Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПЕРЕНОСА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ
СПОСОБ ПЕРЕНОСА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ

СПОСОБ ПЕРЕНОСА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: животноводство, медицина, научно-исследовательская практика. Сущность изобретения: для переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных получают сначала конъюгат трансферрина с модифицированным полилизином или гистоном при соотношении (1-5,5):1, который затем объединяют с переносимой нуклеиновой кислотой. 4 табл., 15 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2098487
Класс(ы) патента: C12Q1/68
Номер заявки: 4743718/13
Дата подачи заявки: 15.03.1990
Дата публикации: 10.12.1997
Заявитель(и): Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE)
Автор(ы): Хартмут Бойг[DE]; Макс Бирнштиль[CH]; Месью Коттен[US]; Эрнст Вагнер[AT]
Патентообладатель(и): Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE)
Описание изобретения: Изобретение относится к обеспечению клеток животного биологически активными веществами, более конкретно к способу переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных.
Известен способ переноса нуклеиновой кислоты или ее производного, например ДНК, в гепатоциты, который заключается в том, что в случае необходимости модифицированный поликатион, преимущественно полилизин, или кодирующую поликатион последовательность объединяют с гликопротеином, который связывается имеющимися на поверхности гепатоцитов рецепторами (см. G.Y.Wu, C.H.Wu, (1988), J. Biol. Chem. 263, с. 14621-14624).
Недостатком известного способа является то, что он годится только для переноса нуклеиновых кислот или их производных в гепатоциты. Следовательно, экспериментальные возможности известного способа ограничены.
Целью изобретения является расширение экспериментальных возможностей системы переноса биологически активных веществ за счет того, что биологически активные вещества можно вводить в самые различные клетки животных.
Данная цель достигается в способе переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных, предусматривающем получение конъюгата путем объединения модифицированного поликатиона с гликопротеином, а затем полученного конъюгата с переносимой нуклеиновой кислотой, за счет того, что в качестве гликопротеина используют трансферин, а в качестве поликатиона используют полилизин или гистон при соотношении гликопротеина и поликатиона (1-5,5) 1.
Трансферин представляет класс родственных связывающих металл транспортных гликопротеинов со специфичностью на живом организме для железа. Были идентифицированы различные трансферины млекопитающих, причем трансферин плазмы снабжает большинство тканей тела железом. Основным производителем трансферина является печень.
Трансферин имеет мол.м. около 80000, из чего 6 приходятся на остатки сахара. Одна молекула трансферина может связывать две молекулы железа, причем связывание требует присутствия карбонатных или бикарбонатных ионов.
Рецептор трансферина, от которого, быть может, на различных клетках имеются несколько отклоняющихся друг от друга форм, например в углеводной группе, представляет трансмембранный гликопротеин мол. м. около 180000, причем одна молекула рецептора может связывать одну или возможно две молекулы трансферина.
Рецептор трансферина при физиологическом значении pH 7,4 имеет очень высокое сродство к Fe2-трансферину, меньшее сродство к Fe-трансферину и практически не имеет сродства к апотрансферину, хотя последний при pH примерно 5 образует очень стойкий комплекс с рецептором.
Рецепторы трансферина были обнаружены особенно в большом количестве в предшественниках эритроцитов, плаценте и печени, в измеримом количестве также во многих других тканях тела. Особый интерес представляет тот факт, что рецептор в растущих клетках может регулироваться в плюсовую сторону. Установили также, что количество рецептора в опухолевой ткани в живом организме значительно повышено по сравнению с доброкачественными поражениями, что указывает на повышенную потребность в железе. Механизм поглощения комплекса трансферина-железа рецепторами и его внутриклеточный цикл хорошо исследованы.
Объединение модифицированного полилизина или гистона с трансферином можно осуществлять химическим или рекомбинантным способом известными приемами.
В зависимости от требуемых свойств конъюгата особенно ввиду его стабильности объединение можно осуществлять через а) дисульфидные мостики, которые в восстанавливающих условиях могут снова расщепляться (например, при применении сукцинимидилпиридилдитиопропионата), б) в основном стойкие в биологических условиях соединения (например, простые тиоэфиры реакцией малеимидо-линкеров с сульфгидрилгруппами связанного со вторым компонентом линкера), в) неустойчивые в биологических условиях мостики, например, сложноэфирные связи, или неустойчивые в слабо-кислых условиях ацетальные или кетальные связи.
Объединение рекомбинантным путем дает то преимущество, что можно получать точно определенные однородные комплексы, в то время как при химическом связывании образуются смеси конъюгатов, которые следует разделять.
Рекомбинантное объединение можно осуществлять по известным для получения химерных полипептидов методам. При этом поликатионные пептиды можно изменять относительно их размера и последовательности аминокислот. Получение методом генной инженерии дает также то преимущество, что можно модифицировать содержание трансферина в конъюгате, например, за счет того, что благодаря подходящим мутациям можно повышать способность к связыванию с рецепторо или, что содержание трансферина можно сокращать до необходимой для связывания с рецептором доли молекулы. Особенно целесообразным для рекомбинантного объединения является применение вектора, который содержит кодирующую требуемое количество трансферина последовательность и полилинкер, в который включают соответственно необходимую кодирующую поликатионный пептид последовательность. Таким путем можно получать набор экспрессионных плазмид, из которого можно выбирать плазмиду, требуемую для экспрессии желаемого конъюгата.
При переносимых в клетки нуклеиновых кислотах речь идет о ДНК или РНК, причем относительно нуклеотидной последовательности не существует никаких ограничений. Нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы, если модификация не причиняет ущерба полианионному характеру нуклеиновых кислот; к этим модификациям причисляют, например, замещение фосфодиэфирной группы фосфоротиоатом или применение нуклеозидных аналогов.
В качестве нуклеиновых кислот в рамках изобретения принимают во внимание прежде всего такие нуклеиновые кислоты, которые с целью торможения специфических генных последовательностей должны переноситься в клетку. К ним причисляют анти-м-олигонуклеотиды и рибозимы, в случае необходимости вместе с нуклеиновой кислотой-носителем.
Относительно размера нуклеиновых кислот изобретение также не предусматривает ограничений. Возможное же ограничение нижнего предела обусловлено исключительно спецификой применения изобретения, так как, например, анти-м-олигонуклеотиды, имеющие приблизительно менее 10 нуклеотидов, едва ли могут применяться в расчет ввиду слишком небольшой специфичности. С помощью полученного по изобретению конъюгата можно переносить также в клетку плазмиды, причем прежде всего имеют практическое значение более мелкие плазмиды, которые по своей функции применяются в качестве нуклеиновой кислоты-носителя (приблизительно ретровирусные векторы размером до 5.000 пар оснований (далее: п.о.).
Можно также переносить в клетку одновременно различные нуклеиновые кислоты с помощью конъюгата по изобретению.
