Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В СИСТЕМЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ
СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В СИСТЕМЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ

СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В СИСТЕМЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: медицина, экспериментальная и клиническая иммунология, общая патология и может быть использовано для определения функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Сущность изобретения: в пробу цельной крови добавляют хемилюминесцентный зонд и индуктор хемилюминесцентной реакции (ХЛР). Затем измеряют показатель общей активности процесса хемилюминесценции (светосумму - S) и интегральный кинетический параметр Т c (время, за которое реализуется 50% хемилюминесцентной реакции), характеризующий усиление или снижение скорости ХЛР. По параметрам S и T c вычисляют критерий Е, показывающий процент отклонения хемилюминограммы больного с вычислением знаков выше, ниже и левого или правого сдвига относительно нормы. За норму принимают среднестатистическое значение параметров S и T c (±σ) хемилюминограммы группы практически здоровых детей или взрослых. Экспериментально установлено, что если Е превышает 35%, то параметры анализируемой кривой хемилюминесценции отличаются от среднестатистических параметров нормы в сторону увеличения (гиперергическая реакция) или снижения (иммунодефицитное состояние) на величину, превышающую среднеквадратичное отклонение от нормы (±σ), что имеет диагностическое значение. 4 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2067766
Класс(ы) патента: G01N33/52, G01N33/557
Номер заявки: 5042406/14
Дата подачи заявки: 15.05.1992
Дата публикации: 10.10.1996
Заявитель(и): Пухов К.И.; Пухова Я.И.; Звегинцев С.А.
Автор(ы): Пухов К.И.; Пухова Я.И.; Звегинцев С.А.
Патентообладатель(и): Пухова Яна Израйловна
Описание изобретения: Изобретение относится к области клинической медицины, экспериментальной и клинической иммунологии и общей патологии и может быть использовано для ранней диагностики иммунодефицитных и геперергических состояний, для мониторинга функциональной активности иммуноокомпетентных клеток (ИКК) при иммунокоррекции, при испытании фармакологических препаратов и в оценке эффективности интенсивной терапии.
Известны хемилюминесцентные способы оценки функциональной активности выделенных из цельной крови ИКК по времени достижения максимума (Тмах) хемилюминесцентной реакции (ХЛР), оценке степени повреждения мембран эритроцитов по светосумме (S), по количеству импульсов света на пике ХЛР (Iмах) и пересчету их на одну клетку. Оценка ХЛР в данных работах является неточной и неинформативной, так как при оценке ХЛР по Тмах и Iмах при равных значениях в исследуемых двух пробах величин Тмах возможны различия в величинах пика и светосуммы ХЛР, а при оценке ХЛР по S или по Iмах при равных значениях S или Iмах возможна разная кинетика ХЛР.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является микрометод оценки функциональной активности ИКК в цельной крови по величине амплитуды и расчетом числа импульсов амплитуды на одну фагоцитировавшую клетку. При этом забирают кровь из пальца в гепаринизированный капилляр и смешивают с неокрашенным раствором Хэнкса в пластиковых пробирках "Эппендорф", в другие пластиковые пробирки типа "Эппендорф" вносят люминол и опсонизированный зимозан, а затем вносят разведенную кровь, после чего пробирки помещают в сцинциляционный счетчик для замера Iмах. Затем по окончании измерений пробирки с клетками встряхивают, забирают 100 мкл суспензии и смешивают ее с равным объемом 0,25% раствора генцианвиолета в 3% уксусной кислоте, инкубируют при комнатной температуре 15 мин и далее в камере Горяева просчитывают число клеток, захвативших зимозан. После этого производят пересчет числа импульсов (Iмах) ХЛР на количество фагоцитировавших клеток. Способ отличается трудоемкостью, обусловленной необходимостью определения числа фагоцитирующих клеток и приготовления реактивов для их определения, которое используется для пересчета количества импульсов на одну клетку. Этот трудоемкий процесс не повышает точности и информативности диагностики функциональной активности ИКК крови, так как при низком их содержании в крови, несмотря на высокую или нормальную их индивидуальную активность, общая функциональная активность ИКК в крови будет снижена и, наоборот, при высоком содержании ИКК в крови на фоне низкой их удельной активности общая функциональная активность ИКК может быть нормальной. И одним из основных недостатков прототипа является то, что не учитывается кинетика ХЛР, имеющая важное диагностическое значение.
Целью изобретения является повышение точности, информативности, а также упрощение способа.
Для этого наряду с измерением показателя общей активности процесса хемилюминесценции (светосуммы S) предлагается впервые измерить интегральный кинетический параметр Тc (время, за которое реализуется 50% ХЛР), характеризующий усиление или снижение скорости ХЛР, что дает представления об активности состояния окислительно-восстановительных систем ИКК, играющих важную роль в их кислородном метаболизме.
Сущность способа заключается в том, что в пробу цельной крови добавляют хемилюминесцентный зонд и индуктор ХЛР, измеряют параметры S и Тc. Затем вычисляют критерий Е, показывающий процент отклонения хемилюминограммы больного с вычислением знака "выше", "ниже", "левого" или "правого" сдвигов относительно нормы. За норму принимают среднестатическое значение параметров S и Тc (±σ)) хемилюминограммы группы практически здоровых детей или взрослых. Диагностическое значение имеют отклонения Е выше 35% - гиперергическая реакция, или ниже иммунодефицитное состояние с указанием левого или правого сдвигов.
Способ поясняется фиг.1 4.
Оценочный показатель (Е) определяет в относительных единицах (%) степень отличия одной хемилюминесцентной кривой (ХЛК), например, ХЛК1-норма, от другой ХЛК2-больного. Это отличие можно увидеть, если каждую ХЛК представить на плоскости в виде одной точки в системе S, Тc координат (фиг.1).
По оси S откладывается площадь данной ХЛК1, измеряемая в импульсах/с, а на оси Тc ее время прохождения 50% хемилюминесцентной реакции (ХЛР) - значение ее Тс1, измеряемое в мин. Аналогично построены точки ХЛК2 и ХЛК3 (т.е. ХЛК больного-1 и ХЛК больного-2).
В общем случае точки в координатном пространстве S, Тс разных ХЛК не совпадают, поэтому появляется новая характеристика "расстояние" между двумя ХЛК, соединяющее 2 точки (2 ХЛК) ХЛК1 (норма) и ХЛК2 (больной 1) или ХЛК1 и ХЛК3 (больной 2). В координатах (Тс, S) расстояние между двумя точками определяют как:

