√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ  Ќ— 250, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… — ѕќћќў№ё ’»ћ»„≈— ќ√ќ —»Ќ“≈«ј, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ Ќ— 250 ћќЋ≈ ”Ћя–Ќќ… ћј——џ 120 - 130  ƒј, ќЅЋјƒјёў»… —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… ѕ–»  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»» Ў“јћћј Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј Ќ— 250, ќЅЋјƒјёў≈√ќ —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ  Ќ— 250, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… — ѕќћќў№ё ’»ћ»„≈— ќ√ќ —»Ќ“≈«ј, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ Ќ— 250 ћќЋ≈ ”Ћя–Ќќ… ћј——џ 120 - 130  ƒј, ќЅЋјƒјёў»… —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… ѕ–»  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»» Ў“јћћј Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј Ќ— 250, ќЅЋјƒјёў≈√ќ —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —

‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ  Ќ— 250, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… — ѕќћќў№ё ’»ћ»„≈— ќ√ќ —»Ќ“≈«ј, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ Ќ— 250 ћќЋ≈ ”Ћя–Ќќ… ћј——џ 120 - 130  ƒј, ќЅЋјƒјёў»… —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —, ѕќЋ”„≈ЌЌџ… ѕ–»  ”Ћ№“»¬»–ќ¬јЌ»» Ў“јћћј Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј Ќ— 250, ќЅЋјƒјёў≈√ќ —ѕќ—ќЅЌќ—“№ё —¬я«џ¬ј“№ јЌ“»“≈Ћј   ѕ–ќƒ” “” √≈Ќј Ѕ≈Ћ ј NS3 ¬»–”—ј √≈ѕј“»“ј —

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: иммунобиотехнологическа€ диагностика вируса гепатита — человека. —ущность: получение фрагмента ƒЌ  Ќ— 250, определ€ющего синтез полипептида, который обладает свойствами белка NS3 вируса гепатита — человека. ѕолипептид получают с помощью штамма бактерий Escherichia coli, трансформированного плазмидой, содержащей фрагмент ƒЌ  Ќ— 250. ƒанный полипептид способен св€зывать антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита —. 3 с.п.ф-лы.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

   — помощью яндекс:  

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2073719
 ласс(ы) патента: C12N15/36, C12N15/62
Ќомер за€вки: 93029441/13
ƒата подачи за€вки: 03.06.1993
ƒата публикации: 20.02.1997
«а€витель(и): Ѕиотехнологическа€ компани€ "Ѕиосервис"
јвтор(ы): Ѕлинов ¬.ћ.; Ћопарев ¬.Ќ.;  расных ¬.Ќ.; √ольцов ¬.ј.; √ринев ј.ј.; јлаторцева √.».; ѕолетаева Ќ.Ќ.; —уханова Ћ.Ћ.
ѕатентообладатель(и): Ѕиотехнологическа€ компани€ "Ѕиосервис"
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано дл€ проведени€ серодиагностики гепатита —.
√епатит — возникает в результате заражени€ вирусом гепатита — и отличаетс€ от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включа€ уже известные гепатит ј, гепатит ¬, гепатит ƒ, а также гепатитов, вызванных вирусом Ёпштейн-Ѕарра или цитомегаловирусом. «аражение вирусом гепатита с, как правило, осуществл€етс€ при переливании крови. ¬ирус гепатита — при попадании в организм поражает клетки печени.  линически гепатит — протекает более легко, чем гепатит ¬. ќднако показано, что почти у п€тидес€ти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом — заболевание приводит к циррозу печени.  роме того, имеютс€ данные о том, что заражение вирусом гепатита — имеет пр€мое отношение к возникновению первичного рака печени. ѕоэтому дл€ проведени€ противоэпидемических и профилактических меропри€тий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позвол€ющих вы€вл€ть людей, инфицированных вирусом гепатита —.
