Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ, ВЫЗВАННОЙ НЕКОНТРОЛИРУЕМЫМ ХРОНИЧЕСКИМ РАДИАЦИОННЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ЧЕЛОВЕКА
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ, ВЫЗВАННОЙ НЕКОНТРОЛИРУЕМЫМ ХРОНИЧЕСКИМ РАДИАЦИОННЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ЧЕЛОВЕКА

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ, ВЫЗВАННОЙ НЕКОНТРОЛИРУЕМЫМ ХРОНИЧЕСКИМ РАДИАЦИОННЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ЧЕЛОВЕКА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к области биологии и медицины. С целью индикации клинико-цитогенетических эффектов неконтролируемого хронического облучения населения, проживающего в районах, загрязненных радионуклидами, проводили исследование выхода цитогенетических нарушений в тест-культуре эмбриональных кожно-мышечных клеток человек, индуцируемых эндогенными факторами плазмы крови доноров, что является косвенным свидетельством развития признаков радиационной интоксикации. 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2093811
Класс(ы) патента: G01N1/28
Номер заявки: 5068369/14
Дата подачи заявки: 17.03.1992
Дата публикации: 20.10.1997
Заявитель(и): Институт генетики и цитологии (BY)
Автор(ы): Михалевич Людмила Степановна[BY]; Перепецкая Галина Андреевна[BY]; Чеботарева Наталья Вячеславовна[BY]
Патентообладатель(и): Институт генетики и цитологии (BY)
Описание изобретения: Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для индикации клинико-цитогенетических эффектов неконтролируемого хронического облучения населения, проживающего в районах, загрязненных радионуклидами.
Известны аналогичные способы исследования мутагенной активности метаболитов, содержащихся в плазме крови. Так, мутагенную активность метаболитов в плазме крови крыс Sprague Dawley обработанных циклофосфамидом в дозах 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 мг/кг веса, оценивали по частоте CXO в лимфоцитах человека и крыс. Показано, что увеличение частоты CXO в лимфоцитах человека и крыс было сравнимо по дозам и амплитуде и носило дозово-зависимый характер. Известно, что через 4 24 ч после γ- облучения в дозе 8 Гр биологическую активность (токсичность) плазмы крови крыс-самцов линии Вистар определяли по выживаемости бактерий E. coli и по образованию мутаций у бактериофага T4Br+. Плазму крови контрольных или γ- облученных животных, разбавленную в 2 раза от исходной концентрации, добавляли к бактериофагу T4Br+ и к водной суспензии бактерий E. coli. Подсчет выживших колоний E.coli проводили через 24 ч, а r -мутантов фагочастиц через 18 ч инкубации. В результате проведенных исследований было высказано предположение об образовании аддуктов альбумина с хиноидными радиотоксинами и возможной роли этих соединений в развитии радиационного поражения критических тканей организма.
Прототипом данного изобретения может быть способ, который состоит в том, что исследовали частоту спонтанных и индуцированных блеомицином аберраций хромосом в культуре лимфоцитов, а также частоту микроядер в культивированных лимфоцитах периферической крови и некультивированных клетках слизистой рта и волосяных луковиц у больных атаксией-телеангиэктазией (АТ) и в контроле. Микроядерный тест в лимфоцитах выполняли методом блокирования цитокинеза. Получен различный цитогенетический ответ на культивируемых и некультивируемых клетках больных АТ: частота спонтанных и индуцированных аберраций хромосом и микроядер в культурах лимфоцитов была в 3 раза выше у больных АТ по сравнению с контролем, тогда как микроядерный тест в клетках слизистой рта и волосяных луковиц больных АТ показал норму. С целью выяснения вопроса о том, связаны ли указанные различия с культуральными условиями, в культуру добавляли сыворотку крови больных АТ. Авторы не смогли обнаружить какие-либо факторы в плазме больных АТ, которые увеличивали бы аберрации хромосом у нормальных людей или гетерозиготных носителей.
