Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В*002 - Патент РФ 2090877
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В*002
ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В*002

ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В*002

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольт-амперометрическому способу определения водорастворимого витамина B2, участвующего в окислительно-восстановительных реакциях в живом организме. Поставленная задача достигается тем, что витамин B2 электрохимически концентрируется на поверхности графитового электрода с последующей регистрацией анодных вольт-амперных кривых, а также тем, что витамин B2 концентрируют на стеклоуглеродном (или пирографитовом) электроде в течение 60-120 сек при потенциалах электролиза (-0,5)-(-0,6) B на фонах 0,05 М калия фталевокислого кислого или в растворе 0,2 М KCl в присутствии соляной или серной кислоты, или HClO4 pH 2-4 с последующей регистрацией анодных пиков в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10-20 мВ/сек, а концентрацию витамина B2 определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов от -0,18 до -0,30 B относительно хлорсеребряного электрода. 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2090877
Класс(ы) патента: G01N27/26
Номер заявки: 95113363/25
Дата подачи заявки: 27.07.1995
Дата публикации: 20.09.1997
Заявитель(и): Томский политехнический университет
Автор(ы): Анисимова Л.С.; Слипченко В.Ф.
Патентообладатель(и): Томский политехнический университет
Описание изобретения: Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольт-амперометрическому способу определения водорастворимого витамина B2 (рибофлавин, 6,7-диметил-9-/D-1-рибитил/-изоаллоксазин), участвующего в окислительно-восстановительных реакциях в живом организме, выполняя функции переносчика водорода в процессах углеводного, белкового и жирового обмена, в синтезе гемоглобина и поддержаний зрительной функции глаза. Показаниями к применению витамина B2 являются нарушения функции кишечника, спру, болезни Боткина и другие заболевания.
Определение микроколичеств рибофлавина очень важно для оценки качества пищевых продуктов и идентификации действующих веществ в лекарственных формах витаминов группы B. С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство поливитаминных (ПВ) препаратов и продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов в различных объектах.
Для анализа витамина B2 в настоящее время применяют различные методы [1] Одними из старых являются химические методы, основанные на цветных реакциях, характерных для специфических группировок, входящих в витамин [2] Нередко для количественного определения водорастворимых витаминов использовали титриметрические методы в водных или неводных растворителях (диоксане, ацетоуксусном эфире) [3] Чувствительность таких методов невелика - 10-1-10-2 мг/мл и зачастую они используются для качественного обнаружения витаминов в различных веществах и биологических жидкостях.
Используемые в современных лабораториях методики количественного определения витамина B2 в продуктах питания и ПВ-препаратах, рекомедуемые в настоящее время нормативно-техническими документами, включают множество вариантов оптических методов. Для определения витамина B2 используют, как правило, флюорометрический метод [4, 5] в двух вариантах. Один из них вариант прямой флюориметрии основан на определении интенсивности флюоресценции до и после восстановления рибофлавина гидросульфатом натрия. Второй вариант люмифлавиновый, основанный на использовании свойства витамина B2 при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом [4, 5] Чувствительность определения (0,8-2,0)·10-4 мг/мл. Анализ затрудняется наличием в ряде объектов веществ, обладающих флюоресценцией. Маскируя флюоресценцию витамина, эти вещества искажают результаты анализа и делают невозможным проведение определения без специальных обработок проб. Удаляют мешающие соединения, пропуская анализируемый раствор через колонки с ионнообменными смолами [4] В пищевых продуктах витамин B2 может находиться в свободном состоянии и в виде фосфорных эфиров, связанных с белками, и поэтому не может быть определен этими методами без предварительного длительного (более 16 часов) расщепления с использованием дорогостоящих ферментов. При определении ПВ-препаратов эти методы также недостаточно селективны, трудоемки, требуют больших затрат времени, реактивов, что связано также с предварительным выделением компонентов.
Возможность полярографического определения витамина B2 на уровне 0,04 мг/мл в присутствии витамина C и фолиевой кислоты показана в работе [6] В качестве фона использовали бурафосфатный буфер pH 6,8. Индикаторным электродом служил ртутно-капающий электрод (р. к.э.). Наиболее близким является метод переменно-токовой вольт-амперометрии с фазочувствительным детектором с использованием стационарного ртутного электрода (с.р.э.) [7] (прототип). Для определения витамина B2 этим методом в чистых растворах использовали пики восстановления адсорбированных форм витамина в аммиачном буферном растворе pH 9-12 (E1/2=-0,55 B) и 1 M HCl pH 6,20 (E1/2=-1,3 B) относительно насыщенного каломельного электрода (нас. к.э.) при скорости развертки потенциала 50 Мв/сек. Предел обнаружения витамина B2 7·10-8 мг/мл.
