Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, являющейся действующим веществом препарата "Лидаза" и "Ронидаза", применяемых при лечении рубцов, спаек, контрактур и тугоподвижности сустатов, длительно незаживающих ран. Сущность: поставленная техническая задача решается тем, что очистку и концентрирование проводят с применением ультрафильтрации экстракта через полисульфоновые или фторопластовые мембраны, задерживающие гиалуронидазу и пропускающие балластные вещества с меньшей молекулярной массой. Коэффициент пропускания мембраны не более 10 КД. Технический результат от использования способа состоит в упрощении способа производства гиалуронидазы, так как не применяются пожароопасные органические растворители, а также указанный способ позволяет получить фермент с более высокой удельной активностью 750 У.Е./100 мг, что снижает ущерб, наносимый здоровью людей, занятых в производстве.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2090207
Класс(ы) патента: A61K38/43, A61K35/52
Номер заявки: 93039113/14
Дата подачи заявки: 30.07.1993
Дата публикации: 20.09.1997
Заявитель(и): Сазыкин Иван Сергеевич
Автор(ы): Сазыкин Иван Сергеевич
Патентообладатель(и): Сазыкин Иван Сергеевич
Описание изобретения: Изобретение относится к производству ферментных препаратов, применяемых в медицинской практике, а именно к способу получения гиалуронидазы, являющейся действующим веществом препаратов "Лидаза" и "Ронидаза", используемых при лечении рубцов, спаек, контрактур и тугоподвижности суставов, длительно незаживающих ран.
Известен способ получения ронидазы (авт. св. N1666534 Бюл. N 28 от 30.07.91 МКИ5 С 12 9/26. Авт. Л.И.Стекольников, В.В.Рыльцев, Т.В.Игнатюк и И.М.Кутукова), включающий экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты в атмосфере инертного газа, очистку экстракта сорбцией белой глиной, десорбцию целевого продукта водным раствором уксусной кислоты.
Известен способ получения гиалуронидазы (авт. св. N 955932 Бюл. N 33 от 07.09.82, МКИ5 А 61 К 37/48. Авт. Л.И.Стекольников, Л.В.Алехина, М.И.Бабурина, Г. П. Горошко) из семенников крупного рогатого скота путем экстракции сырья водным раствором уксусной кислоты, экстракцию каждой последующей партии жмыха осуществляют экстрактом, полученным от предыдущего извлечения с добавлением 0,1н. водного раствора уксусной кислоты до насыщения извлечения ферментом, затем полученное извлечение объединяют с экстрактом, полученным после обработки сырья экстрагентом.
Однако известные способы сложны по выполнению, требуют использования дорогостоящих реактивов или органических растворителей, не обеспечивая при этом высокой удельной активности препарата.
Известен способ получения лидазы [1] Бюл. N 17 от 07.05.81 (Авт. И.В. Лазарева, Н.Д.Сидорова, О.В.Чайка, В.А.Иванова, Н.Ф.Говорова, Т.Е.Шестакова и В. Л. Константинов), выбранный нами в качестве прототипа, путем обработки семенников крупного рогатого скота в присутствии уксусной кислоты; при этом экстрагирование проводят 0,1н. водным раствором уксусной кислоты при температуре 5-10oC и после фильтрации осуществляют диализ при температуре 0-10oC в течение 12-16 ч.
Однако известный способ является пожароопасным и вредным производством в связи с использованием ацетана и не обеспечивает высокой удельной активности препарата, содержащего большое количество балластных веществ.
Решаемая техническая задача заключается в упрощении способа производства, в повышении удельной активности препарата и уменьшении содержания в нем балластных веществ.
Указанная техническая задача решена тем, что проводят очистку и концентрирование после фильтрации через сукно с применением ультрафильтрации экстракта через мембрану из полисульфона или фторопласта с пределом пропускания не более 10 килодальтон /КД/.
Технический результат, полученный при реализации предложенного способа, заключается в промышленном получении ферментного препарата из животного сырья гиелуренидазы, являющейся действующим веществом медицинских препаратов "Лидаза" и "Ронидаза". Эти препараты широко применяются в медицинской практике в качестве лекарственных средств при лечении рубцов, контрактур и тугоподвижности суставов, при подготовке к кожепластическим операциям по поводу рубцовых стяжений, при длительно незаживающих ранах.