Однако данный способ не может быть использован в таком виде, так как он имеет ряд существенных недостатков:
1) в качестве тест-системы используется синхронизированная культура лимфоцитов, которая затрудняет экстраполяцию полученных данных на гетерогенную популяцию клеток целостного организма, находящихся на различных стадиях клеточного цикла и имеющих различную радиочувствительность;
2) для получения препаратов хромосом лимфоцитов периферической крови требуется обработка культур дефицитными реактивами (митогенами и препаратами, вызывающими цитокинетический блок делящихся клеток) производства зарубежных фирм, что делает этот способ экономически затруднительным;
3) используемый способ не связан с выявлением действия фактора радиационного происхождения на выход цитогенетических повреждений в организме человека.
Цель данного изобретения состоит в индикации клинико-цитогенетических эффектов неконтролируемого хронического облучения населения, проживающего в районах, загрязненных радионуклидами для проведения профилактических и лечебных мероприятий.
Эта цель достигается тем, что для раннего обнаружения признаков радиационной интоксикации введено:
1) использование тест-системы на основе диплоидной культуры эмбриональных кожно-мышечных клеток человека;
2) исследование на мутагенную активность факторов плазмы крова жителей загрязненных радионуклидами территорий Беларуси.
В таблице приведена оценка цитогенетических изменений, регистрируемых с помощью микроядерного теста, в диплоидной культуре эмбриональных кожно-мышечных клеток человека, индуцированных плазмой крови жителей, загрязненных радионуклидами районов Беларуси.
Способ реализован следующим образом.
В качестве тест-системы для изучения генотоксичности плазмы крови была выбрана диплоидная культура эмбриональных кожно-мышечных клеток человека 8 - 12 пассажей.
Диплоидная культура эмбриональных кожно-мышечных клеток человека это полуперевиваемая культура, сохраняющая нормальный кариотип (2 п 46), ограниченный рост и период размножения, а также другие свойства исходных клеток организма, что дает возможность экстраполировать полученные результаты на организм человека.
Клетки выращивали в модифицированных флаконах Карреля на предметных стеклах в питательной среде, содержащей: 5%-ный раствор гемогидролизата - продукта ферментативного гидролиза сгустков крови крупного рогатого скота или человека (отходы производства гаммаглобулина), который представляет собой концентрат 20 аминокислот, солевой раствор Хенкса, 8 витаминов. Кроме того, в ростовую среду добавляют 10% по объему бычьей сыворотки и антибиотики в виде пенициллина и стрептомицина.
Флаконы после добавления 15 мл клеточной суспензии в каждый (концентрация клеток в питательной среде составляла 105 кл/мл) термостатировали при температуре 57oC. При указанных условиях культивирования логарифмическую стадию роста отмечали на 2-е сутки после пересева на свежую питательную среду. Именно в этот период (на вторые сутки роста клеток) во флаконы с клеточной суспензией добавляли по 0,5 мл плазмы крови обследуемого, полученной путем отстаивания периферической крови в течение 60 мин при комнатной температуре. Кровь обследуемого получали методом венопункции или из пальца и в стерильных флаконах с гепарином доставляли к месту проведения эксперимента в стационарный бокс, работу в котором проводили с соблюдением всех правил асептики. Контролем служила параллельная культура кожно-мышечных клеток человека того же пассажа и концентрации, что и опытная культура с добавлением 0,5 мл плазмы крови доноров клинически здоровых людей в возрасте до 30 лет, полученной на Республиканской станции переливания крови г. Минска. Культивирование эмбриональных клеток человека в присутствии плазмы крови доноров и обследуемых проводили в течение 24 ч, после чего опытные и контрольные стекла, на которых имелся достаточно плотный монослой клеток, для фиксации помещали в свежеприготовленную охлажденную смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Затем препараты окрашивали 3 - 5%-ным водным раствором Гимза и промывали проточной водой.
