Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СРЕДСТВО ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ АКТИВИРОВАННЫХ АНТИГЕНОМ ИЛИ МИТОГЕНОМ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ
СРЕДСТВО ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ АКТИВИРОВАННЫХ АНТИГЕНОМ ИЛИ МИТОГЕНОМ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ

СРЕДСТВО ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ АКТИВИРОВАННЫХ АНТИГЕНОМ ИЛИ МИТОГЕНОМ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: медицина, в частности иммунология. Сущность изобретения: 2-метил-1-октадецилглицеро-(3)-фосфохолин используют для избирательного удаления из популяции лимфоцитов млекопитающих активированных антигеном или митогеном T- и B- лимфоцитов. Средство позволяет удалять специфически активированные лимфоциты, не причиняя вреда находящимся в состоянии покоя лимфоцитам, стимулированным антигенами и митогенами. 5 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2100025
Класс(ы) патента: A61K31/685
Номер заявки: 5052304/14
Дата подачи заявки: 11.06.1992
Дата публикации: 27.12.1997
Заявитель(и): Медмарк Фарма ГмбХ (DE)
Автор(ы): Эберхард Векер[DE]; Аннелизе Шимпль[DE]; Раббе Нордштрем[DE]
Патентообладатель(и): Медмарк Фарма ГмбХ (DE)
Описание изобретения: Важными элементами иммунной системы у млекопитающих являются T- и B-лимфоциты. Во время своего развития последние образуют специфические рецепторы для антигенов, так что каждый такой лимфоцит для оставшейся части своей жизни приобретает специфичность для единственного антигена. Находящиеся в состоянии покоя лимфоциты (маленькие лимфоциты), включая клетки памяти, циркулируют через ткани тела и лимфоорганы, а также через жидкости организма и поэтому контролируют организм относительно появления их антигенов. Как только появляется специфический антиген, происходит индуцированная антигеном пролиферация лимфоцитов с образованием активированных больших лимфоцитов. Эту пролиферацию можно осуществить также в пробирке культивированием лимфоидных клеток со специальными антигенами. При помощи такой же системы можно показать также, что митогенные лектины (следовательно, протеины), которые связывают и сшивают специфические детерминанты поверхностей клеток, состоящие из углеводов, стимулируют также лимфоидные клетки. Наконец, активирование лимфоцитов или антигенами или митогенами приводит к созреванию лимфоцитов до лимфобластов. Экспериментально митогенное стимулирование лимфоцитов можно называть, например, фитогемагглютинином (РНА) и конкавалином А (Con A) в случае T-клеток, как человеческого, так и животного происхождения, липополисахаридами (LPS) в случае B-клеток.
В связи с этим первичный иммунный ответ является результатом стимулирования специфических соответственно для антигена или митогена лимфоцитов, так что последние из состояния покоя переходят в активированное состояние, становятся большими лимфоцитами, которые пролиферируют и дифференцируются на клетки эффективного органа (например, T-клетки с дитотоксическими или другими функциями или образующие антитела плазматические клетки, которые образуются из зрелых B-клеток) или клетки памяти. Активированием находящихся в состоянии покоя клеток памяти вызывают в этом случае второй иммунный ответ, который снова вызывает клетки эффективного органа и клетки памяти.
Благодаря первичному или вторичному иммунному ответу появляются как желательные, так и нежелательные последствия. К нежелательным в большинстве случаев последствиям относятся, например, отторжения трансплантата, аллергические реакции и т.п. Вообще их можно назвать как приобретенные, вызванные внешними антигенами иммунологические заболевания или симптомы.
Если бы удалось избирательно выделять активированные лимфоциты, не изменяя отрицательно свойства находящиеся в состоянии покоя лимфоцитов, то можно было бы таким путем препятствовать вообще приобретенным иммунологическим заболеванием, которые вызывают внешние антигены. Таким образом можно было бы препятствовать как аллергическим реакциям, так и отторжениям трансплантата.
Задача изобретения получение средства, которое может выводить специфически активированные лимфоциты, не причиняя вреда находящимся в состоянии покоя лимфоцитам, особенно не оказывая вредного влияния на находящиеся в состоянии покоя лимфоциты относительно их стимулирования антигенами или митогенами.
Задача решается путем применения 2-метил-1-октадецил-глицеро-(3)-фосфохолина, обозначаемого ниже как ET180CH3, для выделения активированных антигенами или митогенами лимфоцитов у млекопитающих или применением ET18OCH3 для получения лекарственного средства для выделения активированных антигенами или митогенами лимфоцитов.
ET18OCH3 и его получение известны. Далее известно, что ET180CH3 можно применять как средство против опухолей (патент ФРГ-А1 2619686) и против рассеянного склероза (патент ФРГ-А1 3530767). Из них нельзя было сделать вывод о специфическом выделении активированных лимфоцитов, как это показано изобретением. Изобретение основывается на открытии, что ET180CH3 выделяет избирательно активированные антигеном или митогеном лимфоциты.