Другое преимущество изобретения заключается в том обстоятельстве, что для трансферина и рецептора существуют полиморфизмы, которые могут использоваться для целенаправленного переноса тормозящих нуклеиновых кислот в определенные клетки.
В рамках изобретения смогли показать, что конъюгаты трансферина и поликатиона эффективно поглощаются живыми клетками и вводятся вовнутрь. Полученный по изобретению конъюгат или его комплекс с нуклеиновой кислотой не являются вредными для роста клеток. Это делает возможным повторное применение и тем самым постоянно высокую экспрессию введения в клетку генов.
Далее можно было доказать, что конъюгаты поликатиона и трансферина могут функционально заменять нативный трансферин железо-комплекс. Тот факт, что комплексы конъюгата трансферина и поликатиона и ДНК поглощаются клеткой через рецептор трансферина, был подтвержден с помощью гена люциферазы в качестве компонента ДНК. Было доказано, что нативный трансферин эффективно вытесняет комплекс ДНК и конъюгата трансферина и поликатиона, что измерялось на основании уменьшения активности люциферазы в клетке.
Результаты проведенных в рамках изобретения опытов также показали, что ген т-РНК и рибозима (рибозим был направлен против последовательности V-erbB) с помощью конъюгата по изобретению можно вводить в трансформированные куриные клетки и ослаблять трансформирующее действие онкогена. Этот результат тем значительнее, что в этих опытах применяли только небольшое количество рибозимного гена.
Соотношение нуклеиновой кислоты и конъюгата может колебаться в широких пределах, причем необязательно требуется нейтрализовать все заряды нуклеиновой кислоты. Это соотношение от случая к случаю в зависимости от критериев, таких, как, например, размер и структура переносимой нуклеиновой кислоты, размер поликатиона, т.е. полилизина, число и распределение его зарядов, можно регулировать таким образом, что существует благоприятное для соответствующего применения соотношение между способностью к переносу и биологической активностью нуклеиновой кислоты.
Получение комплекса нуклеиновой кислоты и конъюгата трансферина и поликатиона можно осуществлять методами, известными для комплексообразования полиионных соединений. Во избежание неконтролируемого скопления или осаждения можно поступать так, что оба компонента сначала смешивают при высокой (около 1-молярной) концентрации хлористого натрия и затем диализом или разбавлением устанавливают физиологическую концентрацию хлористого натрия. При реакции комплексообразования преимущественно не применяют слишком высокие концентрации ДНК и конъюгата (более 100 мкг/л), чтобы избежать осаждения комплексов.
Предпочтительной нуклеинкислотной частью комплекса с конъюгатом трансферина и поликатиона является анти-м-ДНК, анти-м-РНК, рибозим или кодирующий их ген. При применении рибозимов и анти-м-РНК особенно выгодно вводить гены, кодирующие РНК, тормозящие функции РНК, предпочтительно вместе с геном-носителем. В отличие от введения РНК как таковой введение гена в клетку гарантирует значительную амплификацию РНК и тем самым запас, достаточный для желаемого торможения биологической реакции. Особенно подходящими генами-носителями являются необходимые для транскрипции полимеразой III транскрипционные единицы, например, гены т-РНК. В последние можно включать, например, рибозимные гены таким образом, что при транскрипции рибозим представляет часть компактного транскрипта полимеразы III.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение конъюгантов трансферина и полилизина 90. Связывание производят аналогично известным из литературы методам введением дисульфидных мостиков после модификации сукцинимидилпиридилдитиопропионатом.
а) Модифицированный 3-(2-пиридилдитио)пропионатом трансферин 6 мл фильтрованного через гель сефадекс Г-25 раствора 120 мг (1,5 ммоль) трансферина (из белка куриного яйца, кональбумина типа 1, не содержащего железа) в 3 мл 0,1-молярного буфера фосфата натрия (pH 7,8) смешивают при сильном встряхивании с 200 мкл 15-ммолярного этанольного раствора сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионата (3 ммоль, далее: SPDP) и смесь оставляют стоять в течение часа при комнатной температуре и при случайном встряхивании, через колонку с гелем (сефадекс Г-25, размер 14х180 мм, 0,1-молярный буферный раствор фосфата натрия с pH 7,8) отделяют низкомолекулярные продукты реакции и остатки реагентов и получают при этом 7 мл фракции продукта: содержание связанных с трансферином остатков пиридилдитиопропионата устанавливают при помощи аликвота после восстановления дитиотреитолом путем фотометрического определения количества высвободившегося пиридин-2-тиона, оно составляет около 2,6 мкмоль.
Идентичным образом модифицируют трансферин человека (не содержащий железа).
б) Модифицированный меркаптопропионатом полилизин 90 (далее: pL 90). Раствор 18 мг (около 1,0 мкмоль) гидробромида поли-1-лизина, меченого изотиоцианатом флуоресцеина (далее: FITC) мол.м. около 18000 ( соответствует средней степени полимеризации около 90) в 3 мл 0,1-молярного фосфата натрия (pH 7,8) фильтруют через сефадекс Г-25 (флюоресцентную маркировку осуществляют в буферном растворе бикарбоната натрия с pH 9 в течение 3 ч). Раствор полилизина разбавляют водой до 7 мл, смешивают при хорошем встряхивании с 270 мкл 15-ммолярного этанольного раствора SPDP и смесь оставляют стоять в течение часа в темноте при комнатной температуре и при случайном встряхивании. После добавки 0,5 мл 1-молярного буферного раствора ацетата натрия (pH 5,0) низкомолекулярные вещества отделяют фильтрацией через сефадекс Г-25 (элюент: 20 ммоль буферного раствора ацетата натрия с pH 5,0). Фракцию продукта (окрашивание нингерином, флюоресценция) сгущают в вакууме, pH среды доводят примерно до 7 добавкой буфера, добавляют раствор 23 мг (150 мкмоль) дитиотреитола в 200 мкл воды и смесь оставляют стоять в темноте на 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Дальнейшей гель-фильтрацией (на сефадексе Г-25 колонка размером 14x130 мм, 10 ммоль буферного раствора ацетата натрия с pH 5,0) отделяют избыточный восстановитель и получают 3,5 мл раствора полилизина с флюоресцентной маркировкой, содержащего 3,8 мкмоль меркаптогрупп (фотометрическое определение с помощью реактива Эллмана, 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты).