В качестве теста при изучении генотоксичности плазмы крови был выбран микроядерный тест, предложенный в 1973 году. Показано, что этот тест является достаточно чувствительным, более простым и экономически выгодным по сравнению с общепризнанным цитогенетическим методом исследования аберраций хромосом в метафазе митоза. Применение микроядерного теста дает возможность проведения автоматизации исследований.
В результате изучения генотоксичности эндогенных факторов плазмы крови обследовано 29 человек. Проведен популяционный (7 детей Ветковского р-на Гомельской области, 3 детей и 15 взрослых Краснопольского р-на Гомельской области с уровнем загрязнения по 90Sr (0,8 2,0 Ки/км2) и по 137Cs (20 100 Ки/км2), а также целевой цитогенетический мониторинг, основанный на клиническом диагнозе гемопатий (апластическая анемия, лейкоз), у 6 детей, проживающих в условиях длительного неконтролируемого облучения и находившихся с целью обследования или лечения в Детском гематологическом центре г.Минска.
Данные таблицы свидетельствуют о достоверном увеличении частоты клеток с микроядрами во всех обследованных группах: дети и взрослые Краснопольского р-на, дети Ветковского р-на, а также дети с гемопатиями (P <0,001, 0,001, 0,05, 0,001 соответственно). У всех обследованных также отмечено достоверное увеличение количества микроядер на 100 проанализированных клеток (P < 0,001, 0,001, 0,01, 0,001 соответственно). Выход микроядер в свободной выборке (население Гомельской и Могилевской областей) варьирует от 0,30 до 1,02 на 100 клеток, превышая в 2 2,5 раза контрольный уровень. Максимальный цитогенетический эффект (1,92 на 100 клеток) отмечен в группе детей с гемопатиями, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях Беларуси. При сравнении выхода микроядер в группах детей, обследованных по медицинским показаниям, и в свободной выборке (население Гомельской и Могилевской областей) обнаружен параллелизм цитогенетического эффекта плазмы крови детей и взрослых из зоны радиоактивного загрязнения и детей с гемопатиями, находящихся на лечении в Детском гематологическом центре г.Минска.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что
Обнаруженное достоверное повышение уровня цитогенетических нарушений в тест, культуре эмбриональных кожно-мышечных клеток человека, индуцированных эндогенными факторами плазмы крови доноров, принадлежащих к различным группам населения Беларуси, подвергшегося длительному неконтролируемому облучению, является косвенным свидетельством развития процессов радиационной интоксикации в организме обследованных.
Предлагаемая тест, система на основе диплоидной культуры эмбриональных кожно-мышечных клеток человека является удобным объектом для исследования генетической активности плазмы крови, что открывает возможность ранней диагностики гемопатий (основанной на процессах радиационной интоксикации) и проведения профилактических и лечебных мероприятий.
Использование данного способа позволит:
1.Сократить расходы на проведение цитогенетического обследования.
2. Сократить время проведения цитогенетического обследования,
3. Ускорить выявление цитогенетического эффекта хронического действия внутреннего и внешнего облучения на соматические клетки людей, проживающих в зоне радиоактивного загрязнения.
4. Проводить профилактику с целью выявления радиационной интоксикации.
5. Раннее прогнозирование и выявление гемопатий у населения, проживающего в условиях длительного неконтролируемого облучения.
Формула изобретения: Способ определения интоксикации, вызванной неконтролируемым хроническим радиационным облучением человека, включающий стерильный забор крови из вены или пальца, приготовление и двухсуточное культивирование диплоидной культуры эмбриональных кожно-мышечных клеток человека 8 12 пассажей до получения монослоя клеток на предметных стеклах в модифицированных флаконах Карреля, фиксацию клеток смесью 96o-ного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3 1, окраску препаратов 3 5%-ным водным раствором Гимза, цитогенетический анализ по микроядерному тесту, отличающийся тем, что при обнаружении цитогенетических нарушений в тест-культуре эмбриональных кожно-мышечных клеток человека, индуцируемых плазмой крови доноров, и при содержании 2 5 микроядер на 1 микроядерную клетку определяют наличие интоксикации в результате хронического радиационного облучения.