√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ — ј “»¬Ќќ—“№ё Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ ,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESHCERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ — ј “»¬Ќќ—“№ё Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ ,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESHCERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ

‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ — ј “»¬Ќќ—“№ё Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ ,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESHCERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» Ќ»“–»Ћ√»ƒ–ј“ј«џ

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: биотехнологи€, микробиологи€. —ущность изобретени€: охарактеризована аминокислотна€ и нуклеотидна€ последовательность α - и b -субъединиц нитрил-гидратазы Ќ-типа, выделенной из Rhodococcus rhodochrous J-1. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий нитрил-гидратазу, внедр€ют в вектор экспрессии, и рекомбинантный вектор используют дл€ трансформации E. coli. ѕолученный штамм способен продуцировать нитрил-гидратазу в большей степени, чем обычно примен€емые микроорганизмы. 4 с.п. ф-лы, 5 табл.,9 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2081173
 ласс(ы) патента: C12N15/31, C12N9/34, C12N9/34, C12R1:19
Ќомер за€вки: 4894871/13
ƒата подачи за€вки: 27.02.1991
ƒата публикации: 10.06.1997
«а€витель(и): Ќитто  емикал »ндастри  о., Ћтд. (JP); “ерухико Ѕеппу (JP); ’идеаки ямада (JP)
јвтор(ы): “ерухико Ѕеппу[JP]; ’идеаки ямада[JP]; “ору Ќагасава[JP]; —уехару ’ориноути[JP]; ћакото Ќиси€ма[JP]
ѕатентообладатель(и): Ќитто  емикал »ндастри  о., Ћтд. (JP); “ерухико Ѕеппу (JP); ’идеаки ямада (JP)
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к фрагменту ƒЌ , полученному из Rhodococcus rhodochrous J-1 и кодирующему полипептид с нитрил-гидратазной активностью, который гидролизует нитрил в амид. »зобретение также относитс€ к рекомбинантной ƒЌ , содержащей вышеуказанный фрагмент ƒЌ , и штамму E. Coli, трансформированному рекомбинантной ƒЌ .  роме того, оно относитс€ к способу получени€ нитрил-гидратазы с использованием рекомбинантного штамма.
Ќитрил-гидратаза или нитрилаза известна, как фермент, гидролизирующей нитрилы в амиды. ћикроорганизмы, образующие нитрил-гидратазу, включают организмы, принадлежащие к роду Bacillus, роду Bacteridium, роду Micrococcus и роду Brevibacterium (см. JP-B-62-21517/1989, US P N 4001081), роду Corynebacterium и роду Nacardia (см. JP-B-56 17918/1989, USP N 4248968), роду Pseudomonas (см. JP-3-59-37951/1984, USP N4637982/, роду Rhodococcus, роду Arthrobacter и роду Microbacterium (см. JP-A-61-162193/1986, EP-A-0188316) Rhodococcus rhodochrous (см. JP-A-2470/1990, EP-A-0307926).
¬ изобретении, использу€ методы генной инженерии, микроорганизмы преобразуют с тем, чтобы они содержали множественные копии рекомбинантной ƒЌ , кодирующей нитрил-гидратазу. ѕолученный рекомбинант продуцирует нитрил-гидратазу на заметно более высоком уровне по сравнению с обычно примен€емыми микроорганизмами.
—оздател€ми изобретени€ ранее описан фрагмент ƒЌ , полученный из Rhodococcus N-774 (FERM BP-1936), который тоже кодирует полипептид с нитрил-гидратазной активностью JP-A-2-119778/1988/.
¬ отличие от вышеприведенной ссылки в изобретении дл€ продуцировани€ нитрил-гидратазы используетс€ фрагмент ƒЌ , полученный из Rhodococcus rodochrous J-1. Ќами выделен ген, кодирующий нитрил-гидратазу, ген внедрен в приемлемый плазмидный вектор, которым трансформирован соответствующий хоз€ин, и получен трансформант, продуцирующий нитрилгидратазу, котора€ с высокой активностью гидролизует нитрилы, в т.ч. и ароматические.