Однако даже более продолжительное воздействие ET180CH3 не оказывает отрицательного влияния на находящиеся в состоянии покоя лимфоциты и позволяет осуществлять их дополнительную антигенную и митогенную стимуляцию. В частности, было найдено, что и более продолжительное применение ET180CH3 не производит низких отрицательных эффектов на иммунную реакцию на живом организме, а именно, как для B- так и для T-клеток-реакций.
Поэтому новое применение по изобретению позволяет удалять избирательно активированные большие лимфоциты и подавлять тем самым вызванную этими лимфоцитами иммунную реакцию. Так как одновременно нет отрицательного влияния в состоянии покоя лимфоциты, средство по изобретению не причиняет вреда самой иммунной системе. Это представляет существенное преимущество по сравнению с известными до сих пор иммунноподавляющими средствами, которые всегда оказывали влияние на свою иммунную систему и тем самым решительно ослабляли организм в его защитной способности против других антигенов и митогенов.
Эффективная доза ET18OCH3 зависит от вида назначения. В общем, человеку применяют дозу между 10 и 1000 мг/день при оральном назначении. При этом способе назначения, который осуществляют, например, растворением активного вещества в подходящем носителе (как молоко), используют преимущественно 30 300 мг/чел./дн. При назначении влияния эти дозы могут быть еще несколько повышены. При локальном назначении и здесь принимают во внимание обычно применяемые концентрации активного вещества.
Изобретение поясняется фиг 1 5, где:
фиг. 1, A встройка 3H-тимидина как меры для активности лимфоцитов при добавке активаторов клеток;
фиг. 1, B встройка 3H-тимидина через лимфоциты под влиянием активаторов клеток при добавке ET18OCH3 в первый день;
фиг. 1,C изобретение аналогично 1B при добавке ET18OCH3 во второй день;
фиг. 2,A встройка 3H-тимидина в стимулированные лимфоциты.
фиг. 2B изобретение аналогично фиг. 11A, но при добавке ET180CH3 при стимулировании клеток лишь после ET180CH3 назначения;
фиг. 2C контрольные результаты без стимулирования и добавки ET18oCH3;
фиг. 3 влияние ET18OCH3 на образование вырабатывающих специфические антитела клеток;
фиг. 4 встройка тимидина через T-лимфоциты с предварительной обработкой и без предварительной обработки ET18oCH3;
Фиг. 5 аналогичные результаты как фиг. 4 при B-лимфоцитах.
Пример 1. Из клеток селезенки Бальб C мышей выделяли T-лимфоциты пассажем через найлоновую шерсть. Последние активировали затем в культуре с поликлональными активаторами T-клеток Con A или с анти-CD3-антителами или для контроля с активатором B-клеток LPS. Соответственно к половине культур добавляли через 1 или 2 дн ET18OCH3 (10 мг/мл). Другая половина служила для контроля. На 3-й день культивирования ко всем культурам добавляли 3H-тимидин и его встройку измеряли на 4-й день.
Фиг. 1,A показывает ожидаемое стимулирование клеток в форме увеличенной встройки 3H-тимидина после поликлонального активирования с Con A или с анти-С3-антителами. Повышение на несколько градусов после добавки митогена B-клеток LPS означает, что в культурах были еще остаточные B-лимфоциты. Все эти результаты активирования были полностью подавлены добавкой к культурам ET180CH3 в 1-й день (фиг. 1,B), добавкой на 2-й (фиг. 1C) почти также полностью.
Отсюда вытекает, что ET180CH3 в пробирке практически полностью препятствует пролиферации T- и B-лимфоцитов мыши. Использованные активаторы приблизительно через 24 ч приводят к первому делению клеток, так что ET180CH3, добавленный к этому моменту, может препятствовать также вхождению клеток в первую S-фазу. Однако так как и добавка ET18OCH3 через 48 ч вызывает еще почти полное торможение, это доказывает то, что и еще пролиферирующие клетки высокочувствительны к ET180CH3.
Пример 2. Чтобы установить, можно ли ET18OCH3 в соответствующих концентрациях использовать для того, чтобы выделять из популяции лимфоцитов только активированные и профилирующие клетки специфически, оставлять, напротив, остающиеся в состоянии покоя клетки, были осуществлены следующие опыты.
Очищенные через найлоновую шерсть T-лимфоциты Бальб C мышей (H-2 d) совместно культивировали с клетками селезенки C57B16 мышей (H-2 b) в смысле "реакции смешанных лимфоцитов". К половине культур на 3-й день добавляли ET18OCH3 (10 мг/мл), другая половина служила в качестве контроля. Другая контрольная культура состояла из одних Бальб C N-лимфоцитов и без ET18OCH3. Через 7 дн культивирования все клетки для удаления ET18OCH3 промывали и снова при культивировании с клетками C57B16 мышей или с клетками CBA мышей (H-2k) стимулировали поликлональными активаторами T-клеток (Con A или анти-CO3-антителами или метогеном B-клеток LPS. Через 3 дня добавляли затем 3H-тимидин и определяли его встройку после второго дня.