в) Конъюгаты трансферина и полилизина. Полученный на стадии а) раствор модифицированного трансферина (7 мл в 0,1-молярном буферном растворе фосфата натрия с pH 7,3, около 1,5 мкмоль трансферина, содержащего приблизительно 2,6 мкмоль остатков пиридилдитиопропионата) промывают аргоном, добавляют 2,0 мл полученного на стадии б) раствора меркапто-модифицированного полилизина (в 10 ммоль буферного раствора ацетата натрия с pH 5,0, это соответствует приблизительно 0,6 мкмоль полилизина приблизительно с 2,2 мкмоль меркаптогрупп), промывают аргоном, встряхивают и в атмосфере аргона оставляют стоять в темноте на 18 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют водой до 14 мл и разделяют ионообменной хроматографией (содержащая ионит моно S колонка HR 10/10, градиентная элюация, буферный раствор А:50 ммоль HEPES с pH 7,9, буферный раствор Б: А+З моль хлористого натрия, 0,5 мл/мин, см. фиг. 1). Неконъюгированный трансферин элюируют вначале фракции продукта приблизительно при 0,66-1,5 моль хлористого натрия. Получают конъюгаты, которые имеют усредненное ( по всем фракциям) соотношение трансферина и полилизина, равное 1,3:1.
Конъюгированные продукты (окрашивание нингидрином, абсорбция протеина в ультрафиолете при 280 нм и измерение флюоресценции маркированного FITC полилизина при 495 нм) собирают в 6 фракций с содержанием каждая приблизительно 10 мг трансферина. Фракции сначала подвергают диализу относительно 100 ммоль раствора цитрата железа (III) (бикарбонатом натрия доводят до pH 7,8) и после этого еще дважды диализуют относительно 1 ммоль буферного раствора HEPES (pH 7,5).
После предварительной обработки 2-меркаптоэтанолом гель-электрофорез с применением 10% додецилсульфата натрия (далее: SDS; 8% полиакриламидного геля, см. фиг. 2, показывает во всех 6 фракциях приблизительно одинаковое содержание трансферина (см. фиг. 2А), в то время как в невосстановленных пробах обнаруживают не полосы для свободного трансферина, а только менее далеко переходящие конъюгаты (см. фиг. 2В, Т необработанный трансферин: 1-6-фракции 1-6 конъюгатов.
Пример 2. Получение конъюгатов трансферина и полилизина 270 и трансферина и полилизина 450 (далее: кокъюгаты TfpL 270 и TfpL 450) а) Получение модифицированного трансферина осуществляют аналогично примеру 1 а.
б) Получение модифицированного полилизина 270 и полилизина 450. Отфильтрованный на геле раствор 0,33 мкмоль полилизина 270 (со средней степенью полимеризации, равной 270 остаткам лизина, с флюоресцентной маркировкой или без нее: соответственно 19 мг гидробромидной соли) в 1,2 мл 75-ммолярного буферного раствора ацетата натрия доводят до pH 8,5 при помощи буферного раствора карбоната натрия. При интенсивном перемешивании добавляют 182 мкл 15-ммолярного этанольного раствора SPDP (1,9 мкмоль). Через час добавляют 200 мкл 1-молярного ацетата натрия с pH 5, после фильтрации на геле с применением 20 ммоль ацетата натрия получают раствор, который содержит 0,27 мкмоль полилизина 270 с 1,3 мкмоль меркаптогрупп (4,8 связующего вещества на одну цепь полилизина).
Аналогичным образом 0,20 мкмоль полилизина 450 (со средней степенью полимеризации, равной 450 остаткам лизина) модифицируют при помощи 2,25 мкмоль SPDP, причем получают продукт 0,19 мкмоль полилизина 450 с 2,1 мкмоль меркаптогрупп (II связующих веществ на одну цепь полилизина). Аналогично примеру 1б) дитиопиридиновые группы восстанавливают дитиотреитолом, чтобы получить свободные сульфгидрильные группы.
в) Получение конъюгатов трансферина и полилизина. 1,0 мкмоль модифицированного трансферина в 100 ммоль буферного фосфатного раствора с pH 7,8 смешивают с 0,14 мкмоль модифицированного полилизина 270 (в 20 ммоль буферного раствора ацетата натрия) при исключении кислорода в атмосфере аргона. После 18 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют водой до объема 10 мл и подвергают катионообменной хроматографии. Содержащая ионит моно S колонка HR10/10: градиентная элюация, буферный раствор А: 50 ммоль HEPESc pH 7,9: буферный раствор Б: А+З моль хлористого натрия: абсорбция в ультрафиолете при 280 нм и измерение флюоресценции, активация при 480 нм, эмиссия при 530 нм). При этом сначала элюируют избыток несвязанного трансферина. Фракции продукта элюируют между 30 и 50% градиента Б и собирают в виде 3 фракций (молярные соотношения трансферина и полилизина фракция А: 5,5:1 фракция Б: 3,4: 1: фракция В: 1,8:1). Конъюгаты получают со средним выходом 0,23 мкмоль трансферина с 0,075 мкмоль полилизина 270.
Подобным образом получают конъюгаты трансферина и полилизина 450, причем исходят из 1,2 мкмоль модифицированного трансферина по примеру 1 а (в 20 ммоль буфера HEPESc pH 7,9, содержащего 80 ммоль хлористого натрия) и 71 нмоль меркапто-модифицированного полилизина 450 по примеру 2 б в ацетатном буфере.
Очистку реакционной смеси проводят с помощью гель-проникающей хроматографии (содержащая ионит супероза 12 колонка, 1 моль хлористого гуанидина с pH 7,3) и диализа (20 ммоль буфера HEPES с pH 7,3, содержащего 100 ммоль хлористого натрия). Получают конъюгаты трансферина и полилизина, содержащие 0,40 мкмоль трансферина и 33 нмоль полилизина 450.
Вставку железа осуществляют таким образом, что на 1 мг трансферина в конъюгате добавляют 6-12 мкл 100 ммоль буферного раствора цитрата железа (содержащего бикарбонат натрия, pH 7,8).
Пример 3 а) Получение конъюгатов трансферина и протамина. Получение модифицированного трансферина осуществляют аналогично примеру 1а.
б) Получение модифицированного 3-меркаптопропионатом протамина.
К раствору 20 мг (3 мкмоль) трифторацетатной соли протамина полученной ионообменной хроматографией выделенного из спермы лосося протамина в виде сульфата ( продукт "сальмин" инофирмы Сигма, DE) в 2 мл диметилсульфоксида и 0,4 мл изопропанола, содержащего 2,6 мкл (15 мкмоль) этилдиизопропиламина, добавляют несколькими порциями в течение 1 ч раствор 30 мкмоль SPDP в 250 мкл изопропанола и 250 мкл диметилсульфоксида. После 3,5 ч при комнатной температуре раствор упаривают в высоком вакууме и поглощают в 0,5-ной уксусной кислоте с содержанием 10% метанола. В результате гель-фильтрации (ионит: сефадекс Г-10: 0,5% -ная уксусная кислота с 10% метанола) получают после лиофилизации 16 мг (2,5 мкмоль) ацетатной соли протамина, модифицированной 2,5 мкмоль дитиопиридинового связующего вещества. Восстановление 1,75 мкмоль протамина (содержащего 1,75 мкмоль связующего) при помощи 16 мг дитиотреитола в буферном растворе бикарбоната натрия с pH 7,5 в течение 1 ч в атмосфере аргона, последующее доведение pH до 5,2 и гель-фильтрация с применением сефадекса Г-10 и 20 ммоль буферного раствора ацетата натрия с pH 5,2 дают раствор протамина, модифицированного 1,6 мкмоль меркаптопропионата.