»зобретение относитс€ к
(1) фрагменту ƒЌ (H), кодирующему полипептид с нитрил-гидратазной активностью, который включает α(H)и β(H) субъединицы следующих аминокислотных последовательностей, приведенных в табл.1 и 2,
(2) фрагменту ƒЌ (H) по пункту (1), содержащему нуклеотидные последовательности, кодирующие альфа (H) и бета (H)-субъединицы, а именно ƒЌ  последовательность альфа (H)-субъединицы ( см.табл.3) и ƒЌ  последовательность бета (H)-субъединицы ( см.табл.4),
(3) рекомбинантной ƒЌ , включающей ƒЌ (H) по пунктам (1)-(2), и векторную последовательность,
(4) штамму, трансформированному рекомбинантной ƒЌ  по пункту (3),
(5) способу получени€ нитрил-гидратазы, заключающемус€ в культивировании рекомбинантного штамма, охарактеризованного в пункте (4), и выделении из культуры нитрил-гидратазы,
Ќиже изобретение описываетс€ более подробно.
»зобретение осуществл€ют проведением этапов (1)-(3):  ислотное секвенирование нитрил-гидратазы
»з Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) выдел€ют и очищают два типа нитрил-гидратазы (обозначены соответственно как H-тип и L-тип), оба фермента раздел€ют с помощью ¬Ё∆’ на альфа и бета-субъединицы. ќпредел€ют часть аминокислотной последовательности каждой субъединицы (фиг.1).
(2) ѕолучение ƒЌ -зонда на ген нитрил-гидратазы
ƒЌ -зонд получают из JM105/pYUK121 (FERM BP-1937) по методике –-ј-2-119778/1990, что св€зано с высокой степенью гомологичности в аминокислотной последовательности между нитрил-гидратазой бета-субъединицы Rhodococcus N-774, охарактеризованной в указанной публикации из Official Gazette патентов японии, и субъкдиницами Rhodococcus rhodochrous J-1. ѕлазмиду pYUK121, содержащую ген нитрил-гидратазы, происход€щий из Rhodococcus N-774, получают из культуры JM105/pYU-K121. ƒЌ  pYU K121 гидролитически расщепл€ют с помощью SpnI и SalI. SphI-SalI-фрагмент содержит ген нитрил-гидратазы Rhodococcus N-774 (–ис.2). ‘рагмент ƒЌ  радиомет€т.
(3) ƒетектирование сегмента ƒЌ , содержащего ген нитрил-гидратазы из хромосом Rhodococcus rhodochrous J-1.
’ромосомную ƒЌ  получают из культуры Rhodococcus rhodochrous J-1. ’ромосомную ƒЌ  расщепл€ют с помощью ферментов рестрикции и гибридизуют с зондом этапа (2) по методике гибридизации —аузерна (Southern E.M. J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)).
(4)  онструирование рекомбинантной плазмиды.
–екомбинантную плазмиду конструируют вставкой хромосомного фрагмента ƒЌ  этапа (3) в плазмидный вектор.
(5) “рансформаци€ и отбор трансформанта, содержащего рекомбинантную плазмиду
“рансформант получают с помощью рекомбинантной плазмиды этапа (4). —одержащий рекомбинантную плазмиду трансформант отбирают с помощью зонда этапа (2) по методике гибридной колонии (R. Bruce Wallace и др. Nuc. Aci. Res. 9, 879 (1981).  роме того, присутствие гена натрил-гидратазы подтверждают методом гибридизации —аузерна. ќтобранную в результате плазмиду обозначают как PNHJ 10H.
(6) ¬ыделение и очистка плазмидной ƒЌ  и конструирование рестрикционной карты
¬ыдел€ют и очищают полученную на этапе (5) плазмидную ƒЌ  PNH J 10H. ƒл€ определени€ содержащей ген нитрил-гидратазы области конструируют ее рестракционную карту (фиг.6).
(7) —еквенирование ƒЌ 
ƒобавочный сегмент внедренного ƒЌ  фрагмента в плазмиде pNHJ10H отщепл€ют с помощью соответствующего фермента рестрикции. ¬недренный фрагмент затем примен€ют дл€ секвенировани€. Ќуклеотидна€ последовательность фрагмента ƒЌ  (фиг.7) показывает, что в ней содержитс€ последовательность, прослеженна€ на основании аминокислотной последовательности этапа (1).
(8) ѕолучение нитрил-гидратазы и превращение нитрилов в амиды
 ультивируют трансформант этапа (7). Ѕактериальные клетки смешивают с нитрилами (субстрат нитрил-гидратазы) и получают амиды.
Rhodococcus rhodochrous J-1 депонирован в исследовательском институте ферментации агентства и промышленных наук и технологий, где ему присвоен регистрационный номер FERM BP-1478.