Фиг. 2, A показывает результаты с контрольными культурами без ET180CH3. При этом следует отметить, что и культуры без других добавок уже показывали относительно высокую back ground встройку тимидина, который маскировал дальнейшее увеличение после стимулирования. Как единственный значительное повышение встройки давал здесь Con A.
На фиг. 2, B показаны результаты культивирования с добавкой ET180CH3. Неспецифическая back ground величина здесь полностью исчезла, так как были удалены неспецифические пролиферирующие клетки. Обратно стимулированные с C57B16 клетками культуры также не показывали больше встройки 3H-тимидина. Однако достойна внимания реакция на новое аллогенное стимулирование с СВА клетками (и прежде всего очень хорошая реакция на Con A и Анти CD3 антитела LPS) это не давало никакого стимулирования, так как B-лимфоциты в ходе культивирования отмирали.
Фиг. 2,C показывает результаты с совершенно нестимулированными контрольными клетками и без ET18OCH3. Отсутствие значительных успехов также с Con A можно объяснить тем, что нестимулированные лимфоциты мышей переносят только плохо 9-дневный период культивирования.
Эти результаты показывают, что те T-лимфоциты, которые были активированы для пролиферации особенно алло-антигеном (здесь H-2b C57B16 мышей), удаляли полностью в присутствии ET-18. Однако в противоположность этому T-лимфоциты других специфичностей в противоположность этому Т-лимфоцитов других специфичностей антигена, которые поэтому оставались в состоянии покоя, не только сохранялись, но их можно было также дополнительно еще очень хорошо активировать для пролиферации. Это было подтверждено реакцией на СВА, Con A анти-CD3 -антителе. Что совершенно нестимулированные лимфоциты (фиг. 2,C) и без ET180CH3 больше нельзя было стимулировать показывает, что ET180CH3 вообще не повреждает находящиеся в состоянии покоя клетки.
Следовательно, этот опыт показывает, что при помощи ET18OCH3 можно избирательно удалять специфически активированные антигеном T-клеточные клоны, что однако T-клетки других специфичностей антигена от этого не страдают и остаются вполне реактивными.
Пример 3. C57B16 мыши были иммунизированы каждая 100 мг классического антигена Гаптена TNP-KLH (тринитрофенил кейхол лимпет гемоцинин). Через 8 недель животным была сделана инъекция вспомогательного средства по 30 мг TNP-KLH. Одновременно с этим и затем в течение всего 5 дн одна часть животных получила 1 мг ET180CH3 на одно животное в день в молоке при помощи желудочного зонда, другая часть получила молоко без ET180CH3. Через неделю после вспомогательного средства или после первого приема ET180CH3 были взяты селезенки животных. Селезенки неиммунизированных животных с ET180CH3 и без ET180CH3 служили в качестве контроля.
С одной частью клеток селезенки были осуществлены прямые и косвенные гемолитические тесты на пластинке для обнаружения B-лимфоцитов, которые продуцируют анти-TNP-специфические антитела класса Igm или IgG.
Фиг. 3 показывает, что ET18OCH3 не оказывал влияния на образование продуцирующих специфические антитела в живом организме. Специфичность данных показана через небольшое число продуцирующих антитела клеток у неиммунизированных животных, которое соответствует background-величинам.
Этот результат показывает, что ET18OCH3 не оказывает никакого тормозного действия в живом организме на первичную или вторичную иммунную реакцию, измеренную образованием продуцирующих антитела B-лимфоцитов после приемов антигена.
Другую часть вышеназванных клеток селезенки культивировали в пробирке и смешивали с KLH (повторное стимулирование T-лимфоцитов) или с конканавалином A (общий митоген T-клеток) или с TN P-KLH (повторное стимулирование B-лимфоцитов) или с SRBC (эритроциты овцы для первичного стимулирования B-лимфоцитов в пробирке).
Реакции T-клеток определяли в тесте с пролиферацией через встройку 3H-тимидина, реакции B-клеток определяли в гемолитическом тесте с пластиной.
Фиг. 4,B показывает встройку тимидина KLH повторно стимулированных с Con A-активированных T-лимфоцитов, слева животных без предварительной обработки ET180CH3, справа с предварительной обработкой ET180CH3 на живом организме. Это показывает, что повторное стимулирование с KLH зависит от дозы и является специфическим. Предварительная обработка на живом организме животных при помощи ET180CH3 не оказывает никакого отрицательного действия на повторное стимулирование T- клеток или на митогенное стимулирование.
Фиг. 5 показывает результаты с B-лимфоцитами. Повторное стимулирование с TNP-KLH является специфическим, как и первичное стимулирование с SPBC. Здесь клетки из предварительно обработанных с ET180CH3 животных реагируют по меньшей мере так же хорошо, как клетки из контрольных животных, поэтому как находящиеся в состоянии покоя T-клетки, так и находящиеся в состоянии покоя B-клетки сохраняют свою стимулирующую способность и после назначения ET18OCH3.
Формула изобретения: Применение 2-метил-1-октадецилглицеро-(3)-фосфохолина для избирательного удаления из популяции лимфоцитов млекопитающих активированных антигеном или митогеном Т- и В-лимфоцитов.