в) Получение конъюгатов трансферина и проталина В результате реакции полученного на стадии б раствора протамина (1,6 мкмоль связывающего агента ) с 1,34 мкмоль трансферина (модифицированного при помощи 3,1 мкмоль дитиопиридинового связующего вещества) и последующей очистки катионообменной хроматографией, описанной выше для конъюгатов трансферина и полилизина, получают четыре последовательно элюируемые фракции A-D), содержащие соответственно 90,320, 240 и 120 нмоль модифицированного трансферина с возрастающими количествами протамина (определенными посредством гель-электрофореза: 10% SDS, 8% полиакриламидного геля, окрашивание коомасси-синим).
Фиг. 3 показывает результат гель-электрофореза. Фракции A-D конъюгата трансферина и протамина, в которых соотношение трансферина и протамина составляет 1:1,1:4,1:3 и 1:1,5, соответственно, показывают медленно мигрирующие полосы (а), в то время как в восстановленных меркаптоэтанолом пробах(b) обнаруживается только полоса трансферина. Диализ и вставка железа осуществляют тем же образом, что и описано в примере 2 для конъюгатов TfpL 270 и TfpL 450.
Пример 4. Получение конъюгата трансферина и гистона H4.
а ) Получение модифицированного трансферина Процесс осуществляют аналогично примеру 1а.
б) Получение модифицированного 4-меркаптобутиримидатом гистона H4.
В атмосфере аргона к раствору 2,7 мг (0,24 мкмоль) гистона H4 в 0,8 мл буфера (200мМ HEPES, pH 8,5, 5мМ ЭДТУК) добавляют 12 мкл 100 мМ раствора 2-имунотилана (в 100 мМ HERES, pH 8,5; 5 мМ ЭДТА). Через час при 37oС раствор фильтруют на сефадексе Г-25 (колонка размером 14х130 мм; элюент: 30 мМ буфера ацетата натрия с pH 5,0).
Получают 0,20 мкмоль модифицированного гистона H4, содержащего 0,20 мкмоль свободных меркaптогрупп.
в) Получение конъюгата трансферина и гистона H4 реакций продуктов стадий а и б осуществляют аналогично примеру 1в, причем трансферин используют в количестве 0,75 мкмоль. Полученный в результате хроматографии продукт подвергают диализу с применением буфера 25 мМ HEPES, pH 7,3, содержащего 300 мМ хлористого натрия. Получают конъюгат, состоящий из 85 нмоль трансферина и 85 нмоль гистона H4.
Пример 5. Получение комплексов конъюгатов трансферина и поликатиона с ДНК.
Комплексы получают в результате того, что разбавленные растворы ДНК (30 мкг/мл или меньше) смешивают с конъюгатами трансферина и поликатиона. Для предотвращения осаждения комплексов применяют не содержащий фосфата буферный раствор (фосфаты снимают растворимость конъюгатов). Связывание ДНК с конъюгатами в физиологических ионных условиях подтверждается результатами опыта по определению скорости миг рации в агарозном геле с применением на 3-конце 32 p-меченой λ -ДНК, разрезанной при помощи EcoR I/Hind 111 (см. фиг. 4). К каждой пробе с 1 мкл (35 нг) ДНК добавляют 3 мкл 100 ммоль буферного раствора HEPES с pH 7,9, содержащего 1 моль хлористого натрия, и пробы смешивают с возрастающими количествами (10-1000 нг) конъюгатов трансферина и поликатиона в II мкл водного раствора, что дает конечную концентрацию хлористого натрия 200 ммоль. Электрофорез на 1%-ном агарозном геле с применением буфера 1 х ТАЕ осуществляют при 50 В (45 мА) в течение 2,5 ч, гель сушат с последующей авторадиографией в течение 2 ч при -80oC с применением пленки ХАР.
Пример 6. Перенос конъюгатов трансферина и полилизина в живые клетки. Для подтверждения того, что конъюгаты трансферина и полилизина по примеру 1 эффективно вносятся в живые эритробласты, применяют FITC-меченые конъюгаты. Известно, что FITC-меченый трансферин после нескольких часов инкубации с эритробластами, которые предварительно были лишены трансферина, обнаруживается в пузырьках внутри клетки (исследование с флуоресцирующим микроскопом).
В настоящем примере эритробласты (трансферированные ретровирусом рецептора эпидермального фактора роста (далее: EFG)) инкубируют 18 ч в не содержащей трансферина среде для дифференцирования по Ценке и др.(Cell 52, 1988, с. 107-119 ) при 37oC (концентрация клеток 1,5·106/мл). После добавки различных конъюгатов трансферина и полилизина (или как контроль соответствующего количества бидистиллированной воды) клетки инкубируют при 37oC в присутствии 10 нг/мл EFG (чтобы поддерживать трансформированное состояние). После 24 и 48 ч отбирают около 5·105 клеток, промывают 1 раз в содержащем фосфатный буфер физиологическом растворе хлористого натрия (далее: раствор PBS, pH 7,2), фиксируют 50-кратным объемом смеси 3,7% формальдегида и 0,02% глутарового альдегида в растворе PBS при температуре 40oC в течение 10 м, промывают 1 раз раствором PBS, вводят в элванол (искусственная смола на основе поливинилового спирта) и исследуют в флуоресцирующем микроскопе. Одновременно в других аликвотах различных исходных смесей определяют скорость роста клеток. Для этого отбирают 100 мкл клеточной суспензии и определяют вставку 3H-тимидина (8 мкКюри/мл, 2 ч). При этом обнаруживают, что инкубированные вместе с конъюгатом трансферина и полилизина эритробласты через 24 ч имеют флюоресцирующие пузырьки, которые нельзя обнаружить в контрольных пробах. Табл. 1 показывает, что за исключением фракции 6 все конъюгаты поглощены практически всеми клетками.
Сделали снимки флюоресценции куриных эритробластов, которые были инкубированы 24 ч без конъюгатов или с FITS-мечеными конъюгатами трансферина и полилизина. При возбуждении синим светом можно отчетливо различить несколько флюоресцентных пузырьков в каждой клетке. Специфичность этой флюоресценции доказывается тем, что флюоресценция пузырьков при возбуждении зеленым светом не появлялась (см. фиг. 5).
Тот факт, что клетки во всех пробах растут одинаково быстро (как измерено вставкой тритированного темидина (далее: 3H TdR; см. табл. 1), доказывает, что клетки не повреждаются конструктами и тем самым исключено неспецифическое поглощение (например, через ставшие проницаемыми оболочки клеток).