’арактеристики штамма J-1 (FERM BP-1478) представлены ниже:
(1) »сточник и депонирование
Ўтамм j-1 выделен из почвы в —акио-ку  иото и депонирован в международном депозитарии, в соответствии с Ѕудапештским договором, в научно-исследовательском институте ферментации, японском агентстве промышленных исследований под номером FERM BP-1478.
(II) Ѕактериологические свойства
(a) ћорфологи€
(1) ‘орма и размер клеток 0,9 1,0 мк x 3-10 мк
(2) ѕолиморфизм клеток: клетка представл€ет собой длинную палочку на начальной стадии, котора€ затем растет с изменением формы (изгиба€сь) и делитс€ на короткие бациллы.
(3) ѕодвижность нет
(4) —поры не образует
(5) √раммоположительный
(6)  ислотоустойчивость отрицательна€
(7) √етерофильный гранулоцит обнаруживаетс€
(б) —осто€ние роста на различных средах культивировани€ при 30oC
(1) на ровном агаре круг диаметром 1 мм (после 48 ч) с неправильной, плоской и гладкой поверхностью, довольно сухой и непрозрачный, бледно оранжево-розовый;
(2) на косом агаре нить с гладкой поверхностью, довольно гладкий, бледно оранжево-розового цвета;
(3) на жидком агаре мучнистый рост, формирование мембраны бактериальной клетки и рост сопровождаетс€ образованием мутности и осадка;
(4) рост при уколе на желатиновой среде прекрасно растет на поверхности, но не в нижнем слое, разжижени€ в желатине не наблюдаетс€,
(5) лакмусовое молоко не измен€ет
(в) ‘изическо-химические свойства:
(1) разложение нитратов положительно
(2) денитрификаци€ отрицательно
(3) ћ– тест отрицательно
(4) YP тест отрицательно
(5) продуцирование индола положительно
(6) продуцирование сероводорода положительно
(7) гидролиз крахмала отрицательно
(8) ”тилизаци€ лимонной кислоты:
культуральна€ среда  окура отрицательно
культуральна€ среда  ристензена положительно
(9) утилизаци€ неорганических азотных источников нитрата положительно
соли аммони€ положительно
(10) образование цвета отрицательно
(11) ”роаза положительно
(12) оксидаза отрицательно
(13) каталаза положительно
(14) гидролиз целлюлозы отрицательно
(15) ѕараметры роста pH 5-10, температура: 10 41oC
(16) аэробный
(17) разложение тирозина положительно
(18) разложение аденина положительно
(19) фосфотаза положительно
(20) гидролиз “вина 80 положительно
(21) O F тест отрицательно
(22) термоустойчивость (в 10% сн€тых сливках при 2oC в течение 15 мин) нет
(23) образование кислоты и газа из сахара(см. табл.5)
(24) –ост в среде в качестве использовани€ единственного углеродного источника:
инозитол -
мальтоза +
D-маннитол +
рамноза -
D-сорбитол +
м-оксибензольна€ кислота +
адипат натри€ +
бензоат натри€ +
цитрат натри€ +
лактат натри€ +
тестостерон +
L-тирозин +
глицепин (1% масса/объем) +
“регалоза +
p-оксибензольна€ кислота (1%) (масс/объем) +
+ положительно, отрицательно.
(25)∆ирные кислоты и анализ клеточной стенки: содержание насыщенных и ненасыщенных кислот с пр€мой цепью и туберкулостериновой кислоты. TLC тест на миоликовую кислоту дает одно единственное п€тно.
¬ результате классификации выше перечисленных бактериологических свойств в свете ќпределител€ Ѕерджи, штамм j-1 €вл€етс€ аэробным. √раммположительный, слабо кислотоустойчивый, каталазопозитивный и не образующий эндоспоры и жгутики. ќн также представл€ет собой бациллу выт€нутой формы, похожую на мицелий на начальной стадии роста, далее растет с разветвлением и затем делитс€ на короткие бациллы. “аким образом это доказывает принадлежность штамма бактери€м Nocardia. јнализ состава жирных кислот показал, что бактери€ содержит насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с пр€мой цепью, содержащие туберкуло-стеариновую кислоту. TLC анализ миколиковой кислоты дает одно единственное п€тно, имеющее те же самые значени€ RF, что и стандарты вида Rodococcus rhodochrous (IFO 3338) и что, следовательно, отличает их от рода Mycodacterium Ўтамм также отличаетс€ от рода Nocardia составом (числом атомов углерода)миколиковой кислоты. ¬ результате рассмотрени€ других биохимических свойств было доказано, что данный штамм принадлежит к виду Rhodococcus rhodochrous.