В данных условиях определение витамина B2 на уровне 1·10-8 мг/мл невозможно. Поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методов определения витамина B2 продолжает представлять интерес.
Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности определения витамина B2, экспрессности и селективности методом дифференциальной инверсионной вольт-амперометрии (ДИВ).
Поставленная задача достигается тем, что витамин B2 электрохимически концентрируется на стеклоуглеродном (СУ) или пирографитовом (ПГ) электроде с последующей регистрацией анодных пиков. Новым в способе является то, что электрохимическое концентрирование витамина B2 ведут на стеклоуглеродном или пириграфитовом электроде при потенциалах (-0,5)-(-0,6) B в течение 60-120 сек в растворе калия фталевокислого кислого концентрацией 0,05 М или в растворе хлорида калия концентрацией 0,2 М в присутствии соляной кислоты или серной кислоты, или хлорной кислоты с pH 2-4, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10-20 мВ/сек и концентрацию витамина B2 определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов (-0,18)-(-0,30) B относительно хлорсеребряного электрода.
В прототипе описано использование в качестве фонов аммиачного буфера pH 9-11,75 и 1 M KCl pH 6,20. Определение витамина B2 в этих условиях затрудено из-за плохой воспроизводимости и искажения формы аналитического сигнала, связанных с регистрацией дополнительного пика при потенциале -(0,35-0,45) B, что делает невозможным проведение анализа на этих фонах. Предлагаемые в заявляемом изобретении фоны 0,05 M C8H5O4K, смесь 0,2 M KCl с кислотами HCl или H2SO4, или HClO4 (pH 2-4) позволяет определять витамин B2 на уровне 10-8 мг/мл с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (Sr) не превышает 0,05. Фоны 0,05 M C8H5O4K; 0,2 M KCl в смеси с кислотами HCl или H2SO4, или HCIO4 до pH 2-4 подобраны экспериментально. Абсолютной новизной являются экспериментально подобранный фон 0,05 M C8H5O4K, установленный pH раствора и использование смесей 0,2 M KCl с кислотами, от чего зависит количественное определение витамина. Использование смесей KCl и кислот способствует хорошей растворимости определяемого вещества, приводит к стабилизации и денатурации следов белковых примесей, остаточное содержание которых возможно в анализируемых пробах пищевых продуктов и ПВ-препаратов и позволяет анализировать растворы на уровне нанограммовых количеств определяемого вещества. Оптимальный диапазон pH для всех фонов 2-4 определяется хорошей воспроизводимостью и фиксированием одного пика окисления витамина B2. Более низкие значения pH (pH<2) и более высокие (pH>4) нежелательным, т.к. возможна регистрация плохо воспроизводимого аналитического сигнала, что снижает точность, чувствительность и экспрессность определения. Количественное определение витамина B2 впервые стало возможным на указанных фонах на уровне 10-8 мг/мл методом дифференциальной инверсионной вольт-амперометрии и характерно только для витамина B2 (табл. 1). Зависимость аналитического сигнала от концентрации витамина B2 в таких растворах прямо пропорциональна диапазону определяемых содержаний от 10-8 до 10-4 мг/мл.
Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления: Eэ=-(0,5-0,6) B. При потенциалах -0,5<E<-0,6 B уменьшилась величина тока окисления органического вещества, кроме того, при Eэ<-0,6 B возникал большой остаточный ток, связанный с выделением водорода в кислых растворах. Из табл. 2 видно, что областью оптимальных потенциалов накопления является потенциал -(0,5-0,6) B. Только при этих условиях возможно количественное определение витамина B2 на уровне 10-8-10-7 мг/мл с регистрацией вольт-амперограмм с четко выраженным максимумом. Без предварительного электролиза невозможно количественное определение витамина на уровне нанограммовых содержаний. Электрохимическое концентрирование повышает чувствительность и разрешающую способность способа и позволяет экспрессно проводить анализ витамина B2 содержанием менее 1·10-7 мг/мл в мутных и окрашенных средах без предварительного отделения пищевых пигментов, сопутствующих компонентов в ПВ-препаратах.