При этом при производстве способа не используются пожароопасные органические растворители, а очистка и концентрирование препарата тиалуронидазы позволяет получить фермент с более высокой удельной активностью и снизить аллергическую нагрузку на организм пациента.
Проведенный автором поиск по патентным и научно-техническим источникам не выявил аналогов предложенного способа, характеризуемых признаками, идентичными по своим свойствам и полученному результату в своей совокупности признаками предложенного способа, что позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию изобретения "изобретательский уровень", так как для специалиста данный способ в области производства ферментных препаратов явным образом не следует из уровня техники.
Примеры получения и использования гиалуронидазы позволяют считать предложение заявителя соответствующим критерию изобретения "промышленная применимость".
При сравнении предложенного способа с прототипом выявлено, что предложенный способ отличается от известного одновременно проводимой операцией концентрации и очистки препарата ультрафильтрации на мембране с коэффициентом пропускания не более 10 килодальтон, что позволяет получить более чистый и активный препарат, что позволяет считать предложенное техническое решение соответствующим критерию изобретения "новизна".
Суть изобретения заключается в том, что после обработки измельченных семенников 1%-ным водным раствором уксусной кислоты и фильтрования через сукно при незначительно повышенной температуре в течение 4-8 ч, что обеспечивает получение прозрачного фильтра экстракта гиалуронидаз, концентрацию и очистку производят ультрафильтрацией на мембране с коэффициентом пропускания не более 10 КД. Такая операция в получении фермента гиалуронидазы неизвестна. Мембрана с коэффициентом пропускания не более 10 КД, например из полисульфона или фторопласта, задерживает гиалуронидазу и пропускает балластные вещества, например полисахариды, пептиды, с молекулярной массой меньше, чем у гиалуронидазы. В результате этого получается концентрированный чистый продукт, легко подвергающийся лиофилизации, с активностью конечного продукта /1000-750/уд.ед./100 мг. Чистый препарат не вызывает аллергических реакций у пациента, а исключение из производства токсичного и взрывоопасного ацетона позволяет упростить технологию получения и технику безопасности производства гиалуронидазы. Время 4-8 ч первичной фильтрации обусловлено пропусканием экстракта в диапазоне температур 20-40oС через поры сукна.
Пример 1. 100 кг замороженных семенников крупного рогатого скота дважды измельчают на волчке, добавляют 100 литров 1%-ного водного раствора уксусной кислоты (жидкостный коэффициент 1:1) и проводят экстракцию при постоянном перемешивании в течение двух часов, постепенно поднимая температуру до 40oC. Экстракт фильтруют в течение 6-8 ч через мешки из фильтровального сукна и прозрачный фильтрат передают на ультрафильтрацию. Ультрафильтрацию проводят через мембраны с пределом пропускания 10 КД (например, УПМ-10 производства НПО "Владипор"), при этом экстракт концентрируют до объема 15-20 л и затем лиофилизируют. Выход порошка гиалуронидазы 920 г (0,92% от исходной массы сырья), а его удельная активность 1020 уд.ед./100 мг.
Пример 2. 100 кг замороженных семенников баранов дважды измельчают на волчке, добавляют 100 л (жидкостный коэффициент 1:1) 1%-ного водного раствора уксусной кислоты и проводят экстракцию при постоянном перемешивании в течение 4-6 ч при температуре 20oC. Экстракт фильтруют на фильтрационной установке "Орион" /США/. Прозрачный фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембраны типа УПМ-10 и концентрируют до объема 17-20 литров. Затем проводят сублимационную сушку. Выход порошка гиалуронидазы 1200 г (1,2% от исходной массы сырья), а его удельная активность 750 уд.ед./100 мг.
Формула изобретения: Способ получения гиалуронидазы, включающий экстракцию измельченных семенников водным раствором уксусной кислоты, фильтрацию экстракта с последующим концентрированием и очисткой целевого продукта и его сублимационной сушкой, отличающийся тем, что фильтрацию экстракта осуществляют в течение 4-8 ч через сукно и путем ультрафильтрации через полисульфоновые или фторопластовые мембраны с пределом пропускания не более 10 килодальтон.