ћикроорганизмы имеют тенденцию мутировать, соответственно нет необходимости указывать, что микроорганизмы, даже если он €вл€етс€ мутантом компетентного шлама, такого как штамм j-1, может быть использован в за€вленном способе, пока у него сохран€етс€ способность продуцировать нитрил гидратазу в присутствии ионов кобальта.
–екомбинантный штамм E.coli TGI/pNHJIOH, полученный в результате трансформации плазмидой pNHJIOH и отбора трансформантов, депонирован там же и ему присвоен регистрационный номер FERM BP-2777. ”слови€ культивировани€ штамма привод€тс€ ниже.
ѕри реализации изобретени€, кроме названного, могут быть использованы и другие векторы, в том числе
плазмидный вектор (напр. pAT153, pMP9, pHO624, pKS и т.д.), фаговый вектор (напр.л€мбда Qt II (“ойобо), „арон 4ј (јмерсхем) и т.д.)
‘ерменты, которые могут быть использованы, включают: Snh I, Sal T, Ecor I, Sca I, Bam H I и т.п. выпускаемые промышленностью (“акара Ўузо). ƒл€ трансформации могут быть использованы разнообразные хоз€ева, в том числе E. coli JM105 » E.coli TGI, но без ограничени€ только ими.
 ультуральной средой дл€ трансформанта служат обычно примен€емые дл€ подобные целей среды.
ѕревращение нитрилов в амиды осуществл€ют использованием очищенной нитрил-гидратазы, сырой нитрил-гидратазы, рекомбинантного штамма, а также выделенных бактериальных клеток или обработанного материала клеток и т.п. полученных из названного штамма.
ѕриемлемые дл€ изобретени€ нитрилы включают ароматические нитрилы с 4-10 атомами углерода в ароматическом фрагменте и алифатические нитрилы с 2 6 атомами углерода, описанные в публикации ≈вропейского патента N 0307926. “ипичные примеры нитрилов включают: 4-, 3- и 2-цианопиридин, бензонитрил, 2,6-дифторбензонитрил, 2-тиофекарбонитрил, 2-фуронитрил, цианопиразин, акрилонитрил, метакрилонитрил, кротононитрил, ацетонитрил и 3-гидроксипропионитрил.
ѕоложительный эффект изобретени€.
»зобретением описываетс€ аминокислотна€ последовательность альфа- и бета субъединиц нитрил-гидратазы, происход€щей из Rhodococcus rhodochrous J-1. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий нитрил-гидратазу, внедр€ют в вектор экспрессии, а полученный рекомбинантный вектор примен€ют дл€ трансформации. “рансформант содержит множество копий и способен продуцировать нитрил-гидратазу на гораздо более высоком уровне по сравнению с обычно примен€емыми микроорганизмами.
Ќа фиг.1 представлены N концевые аминокислотные последовательности альфа и бета- субъединиц нитрил-гидратазы, продуцированных Rhodococcus rhodochrous J-1.
Ќа фиг. 2 5 представлена ƒЌ  последовательность гена нитрил-гидратазы Rhodococcus N-774, примен€емого в качестве ƒЌ -зонда.
Ќа фиг. 2-6 показана рестрикционна€ карта рекомбинантной плазмиды pNHJ10H.
Ќа фиг.7-9 представлена ƒЌ - последовательность фрагмента ƒЌ  в pNHJ10H, происход€щего из Rhodococcus rhodochrous J-1, и прослеженной аминокислотной последовательности.
»зобретение подробно иллюстрируетс€ нижеследующим примером, который не предназначен дл€ ограничени€ изобретени€.