Пример 7. Опыты направлены на подтверждение того, что предлагаемые конъюгаты трансферина и полилизина используются клеткой как нативный трансферин, т. е. нормальный цикл трансферина проходит с подобной эффективностью. В качестве тест-системы для этого особенно пригодны эритробласты, которые "отключением" трансформирующего онкогена можно индуцировать для созревания в нормальные эритроциты. Из литературы вытекает, что такие клетки для нормального созревания требуют высоких концентраций комплекса трансферина и железа (100-200 мкг/мл, концентрации в 3 раза меньше препятствует созреванию клеток и приводят через несколько дней к отмиранию клеток (см. Ковенц и др. 1986, Mod. Trends in Human Leukemia VII, издательство Шпрингер, DE, c. 199-209). Кроме того известно (см. Шмидт и др. Cell 46, c. 41-51, 1986), что "рециркуляция", т.е. повторное применение рецепторов трансферина и тем самым протекающий с оптимальной скоростью цикл трансферина необходим для нормального в пробирке дифференцирования.
Эритробласты (трансформированные ретровирусом рецептора EGF) индуцируют для дифференцирования лишением EGF и добавкой оптимального количества частично очищенного куриного эритропойэтина (не содержащего трансферина: (далее: EPO). Инкубацию осуществляют при концентрации клеток 1·106/мл в не содержащей трансферина среде для дифференцирования при 42oC и 5% CO2. В начале инкубации добавляют или комплекс нативного трансферина и железа (100 мкг/мл), или насыщенные железом конъюгаты трансферина и полилизина(концентрация также 100 мгк/мл). Рост и состояние созревания клеток анализируют через 24 и 48 ч следующим образом:
1. определение числа клеток.
2. определение распределения размеров клеток и
3. фотометрическое измерение содержания гемоглобина в клетках.
Кроме того, аликвоты исследуемых смесей центрифугируют через 72 ч в цитоцентрифуге на предметном стекле и подвергают гистохимическому определению гемоглобина (окрашивание нейтральным бензидином и ускоренное окрашивание для клеток крови по Бойч и др. Cell 23,1982, с. 907-919).
Результаты табл. 2 ясно показывают, что клетки, которые в присутствии фракции 1-5 конъюгатов полилизина и трансферина индуцируются для дифференцирования так же эффективно и с одинаковой скоростью созревают, что и клетки, которые инкубируют вместе с комплексом нативного трансферина и железа. В противоположность этому клетки в несодержащих трансферина контрольных пробах показывают сильно замедленный рост и накапливают только небольшие количества гемоглобина. Исследование клеточного фенотипа с применением окрашенных цитоспиновых препаратов показывает, что инкубированные вместе с конъюгатами полилизина и трансферина клетки точно также созревают до поздних ретикулоцитов, как и клетки, обработанные нативным трансферином, в то время как инкубированные без трансферина клетки представляют смесь дезинтегрированных и незрелых, похожих на эритробласты клеток.
Только обработанные фракцией 6 конъюгата трансферина и полилизина показывают меньшее содержание гемоглобина и больший процент незрелых клеток (табл. 2). Это показывает, что конъюгированная с особенно большим количеством полилизина фракции 6 менее хорошо функционирует в цикле трансферина. Одновременно этот результат указывает и на чувствительность данного опыта.
Пример 8. Подобным образом, как в примере 7, различные конъюгаты трансферина и полилизина и трансферина и протамина исследуют на способность к функциональной замене комплекса нативного трансферина и железа при созревании куриных эритробластов до эритроцитов.
Уже было показано, что терминально дифференцирующие куриные эритробласты требуют оптимально функционирующего цикла трансферина: т.е. без трансферина или при торможении "рециркуляции" рецептора трансферина клетки отмирают. Так как обычно применяемый частично очищенный EPO содержит еще трансферин, его заменяют несодержащим трансферина, частично очищенным эритроидным фактором роста (далее: фактор REV), чтобы сделать возможным эритроидное дифференцирование. В качестве целевых клеток размножают эритробласты, трансформированные ретровирусом, содержащим рецептор человеческого EGF вместе с термочувствительным онкогеном V-tyb, причем процесс проводят в среде CFN-E в присутствии 20 нг/мл EGF. Эти клетки стимулируются EGF к ненормальному размножению, лишение EGF при одновременной добавке фактора REV способствует тому, что клетки вступают в нормальное дифференцирование. После двукратной промывки в не- содержащей трансферина среде клетки высевают в не- содержащую трансферин среду и добавляют различные количества насыщенного железом трансферина или конъюгатов трансферина и поликатиона (перед или после их комплексообразования с плазмидной ДНК). Через 1,2 и 3 дня инкубации при 42oC устанавливают состояние дифференцирования клеток цитоцентрифугированием и гистохимическим окрашиванием или количественным определением гемоглобина.
Результаты этих опытов представлены на фиг. 6 и в табл. 3, соответственно.
Клетки (1·106 /мл) в не содержащей кональбумина среде для дифференцирования по Ценке, дополненной 1 мкг/мл инсулина и фактором REV, при оптимальной концентрации (разбавление 1:5.000) вносят в чашки диаметром 14 мм. При этом первая проба (треугольники) не имеет добавок, вторая проба (круги ) содержит 100 мкг/мл насыщенного железом кональбумина, а третья проба (четырехугольники) содержит 100 мкг/мл насыщенных железом конъюгатов TfpL 270. После инкубации в течение 24 и 48 ч измеряют фотометром содержание гемоглобина в аливкотах объемом 100 мкл. Заштрихованная область указывает содержание гемоглобина в выращенных в отсутствии трансферина клетках (средняя величина из 4 опытов: фиг. 6А).
Чтобы анализировать эритроидное дифференцирование как функцию концентрации трансферина или концентрации конъюгата трансферина и полилизина, клетки вносят в описанную среду, содержащую указанные количества насыщенного железом кональбумина (открытые круги), конъюгата TfpL 90 (открытие четырехугольники) или конъюгата TfpL 270 (закрытые четырехугольники), и через 2 дня определяют фотометром содержание гемоглобина (фиг. 6 В).
За эритроидным дифференцированием следят с помощью фотометрического определения гемоглобина (ср. фиг. 6), определения числа клеток или цитоцентрифугирования и последующего нейтрального окрашивания бензидином (для определения гемоглобина) и гистологическими красителями (см. табл. 3).