Если в координатах (Тс, S) есть точка "норма", то величина расстояния от точки "норма" (ХЛК1) до любой другой кривой (ХЛК2) характеризует степень несовпадения с нормой. Используя нормирование R2Δ квадрат расстояния между двумя ХЛК в координатах (Т, S) к R2o квадрат расстояния от начала координат Тс, S до точки "норма" (ХЛК1), мы получаем относительную характеристику

Различия между ХЛК до 35% в нашем случае расценивались в пределах нормы.
Однако для увеличения точности и информативности оценки отличий ХЛК больных от ХЛК "норма" рассчитывают кинематические знаки "выше" или "ниже" нормы расположения ХЛК больных в системе координат S, Тс, а так же "левый" и "правый" сдвиги, характеризующие "слева" или "справа" от Тс "норма" расположены ТС ХЛК больных в системе Тс, S координат, что будет характеризовать различия по скорости ХЛР, обеспечиваемой в "норме" динамическим равновесием окислительно-восстановительных систем в мембране иммунокомпетентных клеток (ИКК). Отсюда знак "выше" (^) или "ниже" (v) рассчитывается как разность (S больного S нормы) и при положительном его значении и значении разности, превышающей Sнорма + σ различие расценивают как "выше" верхней границы нормы, а при отрицательном при значении разности ниже Sнорма s расценивают как различие ниже нижней границы нормы.
Аналогично рассчитывают знак по Тс "слева": если при (Тc больного Тс нормы) знак положительный и при этом значения разности превышают Тс норма + s, то различия расценивают как снижение скорости ХЛР ниже нижней границы нормы, а при отрицательном значении знака разности и значении ее меньше, чем Тс норма s, результат расценивают как "левый сдвиг", свидетельствующий об увеличении скорости ХЛР выше верхней границы нормы. В обоих случаях указывающий на грубые нарушения в динамически равновесном состоянии окислительно-восстановительных систем мембраны ИКК с преобладанием активности одной из них.
Таким образом, впервые дается наиболее информативный и точный показатель оценки различий между двумя ХЛК с учетом кинетических характеристик ХЛР.
Способ осуществляется следующим образом. Смоченным гепарином наконечником автоматической пипетки забирают кровь из пальца (микрометод) и вносят в пробирку из пластика типа "Эппендорф" c неокрашенным раствором Хэнкса (кровь разводится в 10 раз), затем в сканируемую полистереновую кювету "Klinicon", добавляют 200 мкл хемилюминесцентного зонда (люминол "Sigma" в концентрации 2,2 х 10-4М), 100 мкл разведенной в 10 раз средой Хэнкса крови и 50 мкл индуктора ХЛР (опсонизированных свежей сывороткой крови от 10 доноров частиц латекса НИИСК, С-Петербург, размером 2,4 мкм в концентрации 5 х 108част/мл).
Для записи ХЛР использован 36-канальный автоматизированный и компьютеризированный анализатор хемилюминесценции, работающий в режиме счета квантов, с термостатированием и перемешиванием проб (Институт биофизи СО РАН). Время записи кинетики ХЛР составляет 90 мин. Для диагностики функциональной активности ИКК больного вычисляют параметры хемилюминограммы и Тc (cоответственно светосумма ХЛР и время реализации 50% ХЛР), затем по формуле вычисляют критерий Е:

