Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА - Патент РФ 2098822
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической микробиологии. Изобретение позволяет выявить в 98 % случаев микробактерии группы туберкулеза. Способ заключается в следующем: для выявления микробактерий в клиническом материале с помощью полимеразноцепной реакции использовали две амплификационные тест-системы. Осуществляли способ с помощью оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси. Отжиг праймеров осуществляли при температуре 65oC.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2098822
Класс(ы) патента: G01N33/50, C12N15/00
Номер заявки: 94025792/14
Дата подачи заявки: 12.07.1994
Дата публикации: 10.12.1997
Заявитель(и): Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН
Автор(ы): Гинзбург А.Л.; Хоменко А.Г.; Голышевская В.И.; Шагинян И.А.; Нестеренко Л.Н.; Гришина Т.Д.
Патентообладатель(и): Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН
Описание изобретения: Изобретение относится к медицине, в частности в клинической микробиологии.
Существует способ диагностики туберкулеза, в основу которого положен принцип полимеразной цепной реакции. В литературе имеются сведения о тест-системах, основанных на амплификации уникальных инсерционных элементов ДНК микобактерий и их фрагментов (A. H.Kolk et.al, 1990; O.Wit et al. 1992). Однако эти системы имеют ряд недостатков. Прежде всего при рекомендуемой температуре отжига праймеров (55oC) наблюдается большое количество неспецифических реакций амплификации с ДНК различных видов микроорганизмов. Кроме того, тест-системы не обеспечивают дифференциацию M. tuberculosis и микобактерий группы M. bovis, в том числе M. bovis BCG.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: для выявления микобактерий в клиническом материале с помощью полимеразно-цепной реакции использовали две амплификационные тест-системы. Основу первой составляют праймеры
TUBA; 5' CGTCCTGACGGTAATGGGGT-3'
TUBO; 5' CGCCCATCCACATCCCGCCC-3'
Основу второй INS-I и INS-II.
INS-I 5'-GGTGGGAGGGAGGGCATCGAGGTGGC-3'
INS-II 5'-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3'
Праймеры синтезированы на генном синтезаторе "Gene Assembler" (Pharmacia-αKβ).
Для осуществления способа предлагаются оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси:
общий объем 25 мкл
67 мМ Трис HCI pH 8,6
16,6 мМ (NH4)2SO4
10 мМ b-меркаптоэтанол
6,7 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)
5 мМ MgCl2 (для TUBA и TUBO)
или 2,5 мМ MgCl2 (для INSI и INSII),
0,17 мг бычьего сывороточного альбумина фракции У (ВСА) 125 мкл каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата (альфа-ATP, альфа-CTP, альфа-TTP, альфа-GTP).
10 пмоль праймеров
2 ед. Tag полимеразу (Биотех, Россия).
Отжиг праймеров осуществляли при 65oC. При этой температуре исчезают неспецифические реакции амплификации с ДНК наиболее распространенных возбудителей легочных заболеваний и ДНК человека. Наблюдается амплификация только с ДНК M. tuberculosis и M. bovis (при использовании системы с TUB-праймерами) и ДНК M. tuberculosis (при использовании системы с INS-праймерами).
Использование отжига праймеров при температуре 65oC и предлагаемой концентрации компонентов реакционной смеси позволяет выявить в 98 случаев микобактерии группы туберкулеза.
Время проведения анализа с момента поступления диагностического материала составляет 48 ч.
Пример 1. Клинический материал мокроту, выделенную от больного К. с подозрением на туберкулез, исследовали с помощью метода полимеразной цепной реакции и методом микроскопии и посева. Для этого мокроту обработали 0,1 раствором NaPO4 в течение 24 ч при 37oC. После центрифугирования часть осадка использовали для приготовления мазков и посева на плотную питательную среду Финна-II, а 0,5 мл осадка использовали для постановки полимеразной цепной реакции.
Обработку диагностического материала для лизиса клеток и выделения ДНК производили по известной методике (см. кн. Маниатис и Фрич, М. 1986), после выделения ДНК к 10 мкл пробы добавляли компоненты реакционной смеси с праймерами TUBA и TUBD.
Предплавление проводили при 65oC. Амплификацию осуществляли на амплификаторе Биоком-сервис по стандартной методике.
Выявление продуктов реакции проводили электрофорезом в 1,5 агарозном геле с трис-ацетатным буфером, в качестве красителя использовали бромфеноловый синий. При просмотре геля под ультрафиолетовой лампой отмечены четкие полосы амплифицируемой ДНК M. tuberculosis из пробы исследуемого больного. Результат о наличии микобактерий туберкулеза получен через 48 ч, а рост культуры микобактерий на плотной среде получен через 3 месяца.
Таким образом, у данного больного подтвержден клинический диагноз туберкулеза.
Пример 2. Пунктат холодного абсцесса плеча больного А. 7 лет с подозрением на поствакцинальное осложнение после БЦЖ-вакцинации исследовали методом ПЦР. Лизис клеток и выделения ДНК осуществляли по стандартным методикам.
В полимеразной цепной реакции использовали праймеры INSI и INSII; TUBA и TUBO.
К 5 мкл пробы после выделения ДНК добавляли ингредиенты реакционной смеси. Температура обжига праймеров была 65oC. На электрофорезе продуктов ПЦР выявлена полоса амплифицируемого фрагмента ДНК при использовании TUB-праймеров и отсутствие ее при амплификации с INS-праймерами.
Таким образом, доказано поствакцинальное осложнение M. bars BCG.
Предлагаемый способ диагностики туберкулеза позволяет в короткие сроки (48 ч) произвести выявление и дифференциацию возбудителя туберкулеза в диагностическом материале и установить диагноз туберкулез.
Формула изобретения: Способ диагностики туберкулеза путем проведения полимеразно-цепной реакции на клиническом биологическом материале с последующим электрофоретическим выявлением инсерционных элементов ДНК микобактерий и их ферментов с помощью амплификационных тест-систем, отличающийся тем, что используют две амплификационные тест-системы на основе праймеров ТUВ А. ТUВ D и INS-I, INS-II, отжиг праймеров ведут при t 65oС и при выявлении электрофоретической полосы амплифицируемого фрагмента ДНК только при исследовании ТUВ-праймера диагностируют туберкулез.