¬ примере использованы следующие сокращени€:
TE “рис-HCI (10 мћ, pH 7,8), Ёƒ“ј (I мћ, pH 8)
TNE “рис-HCI (50 мћ, pH 8), Ёƒ“ј (I мћ, pH 8), NaCI (50 мћ)
STE трис-HCI (50 мћ, pH 8), Ёƒ“ј (5 мћ, pH 8), сахароза (35 мћ)
среда 2xYT 1,6% “риптон, 1%-ый дрожжевой экстракт, 0,5 NaCI
ѕример. (1) ¬ыделение и очистка нитрил-гидратазы и частичное аминокислотное секвенирование нитрил-гидратазы
Rhodococcus rhodochrous J-1 культивируют 80 часов в среде (3 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л KH2PO4, 0,5 г/л K2HPO4, 0,5 г/л MgSO4·4H2O, 0,01 г/л CoCI2 и 3 г/л кротонамида, pH 7,2). —обирают бактериальные клетки. 50 г бактериальных клеток разрушают и фракционируют сульфатом аммони€. ќбразец диализуют и диализат центрифугируют. ∆идкую часть хроматографируют на колонке с ƒ≈ј≈-÷еллофином, колонке с ‘енил-—ефарозой, колонке с —ефадексом G-150 и колонке с ќктил-—ефарозой. ѕолучают и диализуют две фракции с ферментативной активностью. ƒиализат перенос€т на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (—енцу ѕак VP-304-1251, —еншу  адану) и получают соответственно две субъединицы (альфа и бета). — помощью белкового секвенатора модели 470ј прикладных биосистем определ€ют N-концевые аминокислотные последовательности альфаI(H), бетаI(H)-, альфаI(L)- и бетаI(L) субъединиц, јминокислотные последовательности приведены на –ис. 1.
(2) ѕолучение ƒЌ -зонда   гену нитрил-гидратазы
¬ 100 мл среды 2х”“, с содержащей 50 мкг/мл ампицилина, культивируют 12 ч при 30oC E.coli JM105 (FERM BP-1937), содержащей pJUK121. Ѕактериальные клетки собирают и к ним добавл€ют TNE.  леточную суспензию затем центрифугируют. 8 мл STE и 10 мг лизоцина добавл€ют к осадку. —месь инкубируют 5 мин при 0oC, после чего добавл€ют 4 мл 0,25 ћ Ёƒ“ј. «атем к смеси при комнатной температуре прибавл€ют 2 мл 10% Na-DC и 5 мл 5 ћ NaCl. ѕолученную смесь инкубируют 3 ч при 0 4oC и затем ультрацентрифугируют.   супернатану добавл€ют 1/2 объема ѕЁ√ 6000. —месь инкубируют 12 ч при 0 - 4oC и центрифугируют.   осадку добавл€ют TNE с добавлением объема до 7,5 мл, после чего к суспензии прибавл€ют CsCl. —месь центрифугируют с удалением белков. «атем к супернатанту добавл€ют 300 500 мг/мл этидий-бромида. —месь перенос€т в центрифужную пробирку, пробирку герметизируют нагреванием и ультрацентрифугируют. — помощью перистальтического насоса экстрагируют ковалентно замкнутую кольцевую ƒЌ .   экстракту добавл€ют насыщенный водной изопропиловый спирт в количестве, несколько превышающем равное количество, дл€ извлечени€ этидий-бромида. ќбразец диализуют по “≈ и получают 3 мл очищенной плазмиды pYUK121.
pYUK121 ƒЌ  гидролитически расщепл€ют с помощью Sph I и Sal I и получают фрагмент ƒЌ  в 2,07 т.п. о. содержащий ген нитрил-гидратазы, происход€щий из Rhodococcus N-774. ‘рагмент радиомет€т 32p с получением зонда. Ќуклеотидна€ последовательность зонда приведена на фиг.2.
(3) ѕолучение фрагмента ƒЌ , содержащего хромосомный ген нитрил-гидратазы
¬ 100 мл среды (10 г/л глюкозы, 0,5 г/л KH2PO4, 0,5 г/л K2HPO4, 0,5 г/л MgSO4 · 7H2O, 1 г/л дрожжевого экстракта, 7,5 г/л пептона, 0,01 г/л (CoCl2, 7,5 г/л мочевины, 1% глицина или 0,3 мкг/мл ампицилина, 1 л воды, pH 7,2) культивируют Rhodococcus rhodochrous J-1. Ѕактериальные клетки собирают и промывают TNE. «атем суспендируют в 10 мл TE.   суспензии добавл€ют 4 мл 0,25 ћ Ёƒ“ј; 10 20 мг лизоцима, 10 20 мг ахромопротеазы и 10 мл 10 х Na-Dc. —успензию инкубируют 3 ч при 37oC и затем к ней добавл€ют 15 мл фенола. —месь инкубируют 15 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют. ¬ерхний слой удал€ют и к надосадочной жидкости добавл€ют 0,7 мл 2,5 ћ ацетата натри€ и диэтиловый эфир. —месь центрифугируют и верхний слой отбрасывают.   нижнему слою добавл€ют два объма этанола и извлекают ƒЌ≈ стекл€нной палочкой. ƒЌ  ополаскивают по 5 мин в каждом случае смесью “≈-этанол в отношени€х 2:8, 1:9 и 0:9 (об./об.). «атем ƒЌ  вновь суспендируют в 2 4 мл “≈ (37oC).   суспензии добавл€ют 10 мкл смеси –Ќ азы ј и T1 и смесь инкубируют при 37oC.   смеси добавл€ют равное количество фенола, после чего центрифугируют.   надосадочной жидкости добавл€ют более, чем равное, количество эфира. —месь вновь центрифугируют, верхний слой отбрасывают, а нижний слой сохран€ют. Ќижний слой диализуют около суток в 2 л “≈, содержащего небольшое количество хлороформа, и дополнительно диализуют в свежем “≈ в течение 3 4 ч. ѕолучают 4 мл сырой хромосомной ƒЌ .