c определением направленности и скорости ХЛР. Для этого проводят операции по определению знака "выше" ↑ и "ниже"- < нормы по формуле:
S1 SGN (S больного S нормы),
где: S1 SGN (-а) 1 (ниже нормы) и
S1 SGN (+a) + 1 (выше нормы)
и правый или левый сдвиги по формуле:
Tc1 SGN (Tc больного Тc нормы),
где Тc1 SGN (-а) 1 (левый сдвиг) и
Tc1 SGN (+a) + 1 (правый сдвиг),
где SGN операция определения знака.
Предварительно вычисляют среднестатические параметры кривой ХЛР для нормы (S и Tc) ± σ, представляющей группу практически здоровых детей или взрослых. Величина Е для больного выражается в отклонения от нормы с указанием знаков "выше ниже" (↑, <) и левый и правый сдвиги (J, L), характеризующие скорость ХЛР, регулируемую про- и антиоксадантными системами ИКК. В нашем случае экспериментально установлено, что если Е превышает 35% то параметры анализируемой кривой хемилюминесценции отличаются от среднестатистических параметров нормы в сторону увеличения (гиперергическая реакция) или снижения (иммунодефицитное состояние) на величину, превышающую среднеквадратичное отклонение от нормы ((±σ)), что имеет диагностическое значение.
На фиг. 1, 2, 3 приводятся примеры, в которых показаны результаты исследования функциональной активности ИКК крови больных: Х. С. М. У больного Х. функциональная активность ИКК выше ↑ нормы (гиперергическая реакция) на 53,7% с левым сдвигом (J), свидетельствующим об ускорении генерации активных форм кислорода (АФК) и соответственно ХЛР, связанных с нарушением в соотношении про- и антиоксидантных систем. У больного С. функциональная активность ИКК ниже < нормы на 45,9% (вторичная иммунная недостаточность) с левым сдвигом (J)- свидетельствующим также о нарушении в про- и антиоксидантных системах с усилением скорости генерации АФК (у детей с хроническим грануломатозом, с генетически детерминированным дефектом НАДФН оксидазной активности эффект генерации АФК и ХЛР полностью отсутствует). У больного М. функциональная активность ИКК выше нормы на 77,4% с правым сдвигом (L), что свидетельствует о высоком уровне генерации АФК с замедленным развитием ХЛР, свидетельствующем о нарушении преимущественно в антиоксидантной системе, не способной в данном случае к гашению ХЛР.
Таким образом, предлагаемый способ значительно проще за счет отмены трудоемкой операции по определению числа фагоцитирующих клеток. При этом значительно повышается точность, информативность и объективность диагностики за счет учета кинетических особенностей генерации АФК, позволяющих оценить активность ключевых для жизнедеятельности ИКК ферментных систем, обеспечивающих их кислородный метаболизм: про- и антиоксидантных систем. Последнее позволяет врачу под контролем хе милюминограммы проводить не только мониторинг функциональной активности ИКК, но и мониторинг эффективности назначаемой про- и антиоксидантной терапии, коррегирующей кислородный метаболизм клетки.
Микровариант хемилюминесцентного способа оценки функциональной активности ИКК по интегральному кинетическому параметру ТЛР Тc- S и критерию Е прост и его легко автоматизировать. Авторами разработан пакет программы компьютерной диагностики "Lograf exe" и анализа кривых функциональной активности ИКК, позволяющих полностью автоматизировать процесс диагностики функциональной активности ИКК.
Формула изобретения: Способ оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток (ИКК) в системе цельной крови, включающий отбор пробы крови, регистрацию уровня хемилюминесцентной реакции (ХЛР) в присутствии индуктора и хемилюминесцентного зонда с последующим расчетом оценочного показателя Е, отличающийся тем, что регистрируют светосумму (S) хемилюминесценции как площадь под кривой ХЛР и время, за которое реализуется 50% светосуммы ХЛР (Тс), а оценочный показатель (E), характеризующий степень различий между двумя хемилюминесцентными кривыми (ХЛК) ХЛК больного и ХЛК нормы, составляет расстояние между этими двумя ХЛК, которые можно представить на плоскости в виде 2-х точек в системе S, Тс координат, рассчитываемое как нормированный квадрат расстояния между этими двумя точками к квадрату расстояния от начала координат (Тс, S) до точки ХЛКI (точка нормы) по формуле

где за норму принимают параметры среднестатистической кривой ХЛР: для практически здоровых пациентов, затем рассчитывают дополнительно кинетические характеристики ХЛР в системе S, Тс координат как разности (S больного S нормы) и (Тс больного Тс нормы), по которым при S больного > S нормы + σ судят о превышении активности ХЛР больного выше верхней границы нормы, а при S больного < S нормы s судят о снижении активности ХЛР ниже нижней границы нормы, а при Тс больного < Тс нормы s судят о "левом сдвиге", свидетельствующем об увеличении скорости ХЛР выше верхней границы нормы, а при Тс больного > Тс нормы + s судят о "правом сдвиге", свидетельствующем о снижении скорости ХЛР ниже нижней границы нормы.