√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
–≈ ќћЅ»Ќј“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  – 280 GM,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј. Ў“јћћ ESCHERICHIA COLI SG20050/– 280 GM - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј
–≈ ќћЅ»Ќј“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  – 280 GM,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј. Ў“јћћ ESCHERICHIA COLI SG20050/– 280 GM - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј

–≈ ќћЅ»Ќј“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  – 280 GM,  ќƒ»–”ёўјя ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј. Ў“јћћ ESCHERICHIA COLI SG20050/– 280 GM - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј —ќ —¬ќ…—“¬јћ» √–јЌ”Ћќ÷»“ј–Ќќ-ћј –ќ‘ј√јЋ№Ќќ√ќ  ќЋќЌ»≈—“»ћ”Ћ»–”ёў≈√ќ ‘ј “ќ–ј „≈Ћќ¬≈ ј

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: биотехнологи€, в частности генетическа€ инженери€. —ущность изобретени€: предложена нова€ рекомбинантна€ плазмида p280 GM, содержаща€ синтетический ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (√ћ- —‘), детерминирующий конститутивный синтез полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека, и штамм E.coli SG 20050/p280GM, обеспечивающий уровень экспрессии √ћ- —‘ около 15% от суммарного клеточного белка при плотности 109 клеток/мл, что составл€ет около 20-30 мг в одном литре такой клеточной суспензии. 2 с.п. ф-лы, 3 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2091488
 ласс(ы) патента: C12N1/21, C12N15/27, C12N15/70
Ќомер за€вки: 94009371/13
ƒата подачи за€вки: 16.03.1994
ƒата публикации: 27.09.1997
«а€витель(и): Ќаучно-производственное объединение "¬ектор"
јвтор(ы): √илева ».ѕ.; Ѕондарь “.—.;  оробко ¬.√.;  равченко ¬.¬.; —андахчиев Ћ.—.
ѕатентообладатель(и): Ќаучно-производственное объединение "¬ектор"
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представл€ет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ƒЌ , содержащую синтетический ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (√ћ- —‘), тандем промоторов (ptrpx2) триптофанового оперона E.coli и синтетические участки инициации трансл€ции, обуславливающие эффективный биосинтез полипептида с биологической активностью √ћ- —‘, а также штамм Escherichia coli продуцент этого полипептида.
√ћ- —‘ глипопротеин, зрела€ форма которого образуетс€ путем отщеплени€ от белка предшественника (144 а.о.) сигнального пептида (17 а.о.) и последующего гликозилировани€. ≈го источниками €вл€ютс€ “-лимфоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. √ћ- —‘ стимулирует in vitro пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток с образованием колоний нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов и макрофагов. ќн также вовлечен во многие другие биологические и иммунологические функции организма, такие как изменение морфологии эффекторных клеток, их подвижности, цитотоксической активности и фагоцитоза [1]
—пособность √ћ- —‘ стимулировать рост гранулоцитов и макрофагов делает возможным его клиническое использование дл€ снижени€ побочных эффектов луче- и химеотерапии, в терапии побочных эффектов при трансплантации костного мозга.
»звестны способы получени€ √ћ- —‘ человека, основанные на использовании экстрактов плаценты либо культуральной жидкости клеточных линий - суперпродуцентов √ћ- —‘ [2, 3] а также экспрессии гена √ћ- —‘ в COS-клетках [4] Ќедостатком этих подходов €вл€етс€ чрезвычайно низкий выход целевого продукта и, как следствие, высока€ стоимость препаратов √ћ- —‘. ѕоэтому значительно более перспективным €вл€етс€ способ получени€ √ћ- —‘ микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получени€ целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырь€. »спользование при этом химического подхода позвол€ет создать оптимальные дл€ бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регул€торных элементов, контролирующих его экспрессию.
»звестна рекомбинантна€ плазмида pGMtrp [5] содержаща€ синтетический ген, кодирующий полипептид со свойствами √ћ- —‘ человека и экспрессирующийс€ под контролем промотора триптофанового оперона E. coli.  летки E.coli SG20050, содержащие эту плазмиду обеспечивают уровень синтеза целевого продукта, не превышающий 5-7% от суммарного белка клетки, что недостаточно дл€ получени€ промышленного штамма-продуцента.