В качестве индикаторных применяли три типа углеродных электродов - графитовый (Г), пропитанный полиэтиленом с парафином в вакууме или эпоксидной смолой, пирографитовый (ПГ) и стеклоуглеродный (СУ) (в прототипе применяли стационарный ртутный и ртутно-капающий электроды). Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности. Величина потенциала окисления витамина B2 (в прототипе использованы волны и пики восстановления) определяется строением, структурой и степенью адсорбируемости на гексагонах графита, имеющих π-зонную структуру. По легкости окисления витамина электроды можно расположить в ряд:
Г (0,28-0,37) B
СУ (0,20-0,27) B
ПГ (0,18-0,25) B
Структурное подобие материала электрода и адсорбция плоскостью молекулы (стереоспецифическая адсорбция), по-видимому, благоприятствует переходу электронов при меньшем значении потенциала и способствует более обратимому окислению витамина B2 на графите, чем на СУ и ПГ. Максимальное значение регистрируемого тока с использованием графитового электрода несколько выше (≈ на 20-30% ), однако из-за большого остаточного тока он оказался менее удобным в работе, чем СУ и ПГ, особенно при количественном определении витамина в пищевых продуктах и биосистемах (плазма крови). Для определения витамина B2 впервые использовали "игольчатые" по форме графитовые индикаторные электроды. При использовании таких электродов диффузия деполяризатора протекает по-разному к цилиндрической и сферической частям его поверхности. Поэтому в выражение для тока добавляется дополнительное стационарное слагаемое [8]
.
В связи с этим использование "игольчатых" электродов в аналитической практике позволяет увеличить чувствительность способа определения витамина B2. Ртутно-пленочные "игольчатые" электроды использовались ранее для определения металлов и некоторых органических веществ. Графитовые (СУ, ПГ) "игольчатые" электроды впервые использованы для определения водорастворимого витамина B2.
Важным для определения витамина B2 методом ДИВ является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 10-20 мВ/сек. Увеличение скорости более 20 мВ/сек при линейно меняющемся потенциале увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность способа. Использование скорости 50 мВ/сек, указанной в прототипе, ухудшает воспроизводимость, искажает форму поляризационных кривых, что усложняет обработку результатов анализа. При скорости менее 10 мВ/сек снижается величина анодного тока и понижается чувствительность определения витамина.
Время предварительного электролиза выбирают в зависимости от концентрации определяемого вещества. Максимальное значение величины тока окисления достигается при τэ равном 60-120 сек.
При τэ< 60 сек снижается чувствительность определения, а при τэ> 120 сек снижается экспрессность и увеличивается ошибка определения при анализе поли- и мультивитаминных препаратов (Sr≥0,1).
Использование дифференциального режима записи вольт-амперограмм позволяет фиксировать четкие узкие пики, что повышает разрешающую способность способа и облегчает автоматизацию электродного процесса. Для определения витамина B2 он ранее не применялся.
Установленные условия впервые позволили количественно определять витамин B2 на уровне 1·10-8 мг/мл в присутствии пигментов в мутных и окрашенных средах без предварительного отделения других водорастворимых витаминов группы B, PP, аскорбиновой, фолиевой, никотиновой, мочевой кислот, триптофана (и некоторых его матаболитов), мочевины, ряда фенольных и оксисоединений, ионов PO43-, Cl-, F-, Br-, Zn2+, Cu2+, Cd2+, Fe2+, Fe3+ и др.
Пример 1. Определение витамина B2 на уровне 10-8-10-7 мг/мл.
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,05 М калия фталевокислого кислого. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 3 минут, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: Eэ=-0,6 B; τэ 120 сек. Отключают газ и фиксируют анодную дифференциальную вольт-амперограмму при скорости развертки потенциала 15 мВ/сек, начиная с потенциала Eнач=-0,5 B. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют несколько капель объемом 0,01 мл стандартного раствора витамина (1-2)·10-5-10-4 мг/мл, перемешивают раствор 10 сек, проводят электрохимическое концентрирование осадка при Eэ=-0,6 B и τэ= 120 сек. Съемку вольт-амперной кривой начинают с потенциала -0,5 B. Пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от -0,28 до -0,03 B при чувствительности прибора (0,5-1)·10-9 A/мм. Время единичного анализа не превышает 10 минут.
Пример 2. Определение витамина B2 в поли- и мультивитаминных препаратах.
В кварцевый полярографически чистый стаканчик емкостью 15 мл наливают 0,1-0,2 мл раствора ПВ-препарата, предварительно растворенного при нагревании в соляной или серной кислоте pH 3-4, доводят раствором фона 0,2 M KCl до метки 10 мл и помещают в электролизер. В течение 3 минут удаляют из раствора кислород газообразным азотом с содержанием кислорода менее 0,001% Снимают дифференциальную вольт-амперограмму при условии Eэ=-0,5 B, τэ60 сек и линейной развертке потенциала 15 мВ/сек в анодную область, начиная с потенциала -0,5 B. Затем в стаканчик добавляют n капель объемом 0,04 мл 2·10-2 мг/мл витамина B2. Перемешивают раствор 10 сек, проводят электрохимическое концентрирование при Eэ=-0,5 B и τэ60 сек. Съемку вольт-амперограммы начинают с потенциала -(0,45-0,5) B. Пик для указанной концентрации регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,22-0,28) B при скорости 15 мВ/сек, чувствительности прибора (1-4)·10-9 A/мм. Время анализа одной пробы примерно 10 минут.