Конечные концентрации трансферина и конъюгатов составляют в опыте 1 60 мкг/мл: в опытах 2 и 3-100 мкг/мл. Концентрация ДНК в опыте 2 составляет 10 мкг/мл. Число дезинтегрированных клеток, зрелых клеток ( LR: поздние ретикулоциты: E: эритроциты) и незрелых клеток( Ebl) определяют по методам, описанным Бойгом и Шмидтом в вышеуказанных литературных источниках. Полученные результаты показывают, что два различных конъюгата трансферина и полилизина (TfpL 90 или TfpL 270), как и конъюгат трансферина и протамина способны к функциональной замене нативного трансферина, за счет того, что они гарантируют быстрый перенос железа в дифференцирующие красные клетки, причем их удельная активность в 1,5-2 раза ниже (см. фиг.6). Комплексообразование ДНК с конъюгатами трансферина и полилизина 270 и трансферина и протамина не изменяет существенно биологическую активность конъюгатов. В контрольном эксперименте устанавливают, что при добавке полилизина или протамина, смешанного с соответствующим количеством цитрата железа вместо указанных конъюгатов, клетки не могут дифференцировать и отмирают подобно клеткам в сравнительных пробах, которые инкубируют без трансферина.
В целом опыты по примерам 7, 8 показывают, что оба вида конъюгатов поликатиона и трансферина переносят железо лишь незначительно менее эффективно, чем нативный трансферин.
Пример 9. Конъюгаты полилизина и трансферина содействуют поглощению ДНК в куриных эритробластах. В настоящем примере исследуют вопрос о том, может ли ДНК размером, соответствующим размеру рибоцимов тДНК (см. фиг.7), эффективно вноситься внутрь клетки конъюгатом трансферина и полилизина. В настоящем примере применяют тДНК со вставкой последовательности
CGTTAACAAGCTAACGTTGAGGGGCATGATATCGGGCC
CCGGGCAATTGTTCGATTGCAACTCCCCGTACTATAGC
имеющую мол.м. около 300.000 и 32Р АТР концевую маркировку. Приблизительно 0,3 мкг этой ДНК, растворенной в 20 мкл буфера ТЕ, смешивают или с 10 мкг нативного трансферина, растворенного в 50 мкл бидистиллированной воды, содержащей 400 мкг/мл сывороточного альбумина крупного рогатого скота, или с 10 мкг фракции 3 конъюгата трансферина и полилизина, растворенной в 50 мкл бидистиллированной воды, содержащей 400 мкг/мл сывороточного альбумина крупного рогатого скота, или с 50 мкл указанного растворителя без трансферина. Полученные смеси добавляют к 2 мл не- содержащей трансферина среде для дифференцирования, к которой добавляют 4·106 куриных эритробластов, трансформированных ретровирусом рецептора EGF и предварительно инкубированных в не содержащей трансферина среде в присутствии EGF, после чего смеси инкубируют 8 ч при 37oC и 5% CO2. После этого клетки центрифугируют, отбирают надосадочную жидкость и промывают клетки 3 раза в не содержащей трансферина среде. Клеточный осадок и питательную среду поглощают в среде, содержащей 1% SDS, 1мг/мл протеиназы K, 300 ммоль хлористого натрия, 20 ммоль трис с pH 8,0, 10 ммоль ЭДТУК (далее: буфер PK/SDS), инкубируют 30 мин при 37oC, экстрагируют смесью фенола и хлороформа и выделяют ДНК путем осаждения этанолом. Выделенную ДНК с радиоактивностью всего 2000 cpm разделяют на неденатурирующем 3,5%-ном акриламидном геле (с применением буфера ТВЕ) и ДНК доказывают авторадиографией. При этом обнаруживают, что в обработанной конъюгатом трансферина и полилизина клеточной пробе поглощено клетками приблизительно в 5-10 раз больше ДНК, чем в контрольных пробах с нативным трансферином.
Пример 10. Конъюгаты полилизина и трансферина содействуют поглощению и экспрессии плазмидной ДНК в куриных эритробластах. В этих опытах применяют плазмидную ДНК, содержащую ген люциферазы Photinus pyralis в качестве гена-репортера, чтобы исследовать перенос гена и экспрессию. Для этого плазмидную ДНК pRSVlus, получаемую традиционным лизисным методом с применением тритона Х с последующим градиентным центрифугированием, осуществляемым с применением хлористого цезия и бромистого этидия, обесцвечиванием бутанолом-1 и диализом относительно 10 ммоль буфера трис/HCl с pH 7,5, содержащего 1 ммоль ЭДТУК. Для комплексообразования по 10 мкг конъюгата трансферина и полилизина (далее: конъюгат TfpL) или конъюгата трансферина и протамина (далее: конъюгат Tprot) медленно добавляют при осторожном перемешивании к 3 мкг плазмидной ДНК pRSVlusc в 250 мкл 0,3-молярного хлористого натрия. (Было установлено, что при сохранении этих условий можно применять до 100 мкг конъюгата трансферина и поликатиона и 30 мкг плазмидной ДНК в конечном объеме 500 мл, без осаждения комплексов конъюгата с ДНК). После 30 мин при комнатной температуре комплексы добавляют к 5-10·106 клеток HD 3 (0,5-1·106 клеток на 1 мл, среда ЕВМ + Н, 37oC, 5% CO2) и инкубируют в течение 16-48 ч (в качестве клеточной линии применяют трансформированную ts-v-erb В клеточную линию HD3 куриных эритробластов). Клетки собирают (5 мин при 1500·g, 4oC) дважды промывают фосфатным буферным солевым раствором (далее: буфер PBS) и поглощают в 100 мкл 0,25-молярного трис/HCl с pH 7,5. Клеточные экстракты получают 3 циклами замораживания и оттаивания с последующим высокоскоростным центрифугированием (15 мин, 18.000·g, 4oC). Аликоты таких клеточных экстрактов люминесценцией исследуют на наличие активности люциферазы.
Было установлено, что присутствие комплекса конъюгата трансферина и поликатиона с ДНК в питательной среде не оказывает вредного влияния на рост клеток и на размножение клеток. Как видно из фиг. 8, достигают максимальной активности люциферазы, если применяют 3 мкг ДНК /10 мкг TfpL и 0,3-1 мкг ДНК /10мкг Tprot. Предполагая, что все образованные комплексы конъюгатов с ДНК являются идентичными, это соответствует молярному соотношению 25 или 75 молекул конъюгата на молекулу плазмидной ДНК. Отсюда можно заключить, что ДНК в комплексе целиком связана с молекулами конъюгата, а именно при соотношении конъюгата и ДНК, которое очевидно обеспечивает электронейтральность (в пересчете на положительные заряды в поликатионе, требуемые для нейтрализации отрицательных зарядов фосфатных групп в ДНК). Это предположение совпадает с тем наблюдением, что по сравнению с конъюгатом трансферина и полилизина требуется в три раза больше менее сильно положительно заряженного конъюгата трансферина и протамина для оптимального комплексообразования и переноса гена. Это предположение совпадает также с полученным в примере 5 результатом для соотношения конъюгата и ДНК, которые требуется для эффективного комплексообразования.
При применении оптимированного таким путем соотношения конъюгата TfpL и ДНК для комплексообразования определяют чувствительность этой системы переноса гена. Результат этих опытов показан на фиг. 9: менее чем 1 нг кодирующей люциферазу плазмидной ДНК еще показывает обнаруживаемый сигнал. Применение более, чем 2 мкг плазмидной ДНК в виде комплекса с 6 мкг TfpL или 20 мкг Tprot не приводят к дальнейшему росту активности люциферазы по всей вероятности ввиду насыщения системы. Далее установлено, что для комплексообразования не требуется особой концентрации соли или ионов, так как комплексы TfpL и ДНК, которые образуются при различных концентрациях соли ( 0, 20, 50, 100, 200 ммоль NaCl) в экспериментах одинаково эффективны (фиг. 8,9: круги= комплекс конъюгата Tprot ДНК, а четырехугольник= комплекс конъюгата TfpL и ДНК. Показано, что прием клетками комплексов конъюгата трансферина и поликатиона с ДНК протекает через рецептор трансферина. Сначала, как показано на фиг. 10 А, установлено, что достигаемая комплексами конъюгата TfpL и ДНК активность люциферазы по меньшей мере в 100 раз выше, чем активность, которую измеряют для комплексов полилизина и ДНК. Сравнительный опыт показал, что одна смесь полилизина и трансферина не облегчает поглощение клеткой плазмидной ДНК. В дальнейшем опыте к постоянному количеству комплекса конъюгата TfpL и ДНК добавляют избыток нативного трансферина. Фиг. 10 В показывает, что содержащийся в среде свободный трансферин эффективно конкурирует с конъюгатом TfpL, обеспечивающим перенос ДНК в клетку, о чем свидетельствует снижение активности люциферазы. Отсюда можно заключить, что поглощение клеткой комплекса конъюгата TfpL с ДНК происходит через рецептор трансферина.
Пример 11. В предварительных опытах на основании трансфекции куриных фибробластов посредством erbB ДНК ES установлено, что рибоцим т-ДНК ES экспримируется в куриных клетках.
При помощи этого примера можно показать, что рибоцимы с т-ДНК, которые направлены против erbB онкогена, могут вносится в трансформированные erbB куриные эритробласты и ослаблять трансформирующее действие онкогена.
Конструируют (ср. фиг. 7, II) два рибоцимных гена с т-РНК, направленных против трансляционной инициирующей области erbB. Около 100 мкг каждой, содержащей ген плазмиды, переваривают EcoRI, чтобы высвободить рибоцимный ген с т-РНК на фрагменте длиной 325 п.о. Продукты переваривания маркируют на концах фрагментом Кленова и очищают при помощи электрофореза на 2%-ном агарозном геле с применением буфера ТВЕ. Векторный фрагмент и фрагменты рибоцимного гена с т-РНК локализуют окрашиванием бромидом этидия, вырезывают и выделяют электроэлюацией, экстракцией смесью фенола и хлороформа и хлороформом и осаждением этанолом. При использовании предлагаемого конъюгата трансферина и полилизина очищенные радиоактивно маркированные фрагменты ДНК применяют для определения поглощения и торможения erb B-РНК. В качестве контрольной ДНК применяют вектор pSPT 18.
В качестве тест-клеточной системы выбирают клеточную линию куриных эритробластов, трансформированную термочувствительным мутантом (ts 34) вируса AEV эритробластоза птиц. Так же экспримируемый в этих клетках erb A онкоген можно тормозить специфическим ингибитором протеинкиназы (ингибитор H7). Установлено, что v-erb A онкоген в живом организме и в пробирке (т.е. как бактериально экспримированный протеин) в двух местах, а именно Ser-28 и Ser-29, фосфорилируется протеинкиназой С или зависящей от сАМР протеинкиназой. Мутация этих серинов до аланинов препятствует фосфорилированию и снимает активность V-erb A онкогена. H7 представляет специфический ингибитор этих обеих киназ, который в содержащих v-егЬ A и v-еrb Б эритробластах может избирательно снимать вызываемые v-erb A изменения (например, блокаду дифференцирования).
Известно, что эритробласты, erb B-онкоген которых инактивируют, например, повышением температуры в случае термочувствительного erb B-мутанта, индуцируются для созревания до эритроцитов.
Одним из первых признаков для этого процесса является индукция синтеза гемоглобина, который можно доказать чувствительным анализом (кислое окрашивание бензидином) на уровне индивидуальной клетки. Как фенотипное действие направленного против erb В рибоцима в этой тест-системе можно было бы следовательно ожидать специфического повышения числа бензидин-положительных клеток.
Лежащую в основе этого примера серию опытов проводят следующим образом: различные препараты ДНК (см. выше и табл. 4), растворенные в 30 мкл буфера ТЕ, смешивают соответственно с 10 мкг комплекса нативного трансферина и железа и конъюгата трансферина и полилизина (растворенного в бидистиллированной воде) и инкубируют 30 мин при 37oC.
В случае векторной ДНК (10 мкг) применяют соответственно больше (100 мкг) препаратов трансферина. Исходные смеси добавляют к 1 мл не содержащей трансферина среды для дифференцирования по Ценке. Тест-клетки (3·106 в каждом опыте) инкубируют перед опытом 60 мин в не содержащей трансферина среде для дифференцирования при 42oC (этот прием позволяет улучшать поглощение трансферина) и добавляют к содержащим ДНК и трансферин исходным смесям. Через 6, 18 и 68 ч (обработку клеток см. ниже) отбирают пробы, которые описанным выше образом разделяют на надосадочную жидкость и клеточный осадок, поглощают в буфере PK/SDS и анализируют ДНК.
Фиг. 12 показывает, что аналогично примеру 8 в обработанной конъюгатом трансферина и полилизина пробе клетками поглощается приблизительно в 5-10 раз больше ДНК, чем в контрольных пробах с нативным трансферином.
След m: маркер молекулярной массы: ДНК pBP 322, расщепленная Hpall и с применением фрагмента Кленова ДНК полимеразы радиоактивно маркированная альфа-32P-CTP.
След 1: фрагмент ES13 с 2000 импульсами в минуту. След 2: клетки, обработанные комплексом трансферина и ES13. След 3: клетки, обработанные комплексом конъюгата трансферина и полилизина с ES13.
После окончания инкубации (6 ч) клетки центрифугируют и инкубируют еще 2 ч в содержащей трансферин среде для дифференцирования содержащей эритропоиетин и инсулин (2 мл на исходную смесь и при 37oC т. е. в присутствии активного v-erb В протеина).
Получают следующие результаты.
1. Подобно примеру 8 можно наблюдать усиленное поглощение ДНК в размере ДНК ES в обработанных трансферином и полилизином клеточных пробах (приблизительно в 5 раз).