  15 мкл сырой хромосомной ƒЌ  добавл€ют 10 мкл “≈, 3 мкл реакционного буфера (10x) и 2 мкл Sac I. ѕолученную смесь инкубируют час при 37oC и подвергают электрофорезу на агарозном геле (60 B, 3 ч). √ибридизацию хромосомной ƒЌ  до —аузерну провод€т с применением зонда этапа (2). Ќайдено, что фрагмент размером примерно 6 т.п.о. характеризуетс€ сильной гибридизацией.
15 мкл хромосомной ƒЌ  гидролитически расщепл€ют с помощью NaCl и подвергают электрофорезу на геле агарозы по вышеприведенной методике. ¬ геле вырезают фрагмент ƒЌ  размером 6 т.п.о. перенос€т его в три объема 8 NaClO4. ѕосле солюбилизации раствор нанос€т в виде п€тна на фильтровальную бумагу GF/c (¬атман) диаметром 6 мм.   фильтровальной бумаге добавл€ют дес€ть капель ( 100 мкл) “≈, содержащего 6 M NaClO4, и затем дес€ть капель ( 100 мкл) 95% этанола. Ѕумагу сушат 3 мин на воздухе и помещают в пробирку Ёппендорфа. ¬ пробирку добавл€ют 40 мкл “≈ и инкубируют 30 мин при 47oC. «атем пробирку центрифугируют. ¬ результате получают около 40 мкл надосадочной жидкости с фрагментом ƒЌ  6 т.п.о. содержащим ген нитрилгидратазы хромосомной ƒЌ .
Ќиже приводитс€ способ внедрени€ в вектор фрагмента ƒЌ  в 6 т.п.о.
(4) ¬недрение в вектор фрагмента хромосомной ƒЌ 
  10 мкл pUC19 добавл€ют 10 мкл TE, 3 мкл реакционного буфера (10х) и 2 мкл SacI и смесь инкубируют 1 ч при 30oC. «атем дл€ прекращени€ реакции к смеси прибавл€ют 2 мкл 0,25 m Ёƒ“ј. ѕосле этого к смеси прибавл€ют 7 мкл “рис-HCl (1M, pH9) и 3 мкл бактериальной щелочной фосфатазы (ЅЎ‘). —месь инкубируют 1 ч при 65oC и затем прибавл€ют “≈ до полного объема в 100 мкл. —месь трижды экстрагируют равным количеством фенола.   экстракту добавл€ют равное количество эфира. Ќижний слой отдел€ют и к нему прибавл€ют 10 мкл 3 M ацетата натри€ и 250 мкл этанола. —месь инкубируют 30 мин при -80oC, центрифугируют, сушат и вновь суспендируют в “≈.
—мешивают 5 мкл полученной в результате ƒЌ  pUC19 и 40 мкл фрагмента ƒЌ  в 6 т.п.о. этапа (3).   смеси добавл€ют 6 мкл буфера легировани€, 6 мкл ј“‘ (6 мг/мл) и 3 мкл T4 ƒЌ -лигазы. —месь инкубируют 12 ч при 4oC получением рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент ƒЌ  в 6 т.п.о. кодирующий целевой фермент в SacI сайте pUC19.