Пример 3. Определение витамина B2 в водных вытяжках сапропелий.
Аликвоту водной вытяжки (в которую предварительно добавляют KCl до концентрации 0,2 M и HClO4 до pH 4) объемом 1 мл вносят в кварцевый полярографически чистый стаканчик, который помещают в электролизер. В течение 5 минут удаляют из раствора кислород газообразным азотом с содержанием кислорода менее 0,001% Снимают дифференциальную вольт-амперограмму при условии Eэ=-0,5 B и τэ10 сек и линейной развертке потенциала 20 мВ/сек в анодную область, начиная с потенциала -0,45. Затем в стаканчик добавляют 1-2 капли объемом 0,01 мл 1·10-2 мг/мл витамина. Перемешивают раствор 5 сек и проводят электрохимическое концентрирование при Eэ=-0,5 B и τэ100 сек и вновь снимают вольт-амперограмму в тех же условиях. Пик для указанной концентрации регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,28-0,30) B при чувствительности прибора (1-2)·10-9 A/мл. Время анализа одной пробы менее 10 минут.
Правильность методик с использованием предлагаемого способа определения витамина B2 проверена несколькими способами контроля и доказана методами аттестованных растворов и "введено-найдено" и сравнением результатов с флюориметрическим способом определения витамина B2.
Таким образом, ДИВ-способ позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа витамина B2. Предел обнаружения 1·10-8 мг/мл. По сравнению с прототипом чувствительность определения повышается примерно на порядок. По сравнению с методами, рекомендованными нормативными документами [4] время анализа витаминов B2 с учетом пробоподготовки в пищевых продуктах и ПВ-препаратах может быть сокращено более чем в 100 раз.
Предложенный способ прост, экспрессен, не требует применения дефицитных ферментов и большого количества реактивов (по сравнению с методами ГОСТ 25999-85), может быть применен не только для контроля качества сырья пищевых продуктов и фармакопейных препаратов, но и для анализа витаминов в биологических жидкостях (крови, плазме, лимфе) и объектах окружающей среды (в водных вытяжках сапропелий, илов). ДИВ-способ может быть использован для создания диагностической системы витаминного метаболизма человека и животных.
Литература.
1. Ульянова С.В. Шавлинский А.М. Морев С.Н. Дмитриенко Т.С. Финкельштейн Е. И. Кирсанов А.Г. Использование физико-химических методов в анализе поливитаминных препаратов, содержащих водорастворимые витамины B1, B2, B6, C и никотинамид//Фармация. 1993. т. 42, N 3. С. 60-62.
2. Кушманова О. Д. Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М. Медицина, 1983, 272 с.
3. Денеш И. Титрование в неводных средах. М. Мир, 1991, 413 с.
4. ГОСТ 25999-83. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B1 и B2. М. Госкомитет по стандартам, 1984, 11 с.
5. Химический состав пищевых продуктов. М. Легкая промышленность, 1984, 320 с.
6. Крузе И.В. Полярографическое определение аскорбиновой, фолиевой кислот и рибофлавина//Фармация. 1969. N 4. С. 59-62.
7. Григорьев В. И. Миляев Ю.Ф. Белятинская Л.И. Адсорбционное концентрирование и определение количеств рибофлавина методом переменно-токовой вольт-амперометрии//Журн. аналит. химии. 1985. Т. 40, N 4. С. 736-739.
8. Назаров Б.Ф. Теоретические основы амальгамной полярографии с накоплением. Томск. ТПИ, 1976, 50 с.
Формула изобретения: Инверсионно-вольтамперометрический способ определения витамина В2, включающий электрохимическое концентрирование вещества на поверхности электрода с последующей регистрацией анодных пиков, отличающийся тем, что электрохимическое концентрирование витамина В2 ведут на стеклоуглеродном или пирографитовом электроде при потенциалах -0,5 -0,6 В в течение 60 120 с в растворе калия фталевокислого кислого концентрацией 0,05 М или в растворе хлорида калия концентрацией 0,2 М в присутствии соляной кислоты, или серной кислоты, или хлорной кислоты с рН 2 4, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10 20 мВ/с и концентрацию витамина В2 определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов -0,18 -0,30 В относительно хлорсеребряного электрода.