ћногочисленные исследовани€ вируса гепатита — позволили определить его структуру, организацию генома, вы€снить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. ¬ирус гепатита — имеет позитивный –Ќ -геном, состо€щий примерно из 9400 нуклеотидов, и содержит единственную открытую рамку считывани€, котора€ перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состо€щий из 3010 3011 аминокислотных остатков, €вл€ющийс€ предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков.   структурным белкам вируса гепатита — относ€тс€ Cor (€дерный)-антиген (молекул€рна€ масса 19 кƒа) и два гликопротеина с молекул€рными массами 32 кƒа и 72 кƒа. ¬се они процессируютс€ с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью св€зывать –Ќ  и образует нуклеокапсид вируса гепатита —. Ѕелок размером 32 кƒа предположительно €вл€етс€ матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита —, а белок размером 72 кƒа €вл€етс€ либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита — (NS1). Ѕелок NS2 вируса гепатита — размером 23 кƒа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональна€ роль неизвестна. Ѕелок NS3 размером 60 кƒа обладает нуклеотид трифосфатсв€зывающей геликазной активностью и участвует в репликации генома вируса гепатита —.  роме того, он обладает ферментативной активностью сериновой протеазы и участвует в процессировании неструктурных белков. ѕродукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кƒа соответственно.  ак и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и, веро€тно, €вл€етс€ мембраносв€зывающим белком с неизвестной функцией. ѕродукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает –Ќ -зависимой –Ќ -полимеразной активностью и участвует в репликации вирусного генома.
Ѕольшинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита — основано на определении антител к белкам вируса гепатита — в сыворотках крови (серодиагностика). ƒл€ этих целей используютс€ различные подходы, в которых примен€ютс€ принципы иммуноферментного анализа (»‘ј), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. ќдним из наиболее перспективных путей совершенствовани€ всех этих диагностических тест-систем €вл€етс€ использование в качестве антителосв€зывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита —, синтезированных в различных экспрессирующих системах. »спользование таких рекомбинантных белков, сохран€ющих антигенные детерминанты вируса гепатита —, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. —уществует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов вируса гепатита —, и в частности, белка NS3 вируса гепатита — (патенты ≈– NO 445423 A2, G 01 N 33/576, 1990; EP NO 419182 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 388232 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 406511 A1, C 12 N 15/51, 1990; EP NO 416 725 A2, C 12 N 15/51, 1990 и др.).
¬ насто€щее врем€ ведетс€ поиск полипептидов, наиболее перспективных дл€ диагностики, лечени€ и профилактики гепатита —. »сследовани€ ведутс€ как в направлении выбора клеток продуцентов (≈– NO 388232), так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант (≈– NO 445423) и создани€ рекомбинантных полипептидов, продуктов генов вируса гепатита — (≈– NO 377303 A1, C 12 N 15/51, 1989).
—ущность данного технического решени€ состоит в том, что предложен оригинальный, искусственно созданный полипептид, состо€щий из продукта экспрессии фрагмента генома вируса гепатита —, слитого с бета-галактозидазой E. coli, св€зывающий антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита —, фрагмент ƒЌ  Ќ—250, штамм E.coli Ќ—250 ¬ ѕћ N ¬-6596, трансформированный рекомбинантной плазмидой рЌ—250, содержащей фрагмент ƒЌ  Ќ—250.
Ўтамм-продуцент характеризуетс€ следующими признаками: клетки пр€мые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.  летки растут на среде LB и других питательных средах, используемых дл€ культивировани€ Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. ѕри выращивании на питательных агаризованных средах при 37o— колонии клеток гладкие, круглые, блест€щие, бледно-желтые, прозрачные, кра€ ровные. ѕри росте на тех же средах, но при 30 32o—, колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный дл€ колоний клеток с lon мутаци€ми, растущими при пониженной температуре. ѕри росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть.  летки хорошо растут при температуре 4 37oC при оптимуме рЌ от 6,8 до 7,5. ¬ качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Ќитраты восстанавливают до нитридов. ∆елатину не разжижают. ћальтозу не сбраживают. ”реазна€ активность не образуетс€. “рансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага провод€т по стандартным методикам. ѕолученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при 30 32o—. ѕрепаративную ферментацию дл€ наработки рекомбинантного белка провод€т при 39 42o—. ѕродуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составл€ет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10 кл/мл. Ѕелок стабилен при температуре 4o— в течение 5 6 мес€цев.
ѕолипептид выделенный и очищенный из штамма-продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), св€зывает антитела к продуктам гена NS3 белка вируса гепатита — в сыворотках крови и др. биологических жидкост€х. Ўтамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов Ќ»» генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N ¬-6596.
»зобретение иллюстрируетс€ следующими примерами.
ѕ р и м е р 1. ѕолучение фрагмента ƒЌ  Ќ—250.