»звестна рекомбинантна€ плазмида, в которой к-ƒЌ -копи€ гена √ћ- —‘ находитс€ под контролем индуцируемого температурой промотора фага λ [6] ”ровень экспрессии √ћ- —‘ достигает 7-10% от суммарного белка клетки, а присутствие дополнительного аминокислотного остатка метионина на 5'-конце рекомбинантного полипептида не вли€ет на его биологические свойства. ѕо принципу конструировани€, технической сущности и достигаемому результату данна€ плазмида €вл€етс€ наиболее близкой к за€вл€емой и выбрана в качестве прототипа. —ущественным недостатком прототипа €вл€етс€ использование индуцибельного промотора, что снижает технологичность процесса получени€ рекомбинантного продукта.
«адачей разработки €вл€етс€ получение высокого конститутивного биосинтеза рекомбинантного √ћ- —‘ человека в компетентных клетках E.coli.
ѕоставленна€ задача была решена путем конструировани€ новой рекомбинантной плазмиды p280GM, кодирующей конститутивный синтез √ћ- —‘, и штамма E. coli SG20050/p280GM, обеспечивающего уровень экспрессии √ћ- —‘ около 15% от суммарного клеточного белка.
–екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  p280GM характеризуетс€ следующими признаками:
кодирует аминокислотную последовательность зрелого √ћ- —‘ человека;
имеет молекул€рную массу 2,7 ћд (3966 т.п.о.);
состоит из:
PstI/BamHI фрагмента ƒЌ  плазмиды pDS280 (1083 п.о.), который содержит часть гена b-лактамазы и тандем промоторов триптофанового оперона E.coli;
NcoI/PstI фрагмента плазмиды pGMtrp, содержащий часть синтетического гена √ћ- —‘, кодирующую полипептид (13-127) зрелого √ћ- —‘ человека (2834 т.п. о.), часть гена b-лактамазы и терминатор транскрипции фага l;
синтетического дезоксиолигонулеотидного дуплекса, 5'-GATCAATTCTATGGCACCAGCACGATCTCCCTCTCCTTCTACTCAAC- 3' 3'- TTAAGATACCGTGGTCGTGCTAGAGGGAGAGGAAGATGAGTTGGTAC- 5', который содержит ATG-кодон и кодирует полипептид (1-12) зрелого √ћ- —‘ человека.
содержит:
синтетический ген √ћ- —‘ человека;
в качестве генетического маркера ген b-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p280GM клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавани€ рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих рассто€ни€х вправо от сайта EcoRI (279 п.о.)- BamHI 454 нуклеотида; PstI 2938 нуклеотидов.
—ущественным отличием предложенной плазмидной конструкции €вл€етс€ то, что с помощью дезоксиолигонуклеотидного адаптора замен€ютс€ 12 5'-концевых триплетов гена √ћ- —‘. Ёта замена не нарушает кодируемую им аминокислотную последовательность, но оптимизирует вторичную структуру м–Ќ , что приводит к существенному увеличению уровн€ синтеза целевого продукта.
ƒл€ получени€ бактериального штамма-продуцента полипептида с биологической активностью √ћ- —‘ человека компетентные клетки E.coli SG20050 трансформируют сконструируемой плазмидой p280GM.
ѕолученный таким образом штамм E.coli SG20050/p280GM характеризуетс€ следующими признаками:
ћорфологические признаки.  летки мелкие? утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
 ультуральные признаки.  летки хорошо растут на простых питательных средах. ѕри росте на агаре "ƒифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блест€щие серые, край ровный. ѕри росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
‘изико-биологические признаки.  летки растут при температуре от 4 до 40oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,0. ¬ качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединени€ в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. ¬ качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
”стойчивость к антибиотикам.  летки про€вл€ют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 50 мкг/мл), благодар€ наличию транспозона.
