболее выражена у тимозина α1 и гибридного белка “-‘Ќќ-“.
јнализ экспрессии CD8-маркера “-лимфоцитов киллеров установил некоторое увеличение его экспрессии под вли€нием тимозина α1, ‘Ќќ обеспечивает увеличение представительства CD8 только при низкой дозе 5 . 10-14 ћ. √ибридные белки “-‘Ќќ и ‘Ќќ-“ про€вл€ют умеренное стимулирующее действие на выражение этого маркера. ќтличающимис€ €вл€ютс€ результаты, полученные при использовании “-‘Ќќ-“; ни одна из исследованных доз не вызывает увеличение уровн€ CD8. Ќапротив, более высокие дозы даже подавл€ют экспрессию —D8. ÷итотоксичность белков дл€ клеток L929 приведена в табл. 8.
ѕолученные результаты свидетельствуют о том, что гибридный белок “-‘Ќќ сохран€ет полную цитотоксическую активность, присущую ‘Ќќ, и присоединение последовательности тимозина на N-конец ‘Ќќ не вли€ет на его функции. ѕрисоединение последовательности тимозина на —-конец ‘Ќќ приводит к снижению его активности в 10 раз. ќднако две присоединенные последовательности тимозина на оба конца ‘Ќќ в белке “-‘Ќќ-“ лишают его цитотоксичности.
ѕролиферативна€ активность белков.
–езультаты исследований, представленные в табл. 9, свидетельствуют о том, что ‘Ќќ в дозе 1 мкг ингибируют пролиферацию на 34% √ибридные белки “-‘Ќќ и ‘Ќќ-“ в дозе 1 мкг усиливают пролиферацию примерно в 4 раза, а “-‘Ќќ-“ в 5-6 раз, при этом меньшие дозы гибридных белков не оказывают существенного вли€ни€.
‘ормула изобретени€: 1. √ибридный полипептид, обладающий активностью α1 тимозин - α фактор некроза опухолей-тимозин a1 полученный в штамме, трансформированном рекомбинантной плазмидой, содержащей ген с нуклеотидной последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность и указанный в описании, имеющий мол.м. мономера 23,78  ƒа, изоэлектрическую точку 4,5 и предназначенный дл€ выщеплени€ из него химическими методами дезацетилтимозина α1 или дл€ применени€ в качестве иммуномодулирующего препарата.
2. —пособ получени€ гибридного полипептида, обладающего активностью α1 тимозин α фактор некроза опухолей тимозин a1 заключающийс€ в культивировании штамма Escherichia coli SG 20050 с плазмидой p Thy 325 при 37o— до поздней фазы экспоненциального роста, а затем до стационерной фазы при 40 41o— в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка из надосадочной жидкости и осадка, получающихс€ после лизиса клеток, дл€ этого надосадочную жидкость нанос€т на гидрофобный носитель (фелил) при рЌ 5,8 6,0 в присутствии 33%-ного насыщени€ сульфата аммони€, носитель промывают буфером без сульфата аммони€ при рЌ 5,8 - 6,0 и элюируют гибридный белок этим же буфером, содержащим дополнительно 6 ћ мочевины, фракции с гибридным белком нанос€т на анионообменный носитель ƒ≈ј≈ при рЌ 5,6 5,8 в буфере с 7 ћ мочевиной, элюируют гибридный белок тем же буфером с добавлением до 250 мћ NaCl, затем фракции с гибридным белком нанос€т на матрицу с иммобилизованным красителем Cibacron Blue, уравновешенную буфером с 7 ћ мочевиной при рЌ 5,5 5,8, белок элюируют буфером с градиентом рЌ 7,0 - 7,8 в присутствии 7 ћ мочевины и 0,4 ћ NaCl.
3. —пособ по п. 2, отличающийс€ тем, что культивирование провод€т в среде следующего состава 1 1,4% пептона или трептона, 1 1,6% дрожжевого экстракта, 1 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина.
4. —пособ по п. 3, отличающийс€ тем, что дл€ очистки гибридного белка из осадка, получившегос€ после лизиса клеток, его раствор€ют в буфере, содержащем 6 ћ мочевины, и не используют хроматографию на гидрофобном носителе.
5. –екомбинатна€ плазмидна€ ƒЌ  pThy 325, экспрессирующа€ гибридный полипептид, обладающий активностью α1 тимозин α фактор некроза опухолей тимозин a1 с мол.м. 23, 78  ƒа, имеюща€ мол.м. 2,2 ћƒа и размер 3,33 т.п. н. содержаща€: KpnI Eco91I фрагмент ƒЌ  размером 0,5 т.п.н. плазмиды pThy 230 с участком св€зывани€ рибосом, частью гена гибридного белка, имеющего последовательность дл€ тимозина α1 промежуточной последовательностью аспарагинова€ кислота пролин и N-концевой части фактора некроза опухолей α1 KpnI Eco91I фрагмент ƒЌ  размером 2,8 т.п.н. плазмиды pThy 315 с тандемом ранних промоторов ј2 и ј3 бактериофага “7, частью гена гибридного белка, имеющего последовательность —-концевой части фактора некроза опухолей α и тимозина a1 между которыми находитс€ метиониновый остаток, а также терминатор транскрипции фага λ генетический маркер селекции: ген b лактамазы, придающий устойчивость к ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy 325, уникальные сайты рестрикции, расположенные на рассто€нии, т.п.н. EcoRI 0 и 0,11, BglII 0,32 и 0,88, BamnI 0,36, ClaI 0,27 и 0,83, Eco47III 0,76, Eco91I 0,75, KpnI 0,25, PstI 2,58, XbaI 0,93 и 1,03.