Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ СТРЕПТОМИЦЕТОВ - ПРОДУЦЕНТОВ АВЕРМЕКТИНА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ СТРЕПТОМИЦЕТОВ - ПРОДУЦЕНТОВ АВЕРМЕКТИНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ СТРЕПТОМИЦЕТОВ - ПРОДУЦЕНТОВ АВЕРМЕКТИНА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: микробиология. Сущность изобретения: предложен способ получения высокоактивных штаммов стрептомицетов-продуцентов авермектина путем облучения спор культуры Streptomyces avermitilis по крайней мере однократно тормозным короткоимпульсным рентгеновским излучением с энергией квантов 80 - 160 КэВ, с длительностью импульса облучения 0,5oC10-7 сек, и паузами между облучениями 5oC25 сек, при этом экспозиционная доза облучения спор составляет 100oC2·103 Р, затем споры выдерживают в течение 2oC10 ч при температуре 5,0oC7,0oC и по крайней мере однократно облучают энергичными электронами с энергией 80oC200 КэВ, с плотностью тока 6·10-5oC5,0 A/см2, с длительностью импульса облучения 0,5oC10-7 сек и паузами между излучением 5oC25 сек, а доза облучения электронами составляет 10-3 - 1,0 Мегарад.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2074256
Класс(ы) патента: C12N13/00, A61L2/08
Номер заявки: 5065424/13
Дата подачи заявки: 10.06.1992
Дата публикации: 27.02.1997
Заявитель(и): Зиновьев О.А.; Дриняев В.А.; Землякова Л.Г.; Мирзаев М.Н.; Масленников Д.Д.; Елисеев Ю.Н.
Автор(ы): Зиновьев О.А.; Дриняев В.А.; Землякова Л.Г.; Мирзаев М.Н.; Масленников Д.Д.; Елисеев Ю.Н.
Патентообладатель(и): Зиновьев Олег Анатольевич; Дриняев Виктор Антонович
Описание изобретения: Изобретение относится к синтезу биологически активных веществ и может быть использовано при получении новых свойств продуцентов антибиотиков посредством индуцированного мутагенеза (с помощью тормозного короткоимпульсного рентгеновского излучения и высокоэнергичных электронов).
Изобретение может быть применено в микробиологической промышленности, например, для повышения активности штаммов стрептомицетов Streptomyces avermitilis и др. применяемых в технологии производства антибиотиков, применяемых в животноводстве, растениеводстве и медицине для борьбы с эндо- и экзопаразитами животных, растений и человека.
Известен способ повышения активности продуцентов антибиотика пенициллина с помощью гамма излучений различных энергий [1] Недостатком данного способа является относительно малое сечение взаимодействия гамма квантов с обрабатываемой культурой, что не позволяет существенно повышать биологическую активность культуральной жидкости микроорганизмов.
Известен способ повышения активности продуцентов авермектинов В [2] заключающийся в том, что посредством комбинационного облучения Streptomyces avermitilis, например, АТСС N 53692 одновременно рентгеновским и ультрафиолетовым излучением и последующим культивированием в питательных средах с использованием ступенчатого отбора добиваются необходимых наследственных свойств продуцента, обеспечивающего производство преимущественно авермектина В, обладающего противопаразиторной активностью широкого спектра действия.
Общим недостатком обоих известных способов является невозможность вызывать трех четырех кратную мутацию при индуцированном мутагенезе, приводящую к:
1) существенному повышению биологической активности культуральной жидкости микроорганизмов по полезному признаку, не более 4 5
2) появлению стабильных штаммов по морфологическим характеристикам, например, по устойчивому отсутствию разветвленно - 2-оксокислотнодегидрогеназной и В-авермектин-0-метилтрансферазной активностей,
3) стабильности прироста биологической активности у последующих поколений во времени;
4) минимальному синтезу олигомицина в экстрактах мицелия мутантных штаммов (присутствия лишь в следовых количествах, при том, как в исходной культуре ≈16).