—ущественными отличи€ми штамма E.coli SG20050/280GM €вл€етс€ то, что он обусловливает конститутивный синтез полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека с уровнем экспрессии около 15% суммарного клеточного белка, что более чем в 2 раза превосходит прототип.
ѕолученный штамм депонирован во ¬сесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов во ¬Ќ»» генетики под номером ¬ ѕћ B-6613.
Ќа фиг. 1 показаны схема получени€ и физическа€ карта рекомбинантной плазмиды P280GM.1 -выделение фрагментов и лигирование ƒЌ  лигазой фага T4 в присутствии дезоксиолигонуклеотидного дуплекса. 2 трансформаци€ компетентных клеток E. coli; на фиг. 2 первична€ структура EcoRI BamHI фрагмента днк p280GM, содержащего синтетический ген √ћ- —‘, и кодируема€ им аминокислотна€ последовательность. ѕодчеркнуты прерывистой чертой снизу нуклеотидные замены в структурной части гена √ћ- —‘, отличающие его от природного аналога [4] чертой снизу терминирующие кодоны; чертой сверху последовательность SD; на фиг. 3 электрофореграмма лизатов клеток E.coli SG20050/pGMtrp (дорожка 1), E.coli SG20050/p280GM (дорожка 2), E.coli SG20050 (дорожка 3) в 12% ѕјј√.
ѕример 1. ’имический синтез олигонуклеотидов.
—интез олигонуклеотидов выполн€ют твердофазным фосфорамидитным методом на ƒЌ -синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5-диметокситритил-N-ацил-2-дезоксинуклеозид-3-ќ-(метоксидиизопропиламино)-фосактивированных тетразолом. —интез провод€т в масштабе 0,5-0,7 мкмоль. »спользуют синтетический цикл, описанный в работе [8] ѕосле окончани€ синтеза защитные группы удал€ли последовательной обработкой тиофенол€том триэтиламмони€ и концентрированным аммиаком. ѕри этом происходит отделение олигонуклеотида от носител€. 5'-ƒиметокситритильную группу удал€ют кислотной обработкой и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20% ѕјј√, содержащем 7ћ мочевину. ¬ыход 1-5 о.е.
ѕример 2.  онструирование рекомбинантной плазмидной ƒЌ  p280GM.
 летки бактерий E.coli G600, содержащие плазмидную ƒЌ  pDS280 [7] выращивают при 37oC в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. «атем плазмидную ƒЌ  выдел€ют в соответствии с процедурой, описанной в работе [9]
јналогичным образом выдел€ют ƒЌ  плазмиды pGMtrp, содержащей синтетический ген √ћ- —‘ [5] ѕолученные препараты плазмидных ƒЌ  используют дл€ конструировани€ плазмиды p280GM. — этой целью по 10 мкг плазмидных ƒЌ  pDS280 и pGMtrp инкубируют смесью эндонуклеаз рестрикции BamHI и PstI, и NcoI и PstI (10 ед каждой), соответственно, в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мм “рис-HCl, pH 7,5, 50 мћ NaCl,10 мћ MgCl2, 7 мћ меркаптоэтанол, в течение 1 ч при 37oC. ѕосле инкубации реакции останавливают двукратной экстракцией смесью фенолфлороформа (1:1) и ƒЌ  осаждают 70% этанолом. јнализ полноты гидролиза и выделение BamHI/PstI-фрагмента плазмидой ƒЌ  pDS280 (1028 п.о.) (фрагмент 1) и NcoI/PstI-фрагмента плазмидой ƒЌ  pGMtrp (2834 п.о.) (фрагмента 2) провод€т при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. ƒалее фрагмент 1 (1 мкг) соедин€ют в присутствии дуплекса: 5'-GATCAATTCTATGGCACCAGCACGATCTCCCTCTCCTTCTACTCAAC- 3' 3'- TTAAGATACCGTGGTCGTGCTAGAGGGAGAGGAAGATGAGTTGGTAC- 5', с фрагментом 2 (0,4 мкг) с помощью 30 ед. T4 ƒЌ  лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15oC и реакционную смесь используют дл€ трансформации компетентных клеток E. coli C600. “рансформанты высевают на агаризованную среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и полученные таким образом отдельные колонии выращивают при 37oC в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. «атем плазмидную ƒЌ  выдел€ют в соответствии с процедурой, описанной в работе [9] и анализируют с помощью эндонуклеазы рестрикции HaeIII. »з клонов, содержащий встроенный фрагмент, выдел€ют плазмидную ƒЌ , строение которой подтверждают пр€мым определением нуклеотидной последовательности ƒЌ  в районе встройки с помощью модифицированного метода ћаксама-√илберта [10]
ѕример 3. ѕолучение штамма-продуцента полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека.