2. Табл. 4 показывает, что во всех случаях, в которых ДНК ES вносят в erb В трансформированные эритробласты с помощью конъюгата полилизина и трансферина, процент бензидин-положительных клеток значительно повышен, приблизительно в 2 раза, (в качестве эталона служат пробы, которые обработаны векторной ДНК и в которых применение конъюгатов полилизина и трансферина, как и следовало ожидать, не приводит к повышению числа 6 бензидин-положительных клеток )
Пример 12. Эффективное связывание и интернализация комплексов конъюгата трансферина и полилизина с ДНК в гематопойетических куриных клетках. Связывание конъюгата TfpL и комплекса конъюгата TfpL с ДНК рецепторами на поверхности клеток измеряют при помощи меченных тритием веществ по методу, описанному Штейном и др. 1984, J.Biol. Chem. 259, 14762-14772. 3H-меченый конъюгат TfpL получают конъюгацией меченого полилизина с трансферином по описанному в примере 1 методу. Маркировку полилизина 90 осуществляют обработкой формальдегидом и 3H-меченым бораном натрия.
Результат этих опытов представлен на фиг. 13. Меченый конъюгат TfpL 90(четырехугольник) или меченый, конъюгат TfpL 90 в виде комплекса с ДНК PB-SK-, получаемого при помощи лизиса с применением тритона X, центрифугирования в равновесных условиях при соблюдении градиента плотности, применяя хлористый цезий и бромид этидия, обесцвечивания 1-бутанолом и диализа относительно 10 ммоль буфера трис/HCl с pH 7,5, содержащего ЭДТУК, (треугольник) исследуют на их специфическое связывание с рецептором трансферина клеток HD 3. Для этого добавляют конъюгаты или комплексы (0,1-100 нмоль) к клеткам HD3 (1·106/мл в среде MEM (= Eagle's Minimum Medium), содержащей I альбумина сыворотки крупного рогатого скота, и инкубируют 3 ч. Фиг. 13 показывает, что как конъюгаты, так и комплексы связываются с клетками HD 3 таким образом, что происходит насыщение. Вычисленные из этих данных мнимые константы связывания составляют 22 нМ для конъюгата TfpL и 43 нМ для комплекса конъюгата TfpL с ДНК. Хотя немного выше, эти величины относительно хорошо совпадают с величинами для нативного трансферина (15 нмоль).
Для определения поглощения комплекса конъюгата TfpL с ДНК во внутриклеточных пузырьках сначала инкубируют клетки HD 3 в не содержащей трансферина среде для дифференцирования при 37oC в течение 18 ч. После добавки меченого FITC трансферина или конъюгатов TfpL (меченых FITC на полилизине, образующих в некоторых экспериментах комплексы с ДНК) инкубируют клетки еще 18 ч. Клетки цитоцентрифугируют, обрабатывают смесью 3,7%-ного формальдегида и 0,02% -ного глутарового альдегида, промывают буфером PBS, подают в мовиол 4,88 (поливиниловый спирт) и исследуют в флюоресцентном микроскопе. В качестве контроля применяют меченое FITC антитело козы-антимыши (0,1 мг/мл) (ср. пример 6). Для количественного определения FITC -Tf, FITC-TfpL и FITC-TfpL/ ДНК клетки в течение 6 ч инкубируют вместе с соответствующим препаратом ( Tf: 40 мкг/мл, конъюгат TfpL 270; 50 мкг/мл; комплекс конъюгата TfpL 270 с ДНК pB-SK-, получаемый при помощи лизиса с применением тритона X, центрифугирования в равновесных условиях при соблюдении градиента плотности, применяя хлористый цезий и бромид этидия, обесцвечивания 1-бутанолом и диализа относительно 10 ммоль буфера трис /HCl с pH 7,5, содержащего 1 ммоль ЭДТУК в 50 мг/мл или 16 мг/мл буфера связывания, промывают 3 раза холодным буфером PBS, содержащим альбумин сыворотки крупного рогатого скота, и подвергают количественному анализу аминокислотных последовательностей с помощью прибора Бектона/Дикинсона. Фиг. 14 показывает, что как с TfpL, так и с TfpL-ДНК все клетки имеют более чем в 10 раз повышенную относительную флюоресценцию, что указывает на то, что конъюгаты или комплексы поглощаются более чем 95% клеток (Tf TfpL:TfpL/ДНК. буфер связывания: -)
Пример 13. Экспрессия ДНК, которая вносится в клетку при помощи конъюгата TfpL.
В предшествующих примерах доказано, что перенос гена посредством конъюгата TfpL отрицательно не влияет на рост клеток. В данном же примере исследуют действие комплексов конъюгата TfpL с ДНК, которыми продолжительное время обрабатывают клетки (в качестве ДНК применяют плазмидную ДНК, содержащую ген люциферазы; см. пример 10). В этом опыте одинаковую концентрацию клеток HD 3 инкубируют 1-4 дня с ежедневным дополнением комплекса конъюгата TfpL с ДНК или без ежедневного дополнения.
В различные промежутки времени аликвоты исследуют на активность люциферазы описанным в примере 10 образом. В культурах с повторной добавкой комплексов измеряют относительно высокую величину экспрессии гена люциферазы ( от 100.000 до 200.000 световых единиц/10 клеток), которая в течение всего периода исследования, где не наблюдают никаких цитотоксических действии, остается в основном постоянной. Если клетки только один раз нагружают комплексами, то активность люциферазы между 2-м и 4-м днем снижается в 10-20 раз. Эти результаты показывают, что несмотря на очевидно проходящую экспрессию гена люциферазы, вносимого в клетку с помощью предлагаемых конъюгатов, повторной добавкой можно сохранять постоянно высокую экспрессию вводимого гена.
Пример 14. Для определения количества клеток, которые действительно экспримируют плазмидную ДНК, вводимую инфекцией трансферином, клетки HD3 инкубируют вместе с комплексами конъюгата TfpL с ДНК описанным в предыдущих примерах образом. В качестве ДНК применяют плазмидную ДНК pRSV- b Gal (_). Экспрессию этого гена-репортера исследуют затем в отдельных клетках при помощи анализа аминокислотной последовательности согласно Нолану и др. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1986, 2603-2607.
В качестве контроля применяют комплекс конъюгата TfpL ДНК pB-SK- (.).
Для этого флюоресцирующее вещество, флуоресцеин-ди-b-d-галактопиранозид (далее:FDG), вводят посредством осмотического шока и исследуют распределение клеток, которые содержат флуоресцеин, который в результате энзиматической активности высвобождается из FDG. Равномерное распределение содержащих флуоресцеин клеток допускает вывод о том, что большое количество клеток экспримирует ген-репортер b GAl. Результат этих опытов показан на фиг. 15.
При стимулировании индуцированного в пробирке созревания эритробластов конъюгат полилизина и трансферина может функционально заменять нормальный трансферин.
Формула изобретения: Способ переноса нуклеиновой кислоты в клетки животных, предусматривающий получение конъюгата модифицированного поликатиона с гликопротеином, а затем объединение полученного конъюгата с переносимой нуклеиновой кислотой, отличающийся тем, что в качестве гликопротеина используют трансферрин, а в качестве поликатиона используют полилизин или гистон при соотношении гликопротеина к поликатиону 1,0 5,5 1.