Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток. Сущность изобретения заключается в том, что заявляемое средство представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы 18O при его содержании в среде не ниже 15%. 4 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2095066
Класс(ы) патента: A61K33/00
Номер заявки: 96123930/14
Дата подачи заявки: 25.12.1996
Дата публикации: 10.11.1997
Заявитель(и): Научно-исследовательский институт импульсной техники Министерства по атомной энергии РФ; Онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина РАМН
Автор(ы): Медведовская Н.И.; Сыркин А.Б.; Герасимова Г.К.; Власенкова Н.К.; Жукова О.С.; Иванова Т.П.
Патентообладатель(и): Научно-исследовательский институт импульсной техники Министерства по атомной энергии РФ; Онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина РАМН
Описание изобретения: Изобретение относится к медицинt, фармакологии и касается средств, подавляющих рост опухолевых клеток.
В настоящее время исследовано множество веществ, подавляющих рост опухолевых клеток, однако один из них проявляет высокую токсичность в отношении здоровых клеток, что является лимитирующим фактором при их исследовании, другие обладают узким фармакологическим спектром действия.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является стабильный тяжелый изотоп водорода дейтерий (D), проявляющий противоопухолевую активность in vitro и in vivo.
Однако замена уже 30% H2O на D2O приводит к гибели животных, что свидетельствует о довольно высокой токсичности тяжелой дейтериевой воды.
Цель изобретения поиск новых средств, подавляющих пролиферацию опухолевых клеток и не обладающих высокой токсичностью для здоровых клеток.
В качестве средства, подавляющего рост опухолевых клеток предложен стабильный тяжелый изотоп кислорода 18O в концентрации его в среде не ниже 15% Стабильный изотоп кислорода 18O распространен в природе повсеместно в концентрации 0,2% и в этой концентрации не обладает цитотоксическими свойствами. Предлагаемое средство представляет собой стабильный изотоп кислорода формулы 18O при его содержании в среде не ниже 15% т.е. в 75 500 раз превышающем фоновый уровень этого изотопа в атмосферном кислороде и природной воде.
Эксперименты проведены в системе in vitro на двух видах опухолевых клеток человека: карциноме яичника (линия CaoV) и меланоме (линия MS).
Выбранные для исследования культуры клеток злокачественных опухолей человека отличается как по своему генезу, скорости роста в культуре, так и по степени чувствительности к известным противоопухолевым препаратам разных классов.
Поскольку тестирование антипрофилеративной активности соединений in vitro основано на применении водных культуральных сред, предложенное средство 18O вводили в среду в виде тяжело-кислородной воды H218O.
Исследование цитотоксического эффекта 18O на клетки карциномы яичника человека (линия CaoV).
Культура клеток CaoV растет в виде монослоя при 37oC в стандартной питательной среде RPMI1640, содержащей 10% эмбрионной сыворотки теленка. Перед опытом клетки снимают со стекла раствором Версена, суспендируют в среде инкубации и рассеивают во флаконы по 2 мл.
В фазе экспоненциального роста опытные образцы заливают питательной средой RPMI1640, приготовленной на H218O[94,4 атом.18O] с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка. Максимальная конечная концентрация 18O в пробе составила 80 атом. Далее опытные образцы инкубировали в течение 24 ч, 48 ч или 72 ч. Рост клеток в опытных образцах сравнивали с ростом клеток в контрольных образцах, выращенных на стандартной питательной среде.
Цитотоксический эффект 18O определяли радиометрическим методом по включению 3H-тимидина (3H-T) в клетки CaoV·3H-T добавляли к пробам за 1 ч до окончания времени инкубации клеток. Результаты выражали в виде торможения включения 3H-T в клетки в опытных образцах по сравнению с уровнем включения 3H-T в контрольных образцах (%).
Исследовали зависимость цитотоксического эффекта 18O на рост клеток CaoV от времени инкубации при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации 18O в среде культивирования клеток [8,15,40,80 атом. 18O] Результаты представлены в табл. 1 и 2.