ѕлазмидой p280GM трансформируют компетентные клетки E.coli SG20050 и получают штамм-продуцент полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека.
ѕример 4. ¬естернблот-анализ.
 летки E. coli SG20050 и E.coli SG20050/p280GM выращивают при 37oC в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращени€ 120 об/мин, отбирают пробу объемом 2 мл и клетки центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин.  летки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мћ “рис-NCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% SDS, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, нагревают 10 мин на кип€щей вод€ной бане и охлаждают во льду. 10 мкл образцов подвергают электрофорезу в 12,5% SDS-ѕјј√. ѕо окончании электрофореза белки перенос€т на нитроцеллюлозные фильтры (Schleicher @ Schuel HAWP 293 23 HA 0,45 m) с помощью прибора дл€ электро-блот-анализа. ѕосле окончани€ переноса фильтр инкубируют в течение ночи в буфере PBS (10 мћ калийфосфатный буфер, pH 7,2 150 мћ NaCl), содержащем 3% (весова€ концентраци€) Ѕ—ј при 4oC. ѕосле инкубации в растворе Ѕ—ј, фильтры инкубируют в течение 2-3 ч со специфическими антителами, разведенными PBS до концентрации 5 мкг/мл. ѕосле инкубации фильтры тщательно промываютс€ в PBS, содержащем 0,1% твин-20, и добавл€ют коньюгат пероксидазы хрена с антителами второго пор€дка (производство ¬≈ “ќ–-Ѕ»ќѕ–ќƒ” “,  ольцово Ќовосибирской области), инкубируют не менее 1 ч. при комнатной температуре. ƒл€ окраски фильтра 50 мг 4-хлор-1-нафтол, растворенного в 1 мл этанола, развод€т 1:100 PBS и добавл€ют 30%-ный пероксид водорода до концентрации 0,006% ѕосле по€влени€ окрашивани€ фильтр промывают PBS, высушивают и хран€т в темноте. ѕо данным вестерн-блот-анализа единственный полипептид, реагирующий с антителами к человеческому √ћ- —‘ (SIGMA, —Ўј), это полипептид с молекул€рной массой около 16 кƒ, детерминируемый плазмидой p280GM.
ѕример 5. ќпределение биологической активности.
 летки E.coli SG20050/p280GM выращивают как в примере 4.  летки суспендируют в 20 мл буфера, содержащего 10%-ную сахарозу; 0,1 ћ трис-HCl, pH 7,5; 5 мћ Na2EDTA, и разрушают ультразвуком на установке Soniprep 150 (MSE). ѕолученный лизат стерилизуют ультрафильтрацией через фильтры 0,45 mm CA/CN (SIGMA, —Ўј) и активность √ћ- —‘ определ€ют, использу€ метод клонировани€ гемопоетических предшественников в полутвердых агаровых культурах [6] ћононуклеары получают из крови гематологически здоровых доноров разделением в градиенте плотности фикол- верографина (SIGMA, —Ўј).  летки в концентрации 5·105 лунка культивируют в среде ћак- о€ 5A (Ќѕќ "¬≈ “ќ–", –осси€) в планшетах дл€ культур тканей (SIGMA, —Ўј; 24 wells/plate) с добавлением стерильных лизатов клеток E. coli SG20050 и E.coli SG20050/p280GM. ѕодсчет количества колоний провод€т на 7-е сутки.