ƒл€ получени€ фрагмента ƒЌ  были использованы олигонуклеотиды:
cr1 5' GGGGATCCTGCCCCTCCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTAT 3'
cr2 5' GCACCCGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTCTGCCCGTAGAGTCCTTGGAAACTAC 3'
cr3 5' TATGCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTAC 3'
cr4 5' CGCAGACATTTCAAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGC 3'
cr5 5' GGCAAGAGTACTAAAAGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG 3'
rc1 5' ATGCCCACAGCGTGCCCGGAGGGGCAGGATCCCC 3'
rc2 5' - CCGTGAAGACCGGAAGACCGCATAGTAGTTTCCAAGGACTCTACGGGCAGAAAGTCCACCGCCTTCGCA- ACCCCCGGGYGCATACGGCAGCCCGGAAG 3'
rc3 5' TGGGCCACTTGAAATGTCTGCGGTACGGCCGGGGGGGATGAGTTGT 3'
rc4 5' - CCCTGCAGCTTGTACCCTTGGGCTGCATATGCAGCCGGCACTTTAGTACTCTTTGCCGCTGCCAGTGGG- AGCGTGTAGG 3'
ќлигонуклеотиды cr 1, 2, 3, 4, 5 и rc 1, 2, 3, 4 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага “4. ƒл€ этого в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл внос€т по 50 пмолей каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл дес€тикратного буфера дл€ киназы (0,5ћ трис HCl, рЌ 7,6, 0,1 ћ MgCl, 50 мћ дитиотреитол, 1 мћ спермидина и 1 мћ Ёƒ“ј), 250 пмолей (150 мк ») [гамма-–] ј“‘ (удельна€ активность 3000  и/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага “4, бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 минут при 37 град.—. «атем реакционную смесь нагревают до температуры 98 град.—, охлаждают до 16 град.— и обрабатывают ƒЌ -лигазой. ƒл€ этого 100 мкл смеси обработанных киназой олигонуклеотидов смешивают с 12 мкл дес€тикратного буфера дл€ лигировани€ (0,66ћ трис-HCl, рЌ 7,6, 50 мћ MgCl, 50 мћ дитиотрейтол и 10 мћ ј“‘), добавл€ют 8 мкл (50 единиц активности) ƒЌ -лигазы фага “4 и инкубируют при 4 град.— в течение 5 часов. «атем реакционную смесь нагревают до температуры 65 град. — в течение 15 минут дл€ инактивировани€ фермента.
10 мкл раствора обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов используют дл€ анализа ƒЌ  в 12%-ном полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 250 п.н.).
100 мкл раствора полученного фрагмента ƒЌ  гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буферном растворе дл€ рестрикции (конечна€ концентраци€ 20 мћ “рис-HCl рЌ 7,5, 50 мћ NaCl, 10 мћ MgCl, 1 мћ дитиотреитол) в течение 5 часов при температуре 37 град. —. ‘ерменты инактивируют нагреванием при 70 град. —.
10 мкл раствора фрагментов ƒЌ , гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют дл€ анализа ƒЌ  в 12%-ном полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 250 п.н.).
ƒЌ  осаждают этиловым спиртом и раствор€ют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционным эндонуклеазами фрагмента ƒЌ  смешивают с ƒЌ  векторной плазмиды pUCl8, обработанной рестриктазами BamHI и PstI, обрабатывают ƒЌ -лигазой “4 в течение 5 часов при 4 град. —. ѕолученный лигазной смесью трансформируют клетки E. coli штамма DH5 альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). “рансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. ¬ыросшие колонии провер€ют на наличие рекомбинантных плазмид. ƒл€ этого бактериальные клетки лизируют и выдел€ют плазмидную ƒЌ , как описано (Nature, 1981, 145, 1365). ¬ыделенную плазмидную ƒЌ  обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. √идролизат плазмидной ƒЌ  из отобранного рекомбинантного штамма HCNS3 имеет на электрофореграмме 2 полосы ƒЌ  размерами 2686 и 256 п. н. что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ƒЌ  Ќ—250.
ћетодом —энгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определ€етс€ нуклеотидна€ последовательность фрагмента ƒЌ  Ќ—250:
GGGGATCCTGCCCCTCCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTATGCACC
CGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTCTGCCCGTAGAGTCCTTGGAAACTACTAT
GCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCGCAGACATTTC
AAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGCGGCAAGAGTACTAAAGTGCCGGCT
GCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG
‘рагмент ƒЌ , аналогичный Ќ—250, был получен также путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc4.
ѕример
2. ѕолучение плазмид.
—интезированный фрагмент ƒЌ  Ќ—250 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI, ƒЌ  осаждают этиловым спиртом и раствор€ют в 50 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ƒЌ  лигируют с ƒЌ  векторной плазмиды pEL5A, обработанной рестриктазами PstI и BamHI.
ѕолученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PL T90. “рансформированные клетки высевают на чашки с 1,2%-ным LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. ¬ыросшие колонии провер€ют на наличие рекомбинантных плазмид. ƒл€ этого бактериальные клетки лизируют, выдел€ют плазмидную ƒЌ , которую гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI.
√идролизат плазмидной ƒЌ  из отобранного рекомбинантного штамма E.coli HC250 имеет на электрофореграмме 2 полосы ƒЌ  размерами 6400 и около 250 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ƒЌ  Ќ—250. ѕри определении нуклеотидной последовательности плазмидной ƒЌ  установлено, что синтезированный фрагмент ƒЌ  в плазмиде рЌ—250 через BamHI сайт присоединен к —-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. “аким образом, плазмида рЌ—250 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности NS3 белка вируса гепатита —, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.
ѕри мер 3.
¬ыделение полипептида.
Ўтамм E. coli, содержащий плазмиду рЌ—250, выращивают в 100 мл среды LB при 30 град. — до плотности 8х10 кл/мл. ѕосле этого температуру повышают до 39o— и раст€т клетки еще в течение 2-х часов.  летки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, лизируют ультразвуком и выдел€ют белки по одному из известных методов.
¬ыделенные белки анализируют в 10% ѕјј√ по стандартному методу Ћэммли. ¬ качестве маркеров молекул€рных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекул€рных масс от 10 до 160 кƒ. ¬ качестве контрол€ используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PL T90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий полученную нами плазмиду рЌ—250. —равнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli, содержащий плазмиду рЌ—250, экспрессирует гибридный полипептид с молекул€рной массой 120 130 кƒ. јминокислотна€ последовательность полипептида, определенна€ на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ƒЌ , кодирующего участок гена NS3, представлена ниже:
X- Gly Ser Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg
Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val - Asp
Phe Leu Pro Val Glu Ser Leu Glu Thr Thr Met Arg - Ser
Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val - Pro
Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr - Gly
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala - Ala
Gln Gly Tyr Lys, где X последовательность бета галактозидазы E. coli.
 онтроль антигенной активности.
 онтроль антигенной активности полипептида осуществл€ют методом иммуноблотинга. ƒл€ этого провод€т процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществл€ют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ¬Ќ85 с помощью аппарата дл€ электроблотинга в режиме 24¬, 400 мј в течение 1 часа.  ачество переноса провер€ют окрашиванием мембран раствором 0,2% ѕонсо S в 3%-ной “’” в течение 5 мин при комнатной температуре.  раску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15ћ Nacl, 20mM трис-HCl, рЌ 7,4) с 0,05% “вина-20 при комнатной температуре. Ќа следующем этапе провод€т блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1 ћ Na-фосфатном буфере, рЌ 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. ѕосле блокировани€ мембраны в течение 1 час при 37 град. — обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к NS3 белку вируса гепатита —, в разведении 1:100. «атем провод€т трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным “вином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. ¬ы€вление специфических антител осуществл€ют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конюъгатом при 37 град. — в течение часа. ƒалее повтор€ют процедуру трехкратной отмывки. –еакцию провер€ют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20мг в 0,1ћ трис-HCl, рЌ 8,0). јнализ показывает, что полученный полипептид св€зываетс€ с антителами к NS3 белку вируса гепатита —.
“аким образом, данное изобретение представл€ет собой полипептид, обладающий свойствами белка NS3 вируса гепатита —, взаимодействующий с антителами к белку NS3 вируса гепатита —, позвол€ющий определ€ть антитела к вирусу гепатита —.
‘ормула изобретени€: 1. ‘рагмент ƒЌ  ЌC 250, полученный с помощью химического синтеза, имеющий следующую последовательность нуклеотидов:

и кодирующий рекомбинантный полипептид Ќ— 250, обладающий способностью св€зывать антитела к продукту гена белка NS 3 вируса гепатита —.
2. –екомбинантный полипептид Ќ— 250 мол. м. 120 130  ƒа, обладающий способностью св€зывать антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита —, полученный при культивировании штамма бактерий Escherichia coli ¬ ѕћ ¬-6596 и имеющий следующую структуру:
где X последовательность бета-галактозидазы ≈. coli.
3. Ўтамм бактерий Escherichia coli ¬ ѕћ NB-6596 продуцент рекомбинантного полипептида Ќ— 250, обладающего способностью св€зывать антитела к продукту гена белка NS3 вируса гепатита —.