(5) “рансформаци€ и отбор трансформантов
10 мл среды 2х”“ инокулируют E.col:TGI/јмершам) и инкубируют 12 ч при 37oC. ѕосле инкубировани€ полученную культуру прибавл€ют к свежей культуре 2х”“ до концентрации 1% и полученную смесь инкубируют два часа при 37oC.  ультуру центрифугируют и осадок суспендируют в 5 мл холодного 50 мћ раствора CaCl2. —успензию оставл€ют на 40 мин на льду и затем центрифугируют.   осадку добавл€ют 0,25 мл холодного 50 мћ раствора CaCl2 и 60 мкл рекомбинантной ƒЌ  этапа (4). —месь инкубируют 40 мин при 0oC, подвергают тепловому шоку в течение 2 мин при 42oC, 5 мин выдерживают на льду и прибавл€ют к 10 мл среды 2х”“. —месь инкубируют 90 мин при 37oC со встр€хиванием и затем центрифугируют. “вердую часть суспендируют в 1 мл среды 2x”“ и две аликвоты по 10 мкл суспензии нанос€т на 2x”“ агаровую пластинку, отдельно содержащую 50 мкг/мл ампицилина. ѕластинку инкубируют при 37oC. ¬ыращенную на пластинке колонию отбирают методом гибридизации колонии, а именно колонию перенос€т на нитроцеллюлозный фильтр и гидролитически расщепл€ют. ƒЌ  фиксируетс€ на фильтре и гибридизируетс€ с зондом этапа (2). ‘ильтр подвергают радиоавтографии и затем отбирают рекомбинантную колонию.  роме того, присутствие гена нитрил-гидратазы в трансформате подтверждено методом гибридизации —аузерна.
(6) ¬ыделение и очистка рекомбинантной плазмиды и конструирование рестрикционной карты внедренного фрагмента ƒЌ 
ќтобранный на этапе (5) трансформант выращивают 12 ч при 37oC в 100 мл среды 2х”“, содержащей 50 мкг/мл ампицилина. Ѕактериальные клетки собирают и к ним добавл€ют TNE.  летки вновь собирают центрифугированием и к ним добавл€ют 8 мл STE и 10 мг лизоцима. —месь инкубируют 5 мин при 0oC и затем добавл€ют 4 мл 0,25 ћ Ёƒ“ј, 2 мл 10% NaDC (при комнатной температуре) и 5 мл 5 ћ NaCl. —месь инкубируют 3 ч при 0-4oC и ультрацентрифугируют.   надосадочной жидкости добавл€ют 1/2 объема 30% ѕЁ√ 6000, полученную смесь инкубируют 12 ч при 0-4oC и вновь центрифугируют.   осадку добавл€ют TNE с доведением объема до 7,5 мл. ƒл€ удалени€ белков к суспензии прибавл€ют CsCl. «атем к надосадочной жидкости добавл€ют 300-500 мг/мл этидий-бромида и смесь перенос€т в центрифужную пробирку. ѕробирку герметизируют нагреванием и ультрацентрифугируют. — помощью перисталтического насоса удал€ют ковалентно замкнутую непрерывную кольцевую ƒЌ , к которой дл€ удалени€ этидий-бромида добавл€ют несколько больше, чем равное количество изопропилового спирта, насыщенного водой. ќбразец ƒЌ  диализуют в “≈ с получением около 3 мл очищенной рекомбинантной ƒЌ . ѕолученна€ в результате рекомбинантна€ плазмида, содержаща€ фрагмент ƒЌ  в 6,7 т.п.о. обозначена как pNHJIOH.
ѕолученную плазмидную ƒЌ  гидролитически расщепл€ют с помощью ECORI, BamHI, PstI, SacI, SalI. —конструированна€ рестракционна€ карта приведена на фиг.6.
(7) —еквенирование ƒЌ 
ѕоложение гена нитрил-гидратазы в фрагменте ƒЌ  плазмиды pNHJIOH определ€ют в соответствии с конструированными рестрикционными картами и методом гибридизации —аузерна. ƒобавочный сегмент в pNHJIOH отщепл€ют с помощью PstI и SalI с получением из фрагмента ƒЌ  в 6 т.п.о. фрагмента в 1,87 т.п.о.
ѕолученный фрагмент ƒЌ  секвенируют по методике «ангера (Sauger F, Science 214, 1205-1210 (1981)) (с использованием фагового вектора ћ13. Ќуклеотидна€ последовательность фрагмента ƒЌ  в 1,97 т.п.о (pNHJIOH) и приведена на фиг.7.
јминокислотна€ последовательность, отслеженна€ из нуклеотидной последовательности, как было найдено, оказалась полностью идентичной аминокислотной последовательности, определенной на этапе (1). јнализ последовательности, кроме того, вы€вил, что фрагмент ƒЌ  содержит последовательность, кодирующую альфа и бета субъединицы.