ѕо данным определени€ биологической активности лизат клеток E.coli SG20050/p280GM стимулирует образование колоний клеток- предшественников макрофагов и гранулоцитов; спонтанного колониеобразовани€ (при добавлении лизатов клеток E.coli SG20050) не происходит.
ѕример 6. ќпределение продуктивности штамма E.coli продуцента полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека.
 летки E.coli SG20050/p280GM выращивают как в примере 4. —одержание рекомбинантного √ћ- —‘ определ€ют по отношению к суммарному клеточному белку.
 летки суспендируют 200 мкл буфера, содержащего 125 мћ “рис-HCl, pH 6,8; 20% глицерин; 3% SDS; 3% меркаптоэтанол; 0,005% бромфеноловый синий, нагревают 10 мин на кип€щей вод€ной бане и охлаждают во льду. ќбразцы 2, 5 и 10 мкл подвергают электрофорезу в 12% SDS-ѕјј√. ѕо окончании электрофореза гель промывают 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и прокрашивают при помощи кумасси R-250. ѕосле отмывки избытка красител€ гель сканируют при 550 нм, использу€ лазерный сканиметр UltroScan XL (LKB, Ўвеци€).
ѕо данным сканировани€ рекомбинантный √ћ- —‘ составл€ет 15-20% всего белка E.coli.
ѕример 7. ¬ыделение и характеризаци€ белка, синтезирующегос€ в клетках штамма E.coli продуцента полипептида со свойствами √ћ- —‘ человека.
 летки E.coli SG20050/p280GM выращивают при 37oC в 500 мл (10 колб по 50 мл) LB-бульона как указано выше в примере 4, биомассу собирают центрифугированием 15 мин при 6000 об/мин, клеточный осадок промывают 200 мл буфера, содержащем 10% -ную сахарозу; 0,1 M трис-HCl, pH 7,5; 5 mM Na2EDTA и 0,5 mM DTT, ресуспендируют в 20 мл этого же буфера и разрушают ультразвуком с помощью ультразвуковой установки Soniprep 150 (MSE). ѕолученный лизат осветл€ют центрифугированием 30 мин при 10000 об/мин, осадок дважды промывают 30 мл раствора 2 M мочевины в буфере PBS, содержащего 150 mM NaCl, 20 mM калий фосфат, pH 7,5, 5 mM Na2EDTA, раствор€ют в 10 мл раствора 4 M мочевины в буфере PBS. Ќерастворившиес€ частицы удал€ют центрифугированием 30 мин при 20000 об/мин. ѕо данным электрофореза в 12% ѕјј√ чистота препарата √ћ- —‘ составл€ет 60%
–аствор √ћ- —‘ хроматографируют на колонке с широкопористым обращенно-фазовым носителем ѕолисил ќƒ—-300 [11] в градиенте смеси ацетонитрила, изопропанола и воды (3:1:1) со скоростью 1 мл/мин с детекцией профил€ элюции при 220 нм. Ѕелковый пик, содержащий по данным электрофореза гомогенный √ћ- —‘, собирают и используют дл€ анализа аминокислотного состава, N-концевого анализа по способу, описанному в работе [11] ѕрепарат √ћ- —‘ хран€т при -70oC. ƒанный способ выделени€ позвол€ет получить из 0,5 л культуры клеток E.coli SG20050/p280GM при плотности 109 клеток мл 20-30 мг рекомбинантного √ћ- —‘ человека.
ѕолученные данные о строении продукта экспрессии искусственного гена √ћ- —‘ в клетках штамма E.coli SG20050/p280GM свидетельствуют о соответствии исследуемого полипептида его природному аналогу √ћ- —‘ человека.
“аким образом, за€вл€емое техническое решение позвол€ет получать полипептид со структурой белка идентичной структуре и свойствам природного √ћ- —‘ человека; уровень биосинтеза √ћ- —‘ составл€ет около 15% суммарного клеточного белка E.coli за счет усовершенствовани€ вторичной структуры полицистронной м–Ќ , содержащей синтетический ген √ћ- —‘.