Представленные в табл. 1 и 2 данные показаны, что
18O[80% обладает прямым цитотоксическим эффектом, величина которого прямо зависит от времени контакта клеток CaoV с H218O: через 48 ч инкубации 33% торможения включеия 3H-T в клетки, через 72 ч 73% торможения;
величина цитотоксического эффекта 18O относительно клеток CaoV зависит от концентрации 18O в среде культивирования: после 72 ч инкубации максимальное (65%) торможение включения 3H-T в клетки наблюдали при 80% концентрации 18O в среде; минимальное статистическое значение (17,5%) торможение при 15% концентрации 18O в среде.
Исследование цитотоксического эффекта 18O на клетки меланомы человека (линия MS).
Клетки меланомы человека MS росли в культуре в виде монослоя в среде DMEM-RPMI 1640 (1: 1) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка в газовой среде 5% CP2 95% воздуха при 37oC. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в объеме 100 мкл по 300 клеток в лунке.
В контрольных образцах клетки выращивались в стандартной питательной среде на бидистилляте.
В опытных образцах в фазе экспоненциального роста клеток стандартную питательную среду на бидистилляте заменяли на питательную среду, приготовленную на H2O18.
Цитотоксический эффект 18O оценивали с помощью MTT-теста, основанного на восстановлении тетразолия (MTT) митохондриальными дегидрогеназами живых клеток в голубой формазан, концентрацию которого определяли спектрофотометрически. Для этого после 72 ч культивирования клеток в каждую лунку (включая контрольное) добавляли 20 мкл MTT в концентрации 5 мг/мл. После 4 ч инкубации клеток с MTT при 37oC среду роста удаляли полностью и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в DMSO (60 мкл на лунку). Оптическую плотность раствора в каждой лунке с помощью сканирующего спектрометра Titertek Multiscan MCC\340 при длине волны 540 нм.
Каждой экспериментальной точке соответствовало 3 параллельных измерения. Парциальное поглощение (M+m) красителя в контрольных пробах, выращенных на среде DMEM-RPMI1640, растворенной в бидистиллированной H2O, принято за 100%
Исследовали зависимость цитотоксического эффекта 18O на рост клеток меланомы MS от времени инкубации при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. и зависимости эффекта от концентрации 18O в среде культивирования (0,50,75,80 атом.).
Цитотоксический эффект 18O в опытных пробах определяли как фракцию выживших клеток по соотношению порциального поглощения опытных и контрольных образцов (%).
Результаты представлены в табл. 3 и 4.
Представленные в табл. 3 и 4 данные показывают, что
18O обладает прямым цитотоксическим эффектом на рост клеток MS;
максимальный цитотоксический эффект 18O на клетки MS наблюдается при концентрации 18O в культуральной среде 80 атом. при этом уже через 24 ч происходит гибель более 50% клеток;
величина цитотоксического эффекта 18O практически не зависит от времени инкубации: через 24 ч 42% выживших клеток, в течение последующих 48 ч эффект не изменяется;
величина цитотоксического эффекта 18O на рост клеток MS резко падает при понижении концентрации 18O в культуральной среде (при 75 атом. гибель 20% клеток, при 50 атом. гибель менее 20% клеток).
Использование двух различных методов тестирования антипролиферативной активности 18O, один из которых (MTT-тест) регистрируют только фракцию живых клеток, а другой (радиометрический тест) оценивает суммарный эффект (цитостатический и цитотоксический), позволяет сделать вполне обоснованный вывод, что 18O оказывает не просто цитотоксическое действие, а вызывает необратимое повреждение (гибель) клеток.
Максимальным цитотоксическим эффектом 18O обладает при концентрации в культуральной среде 80 атом. вызывая гибель 50 70% злокачественных опухолевых клеток.
Минимальный статистически значимый цитотоксический эффект (17,5% торможения роста клеток) оказывает 18O в концентрации 15% в культуральной среде.
Таким образом, экспериментальными исследованиями in vitro на примере двух видов злокачественных опухолевых клеток (CaoV и MS), различных по происхождению, кинетике роста в культуре и лекарственной чувствительности, впервые показано, что тяжелый стабильный изотоп кислорода 18O, оказывает подавляющее действие на рост опухолевых клеток.
Формула изобретения: Средство, подавляющее рост опухолевых клеток, отличающееся тем, что оно представляет собой стабильный тяжелый изотоп кислорода формулы 18О при его содержании в среде не ниже 15%