Цель достигается путем, по крайней мере, однократного облучения культуры Streptomyces avermitilis тормозным короткоимпульсным излучением, последующей закалочной обработкой высокоэнергичными электронами при атмосферном давлении культуральной жидкости и затем последовательного ступенчатого отбора наиболее активных вариантов продуцента. Отличие состоит в том, что культуру Str. avermitilis облучают тормозным рентгеновским короткоимпульсным излучением с регулируемыми параметрами: энергии спектра квантов в пределах 80oC160 КэВ, длительности импульса облучения (0,5oC10-7) с, пауз между облучениями (5oC25) с, при этом экспозиционная доза облучения культуральной жидкости с культурой Streptomyces avermitilis составляет (100oC2·103). Рентген: после облучения культуру охлаждают до (5oC7)oC и после выдержки в течение (2oC10) ч при этой температуре и атмосферном давлении подвергают воздействию энергичными электронами с регулируемыми параметрами энергии (80 200) КэВ, плотности тока: (6·10-5oC5,0) A/см2, длительности импульса облучения (0,5oC10-7) с, пауз между облучением (5oC25) с, причем доза облучения электронами питательной среды с культурой Str. avermitilis составляет (10-3oC1,0) Мегарад. При выходе за пределы указанных параметров цель не достигается. В частности, при энергии ниже 80 КэВ сечение взаимодействия квантов тормозного рентгеновского излучения с различными участками наследственного аппарата клеток микроорганизмов возрастает, что приводит к повышению вероятности радиационного поражения клетки (летальности) и снижению оптимальной вероятности возникновения мутагенных явлений, при энергии выше 160 КэВ хотя проникающая способность излучения и возрастает, но при этом падает сечение взаимодействия квантов тормозного рентгеновского излучения с генетическим аппаратом клетки, что приводит к снижению вероятности возбуждения мутаций.
При выходе за пределы интервала длительности импульса: при увеличении > 0,5 с возрастает вероятность процесса разрушения клеток продуцента при уменьшении < 10-7 с уменьшается количество плюс активных вариантов микроорганизмов.
При выходе за пределы интервала пауз между облучениями: при увеличении > 25 с появляются не стабильные варианты, прирост биологической активности продуцента не сохраняется, при паузе менее 5 сек возникают эффекты перегрузки клеток очагами ионизации, что также приводит к появлению минус-вариантов.
При экспозиции менее 100 рентген увеличение числа плюс-вариантов становится недостаточным. При экспозиции > 2·103 рентген, значительно возрастает число минус-вариантов. Обнаружено, что число индуцированных излучением плюс-вариантов уменьшается при комнатных температурах за счет репарационных процессов.
Процесс охлаждения обработанной культуры необходим для успокоения репарационных процессов, обычно развивающихся в клетках микроорганизмов при оптимальных температурах.
В данном случае температура 5oC7oC, является оптимальной, т.к. при выходе за пределы этого интервала не происходит удовлетворительной стабилизации снижения числа плюс-вариантов активности после закалочной обработки. Исходя из норм стабилизации устанавливают и выдержку в течение (2 - 10) ч. При выходе за пределы этого интервала нормы стабилизации числа плюс-вариантов нарушаются.
Для снижения вероятности возникновения репарационных процессов проводят закалочный процесс, заключающийся в облучении культуры Str. avermitilis энергичными электронами с регулируемыми параметрами энергии.
При энергии выше 200 КэВ энергичные электроны хотя и доходят до кодонов, но сечение столкновений при этом энергии падает, что приводит к снижению торможения процесса репараций генетического аппарата клетки.
При энергии электронов ниже 80 КэВ, экспериментальные данные не являлись корректными в связи с сильным взаимодействием электронов с фольговыми диафрагмами выпускных окон, порчей этих диафрагм электронами: при этом становится невозможным корректный биофизический эксперимент. При плотности электронов выше 5 А/см2 цель не достигается, т.к. количество энергии, принесенное электронами становится настолько велико, что это приводит к гибели продуцента авермектина. При плотности тока менее 6·10-5 A/см2 остановки процессов репарации клетки практически не происходит.
При длительности облучения более 0,5 с цель не достигается, т.к. происходят необратимые явления в культуральной жидкости и в связи с этим число мутаций снижается до естественного уровня.
При длительности облучения менее 10-7 с прирост биологической активности оказывается нестабильным ввиду оптимизации клеткой репарационных процессов в нормальных условиях. При паузе между импульсами в период обработки электронами и при закалке более 25 с происходит достаточное число мутаций, но при этом прирост биологической активности продуцента авермектина не сохраняется.
При паузе менее 5 с возникают эффекты нагрева культуральной жидкости, что приводит к снижению прироста биологической активности.
При дозах более 1,0 Мегарад наступает стойкая стерилизация всей культуральной жидкости (гибель продуцента). При дозах менее 10-3 Мрад число мутаций составляет 0,01 0,05 от естественного уровня.
Способ осуществляют следующим образом: слой водной суспензии продуцентов авермектина (0,2oC0,4) мл помещают в плоскую полиэтиленовую камеру размером 30х30х0,1 мм3 с толщиной стенки 30oC120 мкметра и облучают ТКИО, образующимся в мишени из нержавеющей стали установленной на пути высокоэнергетичного электронного пучка с регулируемыми параметрами энергии.
Мощность дозы и характер энергетического спектра ТКИО регулируется электрическим режимом ускорителя, углом падения пучка на мишень, толщиной экранов-фильтров.