(8) ѕолучение и очистка нитрил гидратазы
–екомбинантный штамм E.coIi, содержащий pNHJIOH, был культивирован аэробно в 10 мл, 2х”“ среды, содержащей 30 мг/мл ампицилина в 50 мл пробирке при 30oC, и затем перенесен в 10 мл такой же среды в 500 мл качающуюс€ колбу с CoCl 26H20 (0,001% вес/объем) и мочевиной (0,75% вес/объем). ѕосле перемешивани€ при 30oC IPIG был добавлен до конечной концентрации 1 миллимоль дл€ индуцировани€ Lac промотора. ѕосле дополнительных 10 часов культивации клетки были собраны центрифугированием, суспендированы в 0,1 M HCPCO буфера (pH 7,5), разрушены путем обработки звуком в течение 10 мин (219 к√ц, изонатор модель 201 ћ,  убота, “окио, япони€) и центрифугированы при 12,00 х г/мин.
ѕолученную надостаточную жидкость используют дл€ ферментативного анализа и подвергают дальнейшей очистке. ‘ерментивное испытание провод€т в реакционной смеси (12 мл), содержащей 50 мћ калийфосфатного буфера (pH 7,5), 6 мћ бензонитрила и необходимое количество фермента. –еакцию осуществл€ют в течение 30 мин при 20oC и прекращают добавлением 0,2 мл IM HCl.  оличество образовавшегос€ в реакции бензамида определ€ют с помощью ¬Ё∆’. ƒл€ контрол€ используют смесь, приготовленную по вышеприведенной методике, но из E.col: TG-1. ”ровень нитрил-гидратазной активности в бесклеточных экстрактах E.col: cpNHJIOH составл€ет 1,75·10-3 единиц/ мг при культивировании в среде 2х”“ в присутствии CoCl2 и »ѕ“√. ¬ реакционной смеси TG-1/ pNHJIOH обнаружен бензамид, в то врем€ в реакционной смеси TG-1 бензамид не обнаружен.
ƒл€ дальнейшей очистке полученную надосадочную жидкость фракционируют сульфатом аммони€ (30-60% масса/объем) и диализуют в 0,01 M Hepes буфере (pH 7,5). ќтдиализованный раствор, нанос€т на колонку DEAESephacel (Pharmahim, Sweden) уравновешенную буфером 0,1 ћ Hepes (pH 7,5), содержащим 0,1 ћ хлорид кали€, отмывают 0,1 ћ Hepes (pH 7,5), содержащим 0,2 ћ хлорида кали€, и элюируют 0,1 ћ Hepes (pH 7,5), содержащим 0,3 ћ хлорида кали€. јктивные фракции выбирают, диализуют против буфера 0,1 ћ Hepes (pH 7,5). –аствор, содержащий фермент, наноситс€ на колонку Phenil-Sepharose CL-4B (Pharmacia), уравновешенную буфером 0,1 ћ Hepes (pH 7,5), содержащим 10% насыщенного сульфата аммони€.  олонка была отмыта в том же самом буфере и элюировна тем же буфером с обратным градиентом концентраций сульфата аммони€ (7,5-0%). јктивные фракции далее собирают, нанос€т на колонку сверхтонкого разделени€ Sephacryl-s-300 и элюируют буфером 0,1 ћ Hepes(pH 7,5), содержащим 0,5 ћ хлорида кали€. јктивные фракции собирают, преципитируют 60% насыщенным сульфатом аммони€ и диализуют в буфере 0,1 ћ Hepes (pH 7,5).
‘ормула изобретени€: 1. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, полученный клонированием гена нитрил-гидратазы из Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM ¬–-1478), включающий следующую нуклеотидную последовательность: α(H)-субъединица:

Β(Ќ)-субъединица:

2. –екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  pNHJION, кодирующа€ полипептид со свойствами нитрилгидратазы, содержаща€ SacI-SacI фрагмент с геном нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous J-1 ¬– 1478 размером 6,0 т.п.о. SacI-SacI-фрагмент вектора pUC 19 размером 2,686 т.п.о. уникальные сайты рестрикции: 2 сайта Sac 1; 2 сайта SalI, 1 сайт Bam Ќ1 и 1 сайт PSt1; генетический маркер; Ampv ген резистентности к ампициллину.
3. Ўтамм бактерий Escherichia coli FERM ¬–-2777 (TG1/pNHJIOH) продуцент полипептида со свойствами нитрилгидратазы.
4. —пособ получени€ полипептида со свойствами нитрилгидратазы, предусматривающий культивирование штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийс€ тем, что культивируют штамм бактерий Escherichia coli FERM ¬–-2777 (TGI/pNHJ IOH).