Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК АЛЬФА R 1 - 6, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 13-Й И 21-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК АЛЬФА R 1 - 6, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 13-Й И 21-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК АЛЬФА R 1 - 6, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 13-Й И 21-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: генетическая инженерия и медицинская генетика, для достоверной идентификации хромосом 13 и 21 в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомной патологии, такой как синдромы Дауна и Патау, маркерные хромосомы, а также для цитогенетического картирования генома человека. Сущность изобретения: создание нового молекулярно-генетического маркера 13-й и 21-й хромосом человека, специфичного для центромерного района, включая гетерохроматин обоих плеч, применение которого позволяет проводить простым способом диагностику аномалий хромосом 13 и 21 в медицинской генетике, включая пренатальную и постнатальную диагностику синдромов Дауна и Патау, а также мозаичных случаев заболеваний и маркерных хромосом. Данная последовательность нуклеотидов относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК-зонда, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ. Новая рекомбинантная плазмида ДНК отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющего два внутренних уникальных сайта рестрикции Pst1 и ограниченного EcoR1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот новый ДНК-зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 4, 14, 15, 18, 20, 22. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерными районами хромосом 13 и 21 у человека.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

   С помощью Яндекс:  

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2087534
Класс(ы) патента: C12N15/00, C12Q1/68, G01N33/48
Номер заявки: 95108057/13
Дата подачи заявки: 18.05.1995
Дата публикации: 20.08.1997
Заявитель(и): Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии
Автор(ы): Соловьев И.В.; Юров Ю.Б.; Ворсанова С.Г.; Яковлев А.Г.; Демидова И.А.
Патентообладатель(и): Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии
Описание изобретения: Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 13-й и 21-й хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомной патологии, диагностику анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека. Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК-зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК-зондов чаще всего используют уникальные (однокопийный или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомо-специфичные ДНК-зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократные повторяющиеся от нескольких сотен до нескольких тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 п.о.) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК-зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, II и X человека (Гиндилис и др. 1985, N 1203108; Юров и др. 1989, N 1494724; Юров и др. 1993, N 1792429, Юров и др. 1994, патентная справка N 94012782). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК-зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосомах 13 и 21 (B. Vissel, K.H. Choo "Four distinot alpha satellite subfamilies shared by human chromosomes 13, 14 and 21", 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2, 271 277; S. Lawrence et al. "Integration of gene maps: Cromosome 21 (human genome)", 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8, 7210-7214; Murata Makiko, Ohki Reiko "Isolation of centromeric region of human chromosomes 21 long arm DNA-markers and their mapping by pulse gel-electrophores", 1993, Kyorin Med. Soc. 24, 3, 465 476; Geronimo i. et al. "Physical map of the short arm/centromeric region of human chromosome 21", 1993, Amer. J. Hum. Genet. 53, 3, 1294). Эти ДНК-зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения конструирования ДНК-зондов для маркировки хромосом 13 и 21 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосом 13 и 21, не обладают достаточно высокой сецифичностью для центромерных районов хромосом 13 и 21 человека. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуются корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосом 13 и 21. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерных районов хромосом 13 и 21 человека, которые позволили бы проводить маркирование и идентификацию центромерных районов хромосом 13 и 21 в интерфазных и метофазных клетках.
Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифического маркирования центромерных районов хромосом 13 и 21 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида альфа R1-6 отличается от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосом 13 и 21 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерного района хромосом 13 и 21 человека данное техническое решение разработано впервые.
Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 13-й и 21-й хромосом человека, а именно специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами:
строго маркировал околоцентромерные районы хромосом 13 и 21 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;
эффективно маркировал центромерные районы хромосом 13 и 21 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.
Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pBR 325 (6,1 т.п.о.) по EcoR1-сайтам фрагмент ДНК человека альфа R1-6 размером 680 пар оснований, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 13-й и 21-й хромосом человека. Данный фрагмент имеет длину 680 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК-зонда, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.
Новый ДНК-зонд отличается от известных геномных фрагментов ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющего 2 внутренних уникальных сайта рестрикции Pst1 и ограниченного EcoR1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот новый ДНК-зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 4, 14, 15, 18, 20, 22. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерными районами хромосом 13 и 21 человека.
Конкретная цель исследования достигалась следующим образом.
Источником выделения маркерного фрагмента альфа R1-6 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидов мужского пола) обрабатывают рестриктазой EcoR1 до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью легирования по "липким" концам в EcoR1-сайт бактериального плазмидного вектора pBR 325. Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинатную клонотеку (по типу "short gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.
На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (32P) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.
Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при 37oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при 37oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в отношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37oC и используют в 4 опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl2; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл3H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20 40 мин при 20oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25·106 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.
Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-6 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96% спирте; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2·SSC), в течение 10 мин при 100oC в течение 17 18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2·SSC при комнатной температуре, в 70 и 96% -ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10 - 15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 x или 1125 x.
Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-6 локализован в прицентромерных районах 13-й и 21-й пар гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом.
Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды альфа R1-6 для идентификации хромосом 13 и 21 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.
Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0 4oC. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (pH 8,0) 5 мМ MgCl, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05% Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450g, 10 мин).
Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50мМ трис HCl, pH 8,0; 5мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1% Лизат инкубируют при 65oC не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ HBO и 5 мМ EDTA (pH 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см2 в течение 6 8 ч.
После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.
Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека E. Coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пентона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37oC на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HC1 (pH 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона X-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10 15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65oC. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при 65oC проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18oC, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 x SSC (1 x SSC 18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81oC в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1М KCl + 20 мМ трис-HCl pH 7,1 при 0oC. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см3 объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают 50%-ным изопропиловым или 70%-ным этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.
ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (pH 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при 0oC. К пробе добавляют 2 мл раствора 0,2 н. NaOH с 1% SDS и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и осаждают на 1 ч при 0oC. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18oC, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.
Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мм MgCl, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5 8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37oC. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70oC в течение 10 мин или добавлением 1/4 объема смеси 0,1%-ного раствора SDS, 25% -ного раствора сахарозы, 5 мМ ацетат натрия и 0,05%-ного раствора бромфенолового синего.
Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pBR 325, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки.
Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E.coli HB 101, выращивают на качалке при 37oC до мутности А 0,4 0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10 15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0oC раствора 100 мМ CaCl2, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ CaCl2. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20 30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl2 с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0oC по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80oC, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4 5 месяцев.
К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0oC добавляют 0,1 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45 60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42oC) на 60 90 с и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2 3 ч при 37oC. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) и добавляют необходимые антибиотики, обусловливающие селекцию трансформированных клонов.
30 мкл раствора, содержащего 0,1 0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl2, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70oC 10 мин, после чего к раствору добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (pH 7,4); 50 мМ MgCl2, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20 - 40 мкКи одного из 32P-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед. ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при 37oC. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2 5·108 имп./мин/мкг ДНК.
Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при 37oC. Выросшие колонки вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5 10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой, его дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (pH 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (pH 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 x SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 37oC. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при 80oC в течение 1 2 ч.
Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68oC в растворе 2 x SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60 90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промывают фильтровальной бумагой и помещают в 4
5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6 x SSC; 0,1% SDS; 10 декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу 32P-меченой ДНК с суммарной активностью 1 5 x 106 имп./мин. Гибридизацию проводят при 68oC в течение 18 24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 x SSC с 0,5% SDS при 68oC в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2 24 ч экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.
Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoR 1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR 1 и идентификации полосы AR1 (340 н.п.). В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно легко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа R1-6.
Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина (фирма "Difco", США) в пенициллиновых флаконах при 37oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при 13oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37oC и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 M MgCl2); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением H3-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл 3H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20 40 мин при 20oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 · 106 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.
Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-6 с метафазными хромосомами in situ проводят в предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 x SSC), в течение 10 мин при 100oC. Гибридизацию проводят при 37oC в течение 17 18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 x SSC при 37oC, в двух сменах 2 x SSC при комнатной температуре, в 70 96%-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловом проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10 15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000x или 1125x.
Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-6 локализуется только в прицентромерных районах 13-й и 21-й гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы.
Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 13-й и 21-й хромосомы в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов данных пар) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размерах 13-й и 21-й хромосом и их форме.
Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-6 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителя сбалансированной транслокации (переноса) более 3/4 длинного плеча 13-й хромосомы на конец длинного плеча 2-й хромосомы. В результате такой транслокации длинное плечо 13-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика данного нарушения (потери хромосомного материала) практически невозможна. Однако с помощью молекулярного маркера альфа R1-6 для 13-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным длинным плечом в этой паре и потеря хромосомного материала в нем легко распознаются непосредственно под микроскопом.
Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа R1-6 для 23-й и 21-й хромосом является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая X-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца полого хроматина, образованного одной из двух X-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью маркера альфа R1-6, специфически маркирующего только 13-е и 21-е хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа R1-6 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 13-й и 21-й хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и приготовления радиоавтографов) четыре практически одинаковых по размеру скопления /кластеров/ зерен серебра (сигналов изотопной метки). В редких случаях можно видеть в интерфазном ядре три или два крупных скопления зерен метки, если гомологичные хромосомы расположены очень близко друг от друга.
Все процедуры по выделению образца альфа R1-6 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в примерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются четыре скопления гранул метки /четыре кластера/, соответствующих гомологичным хромосомам 13-й и 21-й пар. В разных ядрах расстояния между кластерами различны. Таким образом, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.
Таким образом, клонированная последовательность ДНК альфа R1-6 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 13-й и 21-й хромосом человека как в стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосомных наборов или в случаях с перестройками 13-й и 21-й хромосом, так и в цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 13-й и 21-й хромосом человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосомам 13 и 21 при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.
Формула изобретения: Рекомбинантная плазмидная ДНК альфа R 1 6, предназначенная для маркирования 13-й и 21-й хромосом человека, содержащая: -EcoRI EcoRI - фрагмент ДНК вектора рВР 325 размером 6100 п.о. EcoRI EcoRI фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерных районов 13-й и 21-й хромосом человека, размером 680 п.о. с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции Psti; генетические маркеры: Ampr ген устойчивости к ампициллину.