После охлаждения и выдержки в холодильной камере образцы дополнительно облучают энергичными электронами (закалочный процесс) с регулируемыми параметрами энергии. После указанных обработок состояние Str. avermitilis - продуцентов авермектина соответствует т.н. кривым подавления микроорганизмов. Процессы гибели клеток и мутагенные явления в генетическом аппарате считают взаимосвязанными между собой и описывают, исходя из определенных принятых математических моделей, которые поддаются экспериментальной проверке, т.к. они связывают происходящие явления с молекулярными поражениями, которые можно количественно оценить. Учитывают число одиночных и двойных разрывов в спиралях ДНК, либо одиночные разрывы в комплементарных ДНК, расположенных друг против друга и созданных статистически независимо отдельными квантами ТКИО.
Исходя из этих соображений для продуцентов авермектина Str. avermitilis можно записать:
B/Bo=exp(αD-βD2) (1)
где: B, Bo фракция выживших клеток после обработки и контрольных соответственно;
α,β параметры одиночных и двойных событий (описывают эффективность индукции и регенерации одно и двунитевых разрывов ДНК).
При увеличении дозы облучения продуцента антибиотика выживаемость популяции, начиная с некоторого порога, для Str. avermitilis, после дозы 15oC18 Крад начинает уменьшаться. При дозах, соответствующих предлетальным В ≃ 0,0999 Вo число мутаций оптимально, причем оказываются возможными как генные, так и хромосомные мутации и повороты участков хромосомы на 180o.
После облучения и закалки производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду для получения моноспоровых вариантов культуры, последующего определения их способности к образованию авермектина и отбора высокоактивных вариантов культуры.
Пример 1. Готовят водную суспензию спор культуры: Str. avermitilis продуцентов антибиотика авермектина с начальной средней активностью
1) 150 мкг/мл (штамм А-58)
2) 60 мкг/мл (штамм А-110)
3) 90 мкг/мл (штамм А-47)
Вносят по 0,3 мл суспензии каждого штамма в полиэтиленовые пакеты с размерами 30х30 мм2 c δ 40 мкм два пакета от каждого штамма так, чтобы толщина слоя культуральной эмульсии была около (200 300) мкм. Пакеты оплавляют герметично горячим роликом. Первые пакеты помещают в реакторную камеру и облучают тормозным рентгеновским излучением (ТКИО) в режиме: E 80 КэВ, τ= 10-7 сек, Т 5 с, D 100 р, при этом поглощенная доза на всю культуральную суспензию будет составлять ≈0,10 Мегарад.
После обработки первые пакеты с суспензией помещают в холодильник на 2 ч, при t +6oC, после чего подвергают облучению энергичными электронами в режиме: E 200 КэВ, I 5 A/см2, τ= 10-7 C, Т 25oC при атмосферном давлении, при этом пакет устанавливается перед выпускным окном генератора электронов так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 5 мм, а угол падения электронного пучка на плоскость пакета был 90o. При этом дозу облучения доводят до 10-3 Мрад на всю культуральную суспензию (подбором числа импульсов облучения). После облучения производят рассев спор на чашки Петри на агаровую 2 глюкозно-картофельную среду и производят выращивание в течение 10 сут при 28oC. Затем колонии пересевают на скошенный 2 глюкозно-картофельный агар и культивируют 10 сут при 28oC. Кусочек агаровой среды (1/8 часть) со спорами вносят в качалочные колбы емкостью до 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава,
Глюкоза 4
Кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу)
Соевая мука 1,2
Белково-витаминный концентрат (БВК) 0,6
Кальций углекислый 0,6
Вода водопроводная до 100
Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 атм 30 мин и она вносится в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизуются при 0,8 ати 40 мин ph 6,8 до стерилизации.
Колбы устанавливают в качалку с числом оборотов 220 в мин и выращивают инокулят при t 28oC в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5 передают в колбы с ферментационной средой следующего состава,
Глюкоза 7
Кукурузный экстракт 0,3 (по техническому весу)
Соевая мука 1,2
Белково-витаминный концентрат (БВК) 0,6
Вода водопроводная до 100
Значение ph до стерилизации 6,8 7,2. Стерилизация компонентов раздельная. Глюкоза стерилизуется при 0,5 ати 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 ати 40 мин. Глюкоза вносится в колбы в момент засева инокулятом. Ферментацию проводили в течение 168 ч при t 28oC.
Авермектины выделяют из мицелия следующим образом. Вначале отделяют мицелий на центрифуге при 3000 об/мин, в течение 20 мин. К каждому осадку, полученного из 10 мл культуральной жидкости добавляют 10 мл 96 этилового спирта и проводят экстракцию авермектинов при комнатной температуре, при постоянном перемешивании, в течение 20 мин. После отделения мицелия в центрифуге, который получался при 3000 об./мин в течение 10 мин, определяют общее содержание авермектинов. Для этого полученный спиртовой экстракт упаривают до остаточной воды на роторном испарителе и осадок растворяют в 1,0 мл метанола. Образцы анализировали методом жидкостной хроматографии на хроматографе LKB (Швеция) с использованием аналитической колонки ODS-2, размер частиц 5 мкм. Элюирующая система содержала метанол и воду в соотношении 85:15, скорость потока 0,7 мл/мин. Разделение образцов проводили при комнатной температуре, регистрация пиков осуществлялась УФ-детектором при 246 НМ. Исследуемый штамм продуцирует авермектин серии A1; A2; B1; B2. Количество метаболитов в пиках, идентифицированных как авермектиновые, определяли по калибровочной кривой, построенной на основе авермектина B1A. Для А-58 среднее содержание авермектинов составило 290 мкг/мл при размахе изменчивости по данному признаку 250oC400 мкг/мл. Исходный штамм (из соответствующего контрольного пакета N 2) в этих условиях показывает максимальную активность 150 мкг/мл. Для А-110 среднее содержание авермектинов составило 120 мкг/мл при размахе изменчивости по данному признаку 110 140 мкг/мл. Исходный штамм показывает максимальную активность 60 мкг/мл. Для А-47 среднее содержание авермектинов составило 160 мкг/мл. Исходный штамм 90 мкг/мл.
Пример 2. Готовят образцы водной суспензии спор культуры Str. avermitilis из штаммов А-58, А-110, А-47, как указано в примере 1. Первые пакеты облучают ТКИО в режиме Е 120 КэВ, τ= 10-4 C, T 15oC, D 2·103 Р, при этом поглощенная доза на всю культуральную суспензию будет составлять ≈2,0 Мегарада. После обработки пакеты с суспензией охлаждают до t 5oC и содержат при этой температуре в течение 6 ч, после чего подвергают облучению электронами в режиме: E 80 КэВ, I 6·10-5 A/см2, τ= 10-4 C, T 5oС при атмосферном давлении так, чтобы Z 5 мм, α=90° и обрабатывают до получения D 1,00 Мрад.
После облучения проводят рассев спор, проращивание и измерение биологической активности, как указано в примере 1. Для А-58 среднее содержание авермектинов составило 300 мкг/мл. Исходный штамм показывает активность 150 мкг/мл. Для А-110 среднее содержание авермектинов составило 115 мкг/мл, исходный 60 мкг/мл. Для А-47 содержание авермектинов 160 мкг/мл, исходный - 90 мкг/мл.
Пример 3. Готовят образцы культуры из штаммов А-58, А-110, А-47; как указано в примере 1. Первые пакеты облучают тормозным рентгеновским излучением (ТКИО) в режиме: Е 160 КэВ, τ= 0,5 с, Т 25oС, D 600 р, при этом поглощенная доза на всю культуральную суспензию будет составлять 1 Мрад.
После обработки образцы содержат в течение 10 ч при t 7oC и затем облучают электронами в режиме: E 130 КэВ, I 1 A/см2, τ = 0,5 с, Т 15oС при атмосферном давлении, Z 5 мм, α = 90° D 10-1 Мрад. После облучения проводят рассев спор, проращивание и анализ, как указано в примере 1. Для А-58 содержание авермектинов составляет 295 мкг/мл, исходный 150 мкг/мл.
Для А-110 и А-47 содержание авермектинов составляет 110 мкг/мл и 150 мкг/мл, соответственно. Исходный штамм 60 мкг/мл и 90 мкг/мл, соответственно. Как видно из примеров 1 3, выход авермектинов после обработки в предлагаемом техническом решении у разных штаммов продуцентов авермектина повысился на 55oC100
В прототипе активность продуцента повысилась не более, чем на 7oC100 Таким образом, предлагаемый способ обладает универсальностью позволяет получить высокоактивные продуценты авермектинов, что позволяет увеличить съем готового продукта с ферментационной емкости производства.
Формула изобретения: Способ получения штаммов стрептомицетов продуцентов авермектина путем обработки спор культуры Streptomyces avermitilis рентгеновским облучением, отличающийся тем, что споры облучают по крайней мере однократно тормозным рентгеновским излучением с энергией квантов 80 160 кэВ с длительностью импульса облучения 0,5 10,0-7 с и паузами между облучениями 5 25 с, при этом экспозиционная доза облучения спор составляет 100 2 · 103 Р, затем споры выдерживают в течение 2 10 ч при 5 7oС и по крайней мере однократно облучают энергичными электронами с энергией 80 200 кэВ с плотностью тока 6 · 10-5 5,0 А/см2 с длительностью импульса облучения 0,5 10-7 с и паузами между излучением 5 25 с, а доза облучения электронами составляет 10-3 1,0 Мрад.