»сточники информации
1. Clark S. K. and Kamen R.// Sceince, 1987, v.236, N. 4806, pp.1229-1237.
2. Burgess A.V. Wilson E.M.A. and Metcalf D.// Blood, 1979, v.54, p.614.
3. Gasson J.C. Weishard R.H. Kaufman S.E. Clark S.G. Wong G.C. Gold D.W. // Science, 1984, v.226, p.1339.
4. Wong G.G. Witek J.S. Temple P.A. Wilkens K.M. Leary A.C. Luxenberg D. P. Jones S.S. Brown E.L. Kay R.M. Orr E.C. Shoemarker C. Kaufman R.J. Hewick R.M. Wang E.A. Clark S.G.// Science, 1985, v.228, p.819.
5. √илева ».ѕ. Ѕондарь “.—. Ѕлинова Ќ.Ќ. ’алдо€ниди —. .  равченко ¬.¬. ќфицеров ¬.». ястребов —.».  оробко ¬.√.// ƒоклады –јЌ, 1994, т.336, N 2, с. 254-256.
6. Burgess A.W. Begly C.G. Jonson G.R. Lopez A.F. Williamson D.J. Mermoid J.J. Simpson R.J. Schmitz A. DeLammarter J.F.// Blood, 1987, v.69, N 1, p. 43-51.
7.  равченко ¬. ¬. √илева ».ѕ. Ўамин ¬.¬. Ћихошвай ¬.ј. ƒобрынин ¬.Ќ. ‘илиппов —. ј.  оробко ¬. √. Ѕиоорганическа€ хими€, 1988, т.14. N 10, с. 1372-1386.
8.  олосов ћ.Ќ.  оробко ¬.√. ƒобрынин ¬.Ќ. —еверцова ».¬. „увпило —.ј. Ѕыстров Ќ.—. Ѕерлин ё.ј.  аюшин ј.Ћ. Ѕуткус ¬.¬. ѕол€кова ».ј. Ѕолдырева ≈. ‘. —андахчиев Ћ. —. ѕопов —.√. Ўубина “.Ќ.  равченко ¬.¬. —ерпинский ќ.». ямщиков ¬.‘. Ѕеликов —.». —ин€ков ј.Ќ. —иволобова √.‘. јвторское свидетельство, N 1092176, опубл.в. Ѕ.». 1984, N 18.
9. Birnboim H.C.// in: Methods in Enzymology. Recombinant DNA. Part B. 1983, v. 100. Eds. Wu R. Grossman L. Moldave R. p.243-254. Academic Press, Inc.
10. Chuvpilo S.A. and Kravchenko V.V.//FEBS. 1984, v.179, N 1, p.34-36.
11. јкименко «. ј. «ыков —.ј. ќфицеров ¬.». √илева ».ѕ.  равченко ¬.¬. —андахчиев Ћ.—.//ƒокл. јЌ ———–, 1991, т.40, N 4, с. 878-884ћ
‘ормула изобретени€: 1. –екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  p 280GM, кодирующа€ полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с мол. м. 2,7 Md, содержаща€ PstI/BamHI фрагмент ƒЌ  плазмиды pDS 280 (1083 п.о.), включающий часть гена β -лактамазы и тандем промоторов триптофанового оперона E. coli; NcoI/PstI фрагмент pGMtrp, включающий часть синтетического гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, кодирующую полипептид (13 127) зрелого √ћ- —‘ человека (2834 т.п.о.), часть гена β - лактамазы и терминатор транскрипции фага λ, синтетический дезоксиолигонуклеотидный дуплекс,
5'-GATCAATTCTATGGACCAGCATCTCCCTCTCCTTCTACTCAAC-3'
3'-TTAAGATACCGTGGTCGTAGAGGGAGAGG-AAGATGAGTTGGTAC-5',
включающий ATG-кодон и кодирующий полипептид (1 12) зрелого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека; синтетический ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека; генетический маркер ген β -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p 280GM клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавани€ рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих рассто€ни€х вправо от сайта EcoRI (279 п.о.) - BamHI-454 нуклеотида; PstI-2938 нуклеотидов.
2. Ўтамм Escherichia coli SG20050/p280GM ¬ ѕћ B-6613 продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека.