Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА PC BORRELIA BURGDORFERI, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ B.BURGDORFERI И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К B.BURGDORFERI
ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА PC BORRELIA BURGDORFERI, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ B.BURGDORFERI И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К B.BURGDORFERI

ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО ПРОТИВ БОРРЕЛИОЗА ЛАЙМА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА PC BORRELIA BURGDORFERI, ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ B.BURGDORFERI И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К B.BURGDORFERI

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: ветеринария, в частности защита животных от болезни Лайма. Сущность: предложен эффективный иммуноген против боррелиоза Лайма у млекопитающих, который содержит гомогенный белок pC B. Burgdorferi и физиологически приемлемый носитель. Иммуногенная композиция позволяет замедлить или предотвратить инфекцию. 5 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2102081
Класс(ы) патента: A61K39/02, G01N33/535
Номер заявки: 5052266/13
Дата подачи заявки: 10.07.1992
Дата публикации: 20.01.1998
Заявитель(и): Иммуно АГ (AT)
Автор(ы): Иан Ливей[AT]; Фридрих Дорнер[AT]
Патентообладатель(и): Иммуно АГ (AT)
Описание изобретения: Изобретение представляет собой частичное продолжение патентной заявки США N 07/824161, поданной 22 января 1992 г. которая, в свою очередь, является частичным продолжением патентной заявки США N 07/727245, поданной 11 июля 1991 г.
Изобретение относится к предотвращению болезни Лайма у млекопитающих. Более конкретно, изобретение относится к иммуногенным композициям и к способам их использования для замедления или предотвращения болезни Лайма.
Выражения "болезнь Лайма" и "боррелиоз Лайма" обозначают вызываемые клещами инфекции, возбудителем которых является спирохета Borrelia burgdorferi, которые представляют собой наиболее распространенную как в США, так и в Европе болезнь, передаваемую клещами. Болезнь Лайма аналогична сифилису, так как она поражает многие органы, наиболее часто кожу, нервную систему, сердце и суставы, кроме того, развивается постадийно и может переходить в хроническую форму.
Поскольку болезнь Лайма может походить на другие болезни, существует потребность в точных и надежных методах и средствах диагностики, особенно в сложных случаях, когда клиническая картина неясна. Существует также потребность в способах лечения или предотвращения болезни. Терапия с применением антибиотиков может быть эффективной, если ее начинают осуществлять вскоре после инфицирования, но если болезнь успела прогрессировать, то требуется длительная терапия с использованием больших доз антибиотиков.
Более того, терапия с применением антибиотиков не всегда является успешной (см. Прик Мурзик и др. Infection 18: 332-341, 1990). Поэтому желательно располагать вакциной, позволяющей предотвратить болезнь Лайма.
Известно несколько антигенов бактерии В. burgdorferi. Двумя главными белками внешней поверхности В. burgdorferi являются ospA (31 кд) и оsрВ (34 кд); эти белки рассмотрены Барбоуром в Clin. Microbiol, Revs. 1: 399-414 (1988). OspA присутствует во многих штаммах, но является гетерогенным, аименно белки типа ospA из разных штаммов могут отличаться друг от друга молекулярной массой и серологической реактивностью.
OspB менее широко распространен среди штаммов, чем ospA, но, так же как ospA, существует в различных серологических и молекулярно-массовых формах. Гены ospA и ospB, которые являются плазмидкодируемыми, были клонированы, секвенированы и экспрессированы в Е. coli. Смотри Барбоур и др. Rev. Inf. Dis. 11(6): 1470-74 (1989); Бергстрем и др. Mol. Microbiol 3: 479-86 (1989).
Белок pC (24 кд) бактерии В. burgdorferi в некоторых отношениях аналогичен ospA и ospB. Он также является липопротеином, проявляет молекулярно-массовую и серологическую гетерогенность и экспонирован на поверхности клеток (на поверхности клетки он способен связывать агглютинирующее антитело; ассоциированный с клеткой pC подвержен разрушению протеазами). В Европе распространенными являются штаммы, эксперссирующие pC. От 40 до 50% двадцативосьми европейских изолятов, протестированных Вилске и др. N. Y. Acad. Sci. 539: 126-43 (1988), дали положительный результат в отношении наличия белка pC, хотя из-за того, что экспрессия pC подвержена флуктуациям, эти результаты могут быть заниженными.
Другие антигены В. burgdorferi включают: белок внешней поверхности в области 60 кд (Барбоур и др. см. выше); флагеллярный структурный белок в области 41 кд (Гассман и др. Nucleic Acids Res. 17: 3590 (1989)); белок в области 39 кд (Симпсон и др. J.Clin Micro. 28: 1329-37 (1990)); и белок с массой примерно 94 кд (Фукс и др. Четвертая Международная Конференция по боррелиозу Лайма, 1990).
Для приготовления антигенов с целью их дальнейшего изучения и охарактеризования были использованы различные методы очистки. Например, Вилске и др. (Zbl. Bakt. Hyg. 263: 92-102, 1986) подвергли цельные клетки Borreliae электрофорезу на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ); в этих условиях белки денатурировали под действием тепла и детергента додецилсульфата натрия (ДСН) и 2-меркаптоэтанола. Хансен и др. J. Clin. Microbiol 26(2): 338-46 (1988) описывают очистку флагеллума В. burgdorferi. Во Всемирной патентной заявке N 90/04411 (Бергстрем и др.) описан метод частичной очистки фракций Borrelia burgdorferi без денатурирования.
Проводились также исследования, направленные на приготовление и охарактеризование различных антигенов с целью разработки диагностических тестов. Так, в вышеупомянутой патентной заявке Бергстрема и др. а также в патентной заявке США N 07/487716 (Симпсон и Шван, опубликована 18 июля 1990 г.) описана диагностическая методика обнаружения В. burgdorferi косвенным путем по определению выработки специфических антител в ответ на инфицирование. Колеман и др. в J. Infect. Dis. 155: 756-65 (1987) описывают приготовление фракций В. burgdorferi путем обработки цельных спирохет денатурирующим детергентом (ДСН) с получением фракции протоплазматического цилиндра (бактерия, лишенная белковой оболочки), которая после дальнейшей обработки может использоваться в качестве антигена.
Вилске и др. (Четвертая Международная Конференция по боррелиозу Лайма, 1990 г.) сообщают об идентификации иммунодоминантных белков Borreliae, которые считаются полезными с точки зрения диагностики боррелиоза Лайма. Эти исследователи приходят к выводу, что два белка, а именно pC и p100, могут представлять особенно большой интерес, поскольку они позволяют обнаруживать раннюю и позднюю стадии болезни соответственно.
Хотя известны различные антигены, их эффективность в отношении защиты от болезни не может быть предсказана на основе их способности вызывать иммунный ответ при естественном или опытном инфицировании. Например, флагеллярный белок с массой 41 кд вызывает иммунный ответ, но не обладает защитным действием. Смотри Симон и др. Immunology Today 12: 11-16 (1991). Аналогично, белок с массой 94 кд не в состоянии, как указано в примере 3, обеспечить защиту от болезни. Заявители обнаружили, что антигены, способные обеспечить защиту, являются относительно редкими. Следовательно, значительная часть иммунного ответа должна вызываться антигенами, которые не имеют отношения к защите от болезни. Напротив, некоторые антигены, являющиеся потенциально пригодными для защиты, могут не вызывать адекватного иммунного ответа. Таким образом, на основе способности антигена вызывать иммунный ответ (выработку антител) нельзя сделать вывод о возможности его использования в качестве компонента вакцины.
Поэтому существует необходимость в продолжении исследований, направленных на разработку удовлетворительной вакцины против боррелиоза Лайма. В этом отношении представляет интерес патент США N 4721617 (Джонсон), в котором раскрывается вакцина против боррелиоза Лайма, состоящая из цельных клеток В. burgdorferi, инактивированных лиофилизацией. Основываясь на выделении патогенов из почек и селезенки, Джонсон показывает, что существует дозазависимое уменьшение подверженности иммунизованных хомяков инфицированию вирулентным штаммом. В. burgdorferi. Однако этот эффект является кратковременным и животные, подвергнутые контрольному заражению через 90 дней после вакцинации, оказывались не полностью защищенными.
В Европейском Патенте N 418827 (Симон и др.) описывается вакцина против В. burgdorferi, особенно против штаммов B31 и ZS7, состоящая из моноклональных антител, которые узнают белок oSpA массой 31 кд. Согласно вышеупомянутому Европейскому патенту Симона и др. пассивная иммунизация S CID -мышей этими антителами ингибирует развитие симптомов, вызываемых Borrelia, (Защита от болезни определялась в терминах сопротивляемости инфекции и развитию артрита). Этот Европейский патент раскрывает также экспрессию в Е. coli рекомбинантного гибридного белка β -галактозидаза/oSpA. Выработка раскрываемых моноклональных антител индуцируется иммунизацией цельными бактериальными клетками или рекомбинантными антигенными белками.
Фикриг и др. Science 250: 553-56 (1990) описывают пассивную защиту мышей (CЗH/HeJ) поликлональными сыворотками от умерщвленных: В. burgdorferi или от экспрессирующих oSpA Е. coli, или oSpA-специфическим моноклональным антителом. Эти исследователи указывают также, что мыши активно протектируются при иммунизации очищенным рекомбинантным гибридным белком oSpA/глютатинон-S-трансфераза. Защищенность животных измерялась в терминах способности иммуногена предотвращать инфицирование или аннулировать гистопатологические проявления болезни.
Бергстрем и др. (WO 90/04411) полагают также, что иммуногенно активные фракции В. burgdorferi могут быть использованы в качестве вакцин. Однако ими не приводится никаких данных, иллюстрирующих иммуногенность или защитную активность указанных фракций.
Целью изобретения является создание эффективной вакцины против болезни Лайма у млекопитающих и способа вакцинации млекопитающих для предотвращения заболевания ими болезнью Лаймa.
Следующей целью изобретения является способ очистки белков В. burgdorferi без их денатурации.
Еще одной целью изобретения является создание диагностического средства и способа его использования для обнаружения присутствия антитела на В. burgdorferi в телесных жидкостях.
Для достижения этих и других целей, согласно одной отличительной особенности изобретения, разработан иммуноген, включающий в себя: (а) материал, выбранный из группы, состоящей из одной или нескольких серологических форм белка pC бактерии В. burgdorferi в гомогенной форме, варианта pC и соединения, имитирующего pC, который имеет структуру, в достаточной степени аналогичную природному pC, чтобы быть способным вызывать выработку защитных антител, и (б) физиологически приемлемый наполнитель для этого материала, в котором иммуногенное начало присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы вызывать иммунный ответ, способный защитить от боррелиоза Лайма подверженное заболеванию им млекопитающее. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуноген содержит, кроме того, адъювант, такой как, например, гидроокись алюминия.
Согласно другой отличительной особенности настоящего изобретения разработан способ иммунизации млекопитающих, подверженных заболеванию боррелиозом Лайма, от указанной болезни, включающий в себя стадию введения указанному млекопитающему иммунологически эффективного количества описанного выше иммуногена.
Согласно следующей отличительной особенности настоящего изобретения разработан способ очистки белков В. burgdorferi, включающий в себя следующие стадии: (а) разрушение клетки В. burgdorferi и фракционирование разрушенной клетки на мембрану и цитоплазму; (б) ресуспендирование мембранной компоненты в не вызывающем денатурации детергенте с получением солюбилизированного белка и нерастворенного материала, и с последующим отделением указанного солюбилизированного белка от указанного нерастворенного материла; (в) хроматографирование солюбилизированного белка на ионообменной фазе с получением белковых фракций; (г) анализ белковых фракций для идентификации тех фракций, которые содержат требуемый белок. В рамках этого способа за стадией (г) может следовать стадия гидроксилапатитной хроматографии и/или аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом для концентрирования и дальнейшей очистки требуемых белков.
Согласно еще одной отличительной особенности настоящего изобретения разработан диагностический агент для обнаружения антител на В. burgdorferi в образце, содержащем полученный вышеописанным способом очистки белок В. burgdorferi.
Наконец, разработан способ обнаружения присутствия антител на В. burgdorferi в образце, который включает в себя инкубирование образца с вышеуказанным диагностическим агентом, и обнаружение присутствия связанного антитела, образующегося в результате этого инкубирования.
На фиг. 1 представлена фотография, на которой показаны результаты электрофоретического анализа антигенов, которые были очищены от Orth -1 вышеописанными методами; на фиг. 2 фотография, иллюстрирующая результаты ДСH-ПАГЭ клеток В. burgdorferi инкубированных с трипсином (полосы 2, 6 и 10), протеиназой К (полосы 3, 7 и 11) и без протеаз (полосы 1, 5 и 9) в сравнении с очищенным белком pC (полосы 4 и 8). Электрофоретически разделенные белки были охарактеризованы с помощью окрашивания золотом с применением золотосодержащего красителя (полосы 1-4), вестерн-блоттирования с применением pC-специфического моноклонального антитела (Mab35, полосы 5-8) и флюорографии для липопротеинов (мечение 3H-пальмитиновой кислотой, полосы 9-11).
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения.
Хотя ранее было с разной степенью точности и достоверности идентифицировано и охарактеризовано несколько различных антигенов В. burgdorferi, белок pC до сих пор не рассматривался как агент, способный обеспечить защиту от болезни Лайма. Ключевой аспект сделанного авторами открытия состоит в установлении того факта, что для обеспечения оптимального защитного действия необходимо в максимальной степени сохранить исходную конформацию белка pC. Был разработан новый способ получения гомогенного белка pC, который оставляет природную конфигурацию белка практически ненарушенной, что позволяет использовать pC в качестве иммуногена против болезни Лайма. Этот способ очистки без денатурации применим и для получения антигенов Borrelia для использования их с целью обнаружения болезни Лайма.
Защитное действие неденатурированного белка pC легко демонстрируется на примере песчанок, которые до сих пор не считались оптимальными подопытными животными для определения эффективности данного антигена, такого как, например, pC, с точки зрения его способности индуцировать выработку защитных антител против болезни Лайма. Нами было обнаружено, что песчанки хорошо подходят для осуществления такой оценки отчасти потому, что боррелиоз у песчанок имитирует болезнь у людей в некоторых важных аспектах. А именно, у песчанок, как и у людей:
(1) инфекция является полисистемной и поражает целый спектр органов, таких как кожа, суставы, нервная система, селезенка, сердце, мочевой пузырь и почки,
(2) болезнь может принимать хроническую форму. В. burgdorferi были выделены из организмов песчанок более чем через год после контрольного заражения;
(3) распухание суставов, напоминающее артрит, может развиваться у песчанок так же, как у людей;
(4) наблюдается аналогичный гуморальный иммунный ответ с точки зрения специфичности и временного развития ответа. Например, было обнаружено, что зараженные песчанки и люди дают слабый иммунный ответ или вовсе не дают ответа на белки oSpA и oSpB. В действительности, в противоположность мышам, антитела на oSpA и oSpB являются редкими и у песчанок, и у людей.
Вакцина.
Один вариант осуществления изобретения относится к вакцине против боррелиоза Лайма, в которой иммуноген содержит белок pC В. burgdorferi. Белок pC является антигеном поверхности клетки, что показано с помощью его протеолитического расщепления из целых клеток В. burgdorferi. Далее он характеризуется молекулярной массой около 24 кд, хотя pC из разных штаммов может проявлять молекулярно-массовую и серологическую гетерогенность. С помощью обычной гибридомной методики было получено одиннадцать моноклональных антител (моноклональные антитела на В. burgdorferi 22, 28, 29, 34-39 включительно, 42 и 45), которые связываются с pC из штамма Orth -1 В. burgdorferi и из некоторых других штаммов.
Полная последовательность ДНК, кодирующей белок pC B. burgdorferi, и порождаемая ей аминокислотная последовательность имеют следующий вид:

Белок pC согласно настоящему изобретению может включать в себя смесь разных серологических форм природного белка pC. Кроме белка pC, полученного из клеток B. burgdorferi, могут быть использованы, как это описано ниже, рекомбинантный pC, варианты природной молекулы ("варианты pC") и "имитации"
соединения, содержащие мимеотопы, имитирующие эпитопы pC.
Класс вариантов pC включает в себя, например, олигопептиды и полипептиды, соответствующие иммуногенным частям молекулы pC и любым небелковым иммуногенным частям молекулы pC. Таким образом, вариант должен содержать полипептид, который гомологичен природной молекуле pC и обладает иммунологическими признаками, характерными для нее. В этом смысле термин "гомологичность" (или "степень подобия") двух последовательностей означает не доходящее до полной идентичности сходство, и указывает на то, что первая последовательность является производной от второй. Например, полипептид является "гомологичным" pC, если он содержит аминокислотную последовательность, соответствующую эпитопу, узнаваемому специфическими для pC антителами или Т-клетками. Такая последовательность может иметь длину всего лишь в несколько аминокислот и может быть линейной детерминантой или детерминантой, образующейся, когда аминокислоты из разных частей линейной последовательности оказываются рядом друг с другом в результате складывания белка или в результате подвергания модификации ковалентных связей. Аминокислотные последовательности, являющиеся антигенными детерминантами, которые отвечают целям настоящего изобретения, могут быть установлены, например, известными в данной области техники методами моноклонального картирования. Смотри Регенмортель, Immunology Today 10: 266-72 (1989), и Берзофски и др. Immunological Reviews 98: 9-52 (1987). Анализ на такого типа подобие можно также осуществить с помощью конкурентного ингибирования антителами или с помощью пролиферации Т-клеток.
Полипептиды, которые в соответствии с этими критериями квалифицируются как варианты pC, могут быть, согласно настоящему изобретению, получены с помощью стандартных методов обратной транскрипции, т.е. путем построения генетической последовательности на основании аминокислотной последовательности, или с помощью стандартных методов генетического сплайсинга. Например, варианты pC можно получить с помощью методов, в которых используются сайт-направленный мутагенез или олигонуклеотид-направленный мутагенез. Смотри, например, "Мутагенез клонированной ДНК" в: "Текущие записки по молекулярной биологии" 8.0.3 и последующие (под ред. Аушубеля и др. 1989) ("Аушубель").
Другие варианты pC в рамках настоящего изобретения представляют собой молекулы, которые соответствуют определенной части pC или содержат часть pC, но не совпадают с природной молекулой и проявляют свойственную pC иммуногенную активность в индивидуальном виде или в сочетании с носителем. Варианты pC этого рода должны представлять собой фрагменты природной молекулы или являться полипептидом, синтезируемым de novo или с применением рекомбинантных методов.
Для того, чтобы быть использованным для рекомбинантной экспрессии pC или варианта pC, кодирующий эту молекулу полинуклеотид предпочтительно должен содержать нуклеотидную последовательность, соответствующую требуемой аминокислотной последовательности, которая оптимизирована для выбранного хозяина с точки зрения легкости инициирования трансляции и экспрессирования коммерчески целесообразных количеств pC или требуемого варианта pC. Аналогично, вектор, отобранный для трансформации выбранного организма-хозяина указанной полинуклеотидной молекулой, должен обеспечивать сохранность и высокоэффективную транскрипцию последовательности, кодирующей полипептид. Кодирующая полинуклеотидная молекула может кодировать химерный белок, это означает, что она может содержать кодирующую иммунологическую часть молекулы pC нуклеотидную последовательность, которая операбельно связана с последовательностью, кодирующей не относящийся к структуре pC фрагмент, например, сигнальный пептид для клетки-хозяина.
С целью выделения сегмента ДНК, кодирующего молекулу pC, можно описанными в литературе методами приготовить полную ДНК В. burgdorferi. Смотри, например, Маниатис и др. "Молекулярное клонирование: лабораторное руководство" (Колд Спринг Харбор Лабораториз, Нью-Йорк, 1982); Бейс, Acta Pathol. Microbiol Scand. (Секция В) 82: 780-84 (1974). Полученную таким образом ДНК можно подвергнуть частичному расщеплению рестриктазой, получив более или менее статистический набор фрагментов генома; для этой цели может быть использован фермент, содержащий участок, способный узнавать тетрануклеотид, например Sau 3A (MboI). Затем фрагменты, полученные в результате этого частичного расщепления, можно фракционировать по размерам, например, центрифугированием при градиенте сахарозы (Маниатис, см. выше), или гель-электрофорезом с пульсирующим полем (смотри Анад, "Направления в генетике", ноябрь 1986 г. с. 278-83), получив фрагменты с длиной, соответствующей длине ДНК, кодирующей молекулу pC.
Выбранные фрагменты могут быть клонированы в подходящий клонирующий вектор с помощью известных методов, описанных, например, Аушубель, 5.0.1 и последующие. Полученную таким образом ДНК можно вставить, например, в сайт BamHI клонирующего вектора pUC18. Полученные вставкой в клонирующий вектор фрагментов выбранной длины химерные плазмиды или фаги могут быть затем трансформированы в E.coli или в другие клетки-хозяева, которые затем подвергаются отбору с точки зрения способности экспрессировать закодированный белок. Для тестирования получаемых библиотек с целью идентификации клона, содержащего ген pC, могут быть использованы разнообразные методы. Эти методы включают тестирование с помощью гибридизационного зонда, специфического для pC, такого как, например, олигонуклеотидный зонд, или тестирование на экспрессию pC-антигена с использованием pC-иммунологического реагента. Последнее можно, например, осуществить иммуноблотированием библиотеки анти-pC моноклональными антителами или специфическим поликлональным антителом, полученным от животных, иммунизованных очищенным pC. После того как в библиотеке идентифицирован клон, содержащий кодирующую pC ДНК, эту ДНК можно выделить, полностью охарактеризовать область, кодирующую белок pC (например, с помощью секвентирования), после чего использовать эту ДНК для получения векторов экспрессии pC, пригодных для получения реактивного белка.
Как указывалось выше, для получения эффективного иммуногена необходимо, чтобы структура рекомбинантно экспрессированного белка pC была в достаточной степени аналогична структуре природного (неденатурированного) pC; только в этом случае белок способен инициировать выработку защитных антител. Поэтому предпочтительно экспрессировать pC-кодирующую ДНК таким образом, чтобы избегать внутриклеточного протеолиза и агрегации продукта экспрессии в денатурированной форме. Один из путей, позволяющих избежать этого, состоит в рекомбинантном получении pC в системе хозяин-вектор, что обеспечивает секрецию pC из клетки-хозяина, предпочтительно непосредственно в культуральную среду. Одной из таких систем является система на основе Bacillus subtilis. Подходящий вектор секреции для Bacillus subtilis может быть сконструирован привязкой сигнальной последовательности для α -амилазы В. amyloliquefaciens (смотри Янг и др. Nucleic Acid Res. 11: 237-49 (1983), к плазмидному вектору pUB110 Bacillus, как описано Ульманеном и др. J. Bacteriol. 162: 176-82 (1985). В соответствии с этим подходом, кодирующая последовательность для чужеродного белка клонируется в прямом направлении (в 5' 3' направлении) ниже промотора, сайта связывания рибосомы и сигнальной последовательности для a -амилазы. Транскрипция и трансляция pC протекает под контролем a -амилазного промотора и трансляционного комплекса этой конструкции, а секреция pC из клетки-хозяина обеспечивается сигнальной последовательностью a -амилазы. Были описаны также аналогичные векторы, используемые для дрожжевых культур; используя эти векторы, можно осуществить экспрессию и секрецию pC в дрожжах.
Другой подход к экспрессированию pC в системе хозяин-вектор, который позволяет избежать протеолиза, агрегации и денатурации, состоит в использовании вируса коровьей оспы в качестве вектора, способного к экспрессии в различных клетках-хозяевах млекопитающих, подверженных заражению этим вирусом. Использование этого подхода предполагает приготовление рекомбинантного вектора на основе вируса коровьей оспы, в котором ген pC находится под контролем, наряду с сигналами трансляции и секреции, промотора, пригодного для экспрессирования белка pC в хозяине, зараженном коровьей оспой. Как описано в патенте США N 4603112, плазмида должна также иметь на 5'-конце области контроля транскрипции, а на 3'-конце обращенные к нему своим 3'-концом сигналы терминации и полиаденилирования; указанные области и сигналы являются фланкирующими последовательностями, обеспечивающими гомологическую рекомбинацию с геномом вируса коровьей оспы дикого типа. При введении такой конструкции в зараженную вирусом коровьей оспы клетку-хозяина фланкирующие последовательности направляют рекомбинацию между плазмидным вектором и вирусом коровьей оспы, в результате чего клонированная структурная последовательность (в данном случае кодирующая pC) становится частью вируса коровьей оспы, размножается и экспрессируется вместе с ним. Предпочтительно область, находящаяся между фланкирующими последовательностями, содержит также селектируемый маркер, чтобы в присутствии избирательной среды выживали только те клетки, которые содержат рекомбинированный вирус коровьей оспы (и, в контексте данного описания, последовательность, кодирующую pC-активный полипептид).
Полученный таким образом рекомбинантный штамм вируса коровьей оспы можно использовать для заражения им клеток млекопитающих, таких как клетки Веро или клетки CVI, обладающие способностью к ферментативному росту при высокой плотности. Экспрессируемый в этих клетках в процессе ферментации pC-активный белок секретируется в сбраживаемую среду, из которой его выделяют в чистом виде с помощью стандартных методов.
Помимо природного pC и вариантов pC настоящее изобретение охватывает также соединения ("имитации"), которые имитируют эпитопы pC ("мимеотопы"). Одним из примеров такой имитации является антиидиотипическое антитело, то есть антитело, получаемое иммунизацией животного антителом, которое специфически связывается с эпитопом антигена. Антиидиотипическое антитело узнает антигенсвязывающий центр первого антитела и подстраивается под него. Поэтому строение его антигенсвязывающего центра очень похоже на эпитоп, который взаимодействует с антигенсвязывающим центром первого антитела. В силу того, что антигенсвязывающий центр антиидиотипического антитела имеет строение, имитирующее исходный антиген, это антитело может быть использовано в качестве вакцины для выработки антител, взаимодействующих с исходным антигеном. Смотри Финеберг и Эртл, CRC Critical Reviews in Immunology 7: 269-284 (1987). Подходящие имитации могут быть идентифицированы тестированием с применением антитела на pC, при котором выясняется, какие соединения связываются с ним или могут быть получены молекулярным моделированием. Смотри Морган и др. "Подходы к открытию непептидных лигандов для пептидных рецепторов и пептидаз". "Ежегодные доклады по медицинской химии" (Академик Пресс, 1989), стр. 243 и далее.
Вакцина согласно настоящему изобретению предназначена для иммунизации против болезни Лайма подверженных ей млекопитающих, включая человека. Термин "иммуноген" означает в контексте настоящего описания антиген, вызывающий специфический иммунный ответ, приводящий к возникновению гуморального или клеточно-опосредованного иммунитета против заражения Borrelia. Таким образом, термин "иммунитет" обозначает способность организма сопротивляться инфекции или преодолевать ее с большей легкостью по сравнению с неиммунизованными особями или переносить ее без возникновения клинических нарушений.
Иммуноген согласно настоящему изобретению может, кроме того, содержать физиологически приемлемый носитель. Такие носители хорошо известны в данной области техники и включают полимерные (макромолекулярные) носители. Примерами носителей, пригодных для млекопитающих, являются туберкулин PPD, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин и гемоцианин. Предпочтительный носитель должен быть нетоксичным и не являться аллергеном.
Иммуноген может содержать адъювант, такой как соединение алюминия, воду и эмульсии растительного или минерального масла (например, адъювант Френда), липосомы, ИСКОМ (иммуностимулирующий комплекс), водорастворимые стекла, полианионы (например, поли-А:И, декстрансульфат, лентинан), нетоксичные аналоги липополисахаридов, мурамилдипептид, и иммуномодулирующие соединения (например, интерлейкин 1 и 2) или комбинации вышеперечисленных материалов. Предпочтительным адъювантом является гидроокись алюминия. Иммуногенность у млекопитающих может также быть усилена живыми ослабленными бактериальными векторами, такими как Salmonella или Mycobacteria, или вирусными векторами, такими как Vaccinia, которые экспрессируют pC-активный полипептид.
Методики приготовления таких иммуногенов хорошо известны в данной области техники. Например, иммуноген согласно настоящему изобретению может быть лиофилизован для последующей регидратации в таком наполнителе, как раствор поваренной соли или какой-либо другой физиологический раствор. В любом случае вакцину согласно настоящему изобретению получают, смешивая иммунологически эффективное количество pC с наполнителем, взятом в таком количестве, чтобы получить требуемую концентрацию иммуногенно эффективного компонента вакцины. Содержание иммуногенно эффективного компонента в вакцине зависит от вида млекопитающего, подлежащего иммунизации, возраста, веса тела, а также от иммуногенности активного компонента, присутствующего в вакцине. В большинстве содержание иммуногенного компонента в вакцине находится в пределах от 1 до 100 мкг на одну дозу, предпочтительно в пределах от 10 до 50 мкг на одну дозу.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, иммуноген содержит pC, вариант pC или имитацию pC и один или несколько других антигенов В. burgdorferi.
Разработаны способы получения вакцин согласно настоящему изобретению, гарантирующие сохранение идентичности и иммунологической эффективности специфических молекул и отсутствие нежелательного микробного загрязнения. Конечный продукт расфасовывается и хранится в стерильных условиях.
Способ иммунизации млекопитающего против болезни Лайма включает в себя введение млекопитающему эффективного количества вышеописанного иммуногена. Это введение можно осуществить с помощью любой процедуры, известной в данной области техники. Например, один из вариантов применения может включать в себя введение вышеуказанной вакцины млекопитающим, в отношении которых известно, что они могут подвергаться воздействию клещей, несущих В. burgdorferi, приблизительно за 6 месяцев 1 год до момента заранее известного или предполагаемого воздействия. В соответствии с настоящим изобретением может быть использован любой путь иммунизации, для которого с высокой степенью надежности предсказана или доказана способность вызывать достаточно сильный иммунный ответ; вместе с тем, предпочтительным путем введения является парэнтеральный путь. Примеры предпочтительных способов введения включают подкожные, внутрикожные и внутримышечные инъекции, а также использование форм, пригодных для перрорального, носового или ректального введения.
Способ очистки.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения разработан новый неденатурирующий способ очистки различных антигенов В. burgdorferi из различных штаммов В. burgdorferi. Эти антигены включают oSpA, oSpB, pC, флагеллярный структурный белок, белки с молекулярными массами приблизительно 21 кд, 56 кд, 60 кд и 63 кд, но не ограничиваются названными белками. Этот способ является усовершенствованием известных способов, которые или приводят к денатурации, или специфичны только для какого-либо отдельного антигена, или позволяют осуществить лишь частичную очистку. Предпочтительный способ очистки включает в себя следующие стадии:
(а) разрушение клеток B. burgdorferi и фракционирование их на "мембранный" и "цитоплазматический" компоненты;
(б) экстрагирование мембранной фракции неденатурирующим детергентом с последующим центрифугированном для получения супернатанта, содержащего растворенный белок, и удаления нерастворимых материалов в виде таблетки; и
(в) фракционирование растворенных антигенов ионообменной хроматографией (диэтиламиноэтил, или "ДЭАЭ") при элюировании адсорбированных антигенов с градиентом NaCl.
Способ очистки может включать в себя концентрированно и дальнейшую очистку антигенов с помощью:
(а) гидроксилапатитной хроматографией при элюировании адсорбированных антигенов путем увеличения содержания фосфата в буфере; и/или
(б) аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом при элюировании адсорбированных антигенов имидазолом.
Другие известные способы элюирования включают элюирование с уменьшением pH или с увеличением концентраций хлорида аммония, гистидина или другого соединения, обладающего сродством к хелатированному металлу.
Разрушение клеток можно осуществить, лизируя клетки встряхиванием их в суспензии в клеточной мельнице с мелкими стеклянными шариками, разрушая их ультразвуком или во французском прессе. С другой стороны, антигены можно экстрагировать непосредственно с поверхности клеток микроорганизма, подвергая клетки действию детергента, меняя ионную силу среды, в которой находятся клетки, или слегка меняя температуру. Кроме того, можно использовать исходный материал, содержащий мембраны, сброшенные клетками.
Мембранную фракцию можно экстрагировать детергентом, предпочтительно таким, который обладает хорошей солюбилизирующей способностью, не вызывает денатурацию и не мешает последующей ионообменной хроматографии. Предпочтительным детергентом является цвиттер-ионный детергент 3-14 (Калбиохим), хотя может быть использован любой детергент или органический растворитель, обладающий вышеуказанными свойствами. Как правило, детергент используют в концентрации 1% (масса/объем), но может быть эффективным, с переменной степенью эффективности, в интервале 0,01 10% (масса/объем). Экстракцию детергентом проводят при температуре в интервале 0 60oC, предпочтительно при 37oC, в течение 10 мин 8 ч, предпочтительно в течение 1 ч. Для улучшения процесса растворения вдобавок к детергенту могут быть использованы хаотропные агенты, такие как мочевина.
Затем растворенные детергентом антигены фракционируют с помощью ДЭАЭ-хроматографии. Предпочтительно использовать ДЭАЭ ионообменную смолу, но могут быть использованы и другие анионообменные и катионообменные смолы в индивидуальном виде или в комбинации друг с другом. В соответствии с настоящим изобретением, ионообменная смола представляет собой нерастворимую матрицу, на которой закреплены заряженные группы. Примеры функциональных групп, используемых в анионообменниках, включают аминоэтильную (АЭ), диэтиламиноэтильную (ДЭАЭ) и кватернизованную (четвертично) аминоэтильную (КАЭ) группы. Катионообменники могут содержать карбоксиметильную (KM), фосфо- или сульфопропильную (СП) группы. Хотя образцы подают в колонку в среде Трис-буфера, содержащего цвиттер-ионный детергент 3-14 (1% ), и элюируют антигены при градиенте NaCl, другие системы могут оказаться не менее эффективными.
Антигены можно подвергнуть концентрированию, сорбируя их на гидроксилапатите в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники. Альтернативным или дополняющим методом, с помощью которого антигены могут быть далее сконцентрированы/очищены, является аффинная хроматография с иммобилизованным металлом. Этот последний метод является более предпочтительным для очистки pC, чем гидроксилапатитная хроматография, поскольку позволяет достигнуть большей степени отделения этого белка от oSpA и В.
Преимущество вышеописанного неденатурирующего способа очистки состоит в том, что сохраняется 3-D конформация белка, что обеспечивает сохранность структуры всех антителосвязывающих центров антигена, имеющихся в нативном белке, включая те, которые обеспечивают защиту. Если блок денатурирует, то связывающие центры могут частично пли полностью разрушаться, что, естественно, снижает способность антигена индуцировать выработку антител на антигенные центры. Поэтому белки, претерпевшие такие изменения, непригодны для использования в вакцинах.
Преимущество вышеописанного способа очистки по сравнению со способом, в котором используются цельные клетки, например, описанным Джонсоном (1988), состоит в том, что он позволяет получить гомогенный белок, не содержащий никаких токсичных компонентов; это существенно снижает вероятность возникновения отрицательных реакций. Термин "гомогенный" в данном контексте означает, что, по меньшей мере, 80% (масса/объем) белка представляет собой совершенно неповрежденный pC, а почти весь остальной полученный продукт представляет собой продукты распада pC. Таким образом, примеси, представляющие собой компоненты среды и другие белки Borrelia присутствуют лишь в следовых количествах, или полностью отсутствуют. Гомогенный pC может содержать более чем одну серологическую форму pC.
Таким образом, настоящее изобретение позволяет удалить нежелательные, потенциально иммуногенные белки, которые могут индуцировать выработку автоантител и вызвать у иммунизованного млекопитающего вредные для него автоимунные реакции. По той же причине вышеописанный способ очистки гарантирует полную воспроизводимость при изготовлении вакцины.
Защита
Основываясь на открытой ими применимости гербилов в качестве модели для данного случая, авторы провели эксперименты с целью подтверждения того, что использование настоящего изобретения может обеспечить выработку иммунитета против заражения В. burgdorferi. Эти эксперименты обсуждаются в нижеприведенном примере 3. Хотя тестированию были подвергнуты oSpA, oSpB, pC, белок внешней поверхности массой 63 кд, белки массой 21 кд и 94 кд из штамма orth-1 В. burgdorferi, только для белка pC наблюдались ярко выраженные признаки способности производить защитное действие.
Способ обнаружения.
Получаемые вышеописанным способом очистки антигены могут быть использованы в диагностических тестах, например, для обнаружения антител на В. burgdorferi в телесной жидкости млекопитающих. Например, полученный вышеописанным способом неденатурированный, гомогенный белок может быть инкубирован с образцом телесной жидкости для обнаружения присутствия связанного антитела, появляющегося в результате этого инкубирования. Термин "телесная жидкость" охватывает спинно-мозговую жидкость, синовиальную жидкость, мочу, жидкость полостей тела, кровь, сыворотку, сперму и слюну, но не ограничивается указанными примерами. Хотя такие тесты хорошо известны, они существенно улучшаются благодаря чувствительности и специфичности антигенов, очищенных способом согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение более подробно описывается с помощью нижеследующих примеров, которые являются чисто иллюстративными и ни в какой степени не ограничивают объема изобретения.
Пример 1: Очистка белка.
Приготовление мембранных фракций
Клетки Borrelia burgdorferi собирают центрифугированием (7000g, 20 минут, 4oC), полученный осадок, состоящий из клеток, дважды промывают фосфатно-солевым буфером, содержащим 5 мМ MgCl2, и определяют массу влажных клеток. Затем промытые клетки ресуспендируют в 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,5 (в соотношении 1 г клеток на 2 мл буфера) и эту суспензию добавляют к стеклянным шарикам (0,17-0,18 мм в диаметре, 5 г шариков на 1 г клеточной пасты), помещенным в металлическую чашку. Затем клетки лизируют, встряхивая полученную смесь в клеточной мельнице Vibrogen® (модель V14, Бюхлер). Трехминутные циклы встряхивания при охлаждении (4oC) повторяют до тех пор, пока лизис не пройдет более чем на 99% (оценивается с помощью темнопольной микроскопии). Затем лизат фильтруют через фильтр из пористого стекла для удаления стеклянных шариков, и отфильтрованные шарики промывают буфером для увеличения содержания бактериальных антигенов в фильтрате.
Лизат центрифугируют в течение 20 минут при 7500g и температуре 4oC, получая неочищенную мембранную фракцию ("онс" осадок, полученный при низкой скорости). Далее супернатант центрифугируют в течение 30 минут при 100000g и температуре 4oC, получая вторую мембранную фракцию ("овс" осадок, полученный при высокой скорости). Обе мембранные фракции дважды промывают 100 мМ Трис-HCl буфером (pH 7,5), используя условия первоначального центрифугирования. В качестве исходного материала для очистки pC может быть использована любая из этих мембранных фракций (равно как и для очистки других связанных с мембраной антигенов), но фракция "овс" содержит меньше загрязняющих белков.
Экстрагирование мембран детергентом
Мембраны ресуспендируют в концентрации примерно 10 мг белка/мл в 10 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,5), содержащем 1% (масса/объем) цвиттер-ионного детергента 3-14 (Серва). Через 1 час инкубирования при 37oC центрифугированием удаляют нерастворимые материалы (100000g, 60 минут, 4oC).
Ионообменная хроматография с ДЭАЭ
Солюбилизированные детергентом антигены фракционируют ДЭАЭ - хроматографией, как указано ниже.
Колонка: полупрепаративная колонка Protein PAK DEAE 5РW (диаметр 21,5 мм, длина 150 мм) фирмы Вотерс.
Образец: 20 мл (4х5 мл) образца солюбилизированного детергентом антигена (концентрация 10 кг/мл).
Скорость потока: 4 мл/мин
Буфер A: 10 мм Трис-HCl, pH, 7,5/1% (масса/объем) цвиттер-ионного 3-14.
Буфер B: A + IM NaCl.
Градиент: 0% B в течение 35 мин, 0 30% В в течение 90 мин, 30 65% В в течение 45 мин, 65 100% В в течение 10 мин.
Колонку приводят в равновесное состояние буфером А, и элюируют антигены при увеличивающемся содержании NaCl. Для идентификации фракций, содержащих целевой антиген, аликвоты фракций (8 мл) осаждают ацетоном и анализируют осадки методом ДСР-ПАГЭ и/или иммуноблотированием.
Гидроксилапатитная хроматография.
Фракции, обогащенные целевым антигеном, например рС, объединяют и подвергают диализу в буфере С, после чего вводят в колонку с гидроксилапатитом. Связанный антиген элюируют, увеличивая содержание фосфат-ионов, например, буфером D. В этом случае разбавленные растворы антигена можно сконцентрировать и добиться еще большей степени отделения антигена от загрязняющих примесей.
Техническая спецификация этой методики следующая.
Колонка: колонка Bio-Gel HPHT (диаметр 7,8 мм, длина 100 мм) фирмы Био-Рад.
Образец% объединенные рС-содержащие фракции с предыдущей стадии (например, фракции 20-22) после диализа в буфере С (4х5 мл).
Скорость потока: 0,5 мл/мин.
Буфер С: 10мМ МОПС-NаОН (3-N-морфолинопропансульфоновая кислота); рН 6,8/1мМ Nа(РО4)3-/0,01 мМ СаСl2/1% (масса объем) цвиттер-ионного 3-14.
Буфер D: C + 400 мМ Na (PO4)3-
Градиент: 0% D в течение 60 мин, 0-100% D в течение 20 мин.
Фракции анализируют так же, как описано для стадии ионообменной хроматографии.
Аффинная хроматография с иммобилизованным металлом.
Фракции, обогащенные целевым антигеном, например pC-содержащие фракции, после разделения ионообменной хроматографией с ДЭАЭ объединяют и регулируют буфер (например, к фракциям из ионообменной хроматографии, содержащим белок pC, добавляют NaCl до конечной концентрации 150 мМ). Профильтрованный раствор антигена (0,2 мкм) подают в колонку, содержащую иммобилизованный металл, обладающий сродством к антигену (колонка заранее нагружена ионами Cu++ в соответствии с описанием, представленным производителем, и приведена в равновесное состояние буфером A), промывают буфером А и элюируют связанный антиген имидазолом, содержащим буфер B. В этом случае разбавленные растворы антигена можно сконцентрировать и добиться еще большей степени отделения антигена от загрязняющих примесей.
Техническая спецификация этой методики приведена ниже для белка pC.
Колонка: колонка с хелатирующей суперозой HR 16/5 (диаметр 16 мм, длина 50 мм) фирмы Фармация/ЛКБ.
Образец: объединенные pC-содержащие фракции, полученные ионообменной хроматографией с ДЭАЭ, с добавленным NaCl (150 мМ)
Буфер A: 20 мМ Трис-ацетат pH 7,5/150 мМ NaCl/1% (масса/объем) цвиттер-ионного детергента 3-14.
Буфер B: 20 мМ Трис-ацетат pH 7,0/150 мМ NaCl/1% (масса/объем) цвиттер-ионного детергента 3-14/50 мМ имидазола.
Скорость потока: 2 мл/мин.
Градиент: A в течение 30 мин, 0-100% В в течение 40 мин.
Фракции, содержащие pC, идентифицируют так же, как и на стадии ионообменной хроматографии.
Пример 2: Результаты применения способа очистки.
Были охарактеризованы (см. фиг.1) следующие антигены, полученные вышеописанными методами:
белок внешней поверхности с массой 63 кд (полоса 7)
белок с массой 60 кд (полоса 8)
белок с массой 56 кд (полоса 9)
флагеллярный структурный белок (полоса 10)
oSpB (полоса 11)
oSpA (полоса 12)
pC (полоса 13)
белок с массой 21 кд (полоса 14)
Первые три стадии использованного способа очистки были одинаковы независимо от того, какой именно белок очищали, хотя для оптимизации разделения могут быть, если это необходимо, внесены некоторые изменения. Используемая для очистки/концентрирования белка pC стадия гидроксилапатитной хроматографии является широко применимой, поскольку почти все представляющие интерес белки связываются с гидроксилапатитом в среде буфера С.
Пример 3. Изучение защитного действия.
Поскольку обычно иммунитет, приобретенный в ходе активного заражения, сильнее иммунитета, достигаемого вакцинацией, группу из 10 песчанок подвергли внутрибрюшинному контрольному заражению 2·107 вирулентными бактериями В. burgdorferi, штамм Orth-1, чтобы показать, что защитный иммунитет против боррелиоза Лайма является реально достижимой целью. Ретроспективная оценка говорит о том, что эта доза эквивалентна примерно 1000-кратной дозе, требующейся для того, чтобы заразить 50% животных. Через 3 недели животные в течение 1 недели получали антибиотики для того, чтобы устранить инфекцию. После 17-дневной паузы, в течение которой антибиотик полностью вывелся из организмов животных, их повторно подвергли контрольному заражению так же, как описано выше. Спустя 2 недели животных умертвили и культивировали образцы тканей, взятых из мочевого пузыря, селезенки, почек и сердца. Все животные оказались защищенными, поскольку В. burgdorferi не были обнаружены ни в одной из тканевых культур, несмотря на регулярные обследования культур на протяжении 8-недельного периода. В противоположность этому, 80% контрольных песчанок, не получивших исходного "иммунизирующего заражения", оказались зараженными. Для того, чтобы гарантировать достоверность сравнения с тестовыми животными, этим контрольным животным также давали антибиотики. Это подтверждает, что защита в изучаемой группе должна быть отнесена на счет приобретенного иммунитета, а не обусловлена присутствием антибиотиков в тканях организма.
В следующей серии экспериментов оценивали защитное действие антигенов В. burgdorferi, очищенных описанными способами. Песчанки были подвергнуты двукратной внутрибрюшинной иммунизации, с двухнедельным промежутком между отдельными иммунизациями, 10 мкг антигена, смешанного с адъювантом - гидроокисью алюминия. Через 2 недели после последней иммунизации животных подвергли внутрибрюшинному контрольному заражению 2·107 вирулентными бактериями В. burgdorferi, штамм Orth-1; одновременно такому же заражению подвергли контрольную группу неиммунизованных животных. Спустя 2 недели животных умертвили и культивировали образцы тканей, взятых из мочевого пузыря, селезенки, почек и сердца, с целью обнаружения в этих культурах спирохет. Культуры регулярно обследовали на протяжении 8 недель.
Тестирование были подвергнуты ospA, ospB, pC и белок внешней поверхности с массой 63 кд. Все эти белки были выделены из штамма Orth-1, которыми производилось заражение. Защитный эффект явно просматривался только для тех животных, которые были иммунизованы белком pC. Хотя не наблюдалось абсолютной защиты, инфекция у животных, иммунизованных pC, была менее сильной, и ей оказался подвержен меньший процент животных. Культуры тканей сердца и почек, взятых у иммунизованных животных, давали отрицательный результат на присутствие в них В. burgdorferi, в сравнении с контрольной группой, где наблюдался 50-% -ный уровень заражения этих органов. Аналогично, уровень заражения селезенки у иммунизованных животных был снижен примерно вдвое по сравнению с контрольной группой, где он составлял примерно 70% Только для наиболее подверженного заражению органа, а именно мочевого пузыря, не наблюдалось существенных изменений числа зараженных культур соответствующих тканей. OspA, ospB и белок с массой 63 кд оказались совершенно неэффективными. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 1.
Следующий эксперимент был проведен так же, как и вышеописанный, но с той разницей, что дозу, используемую для заражения, снизили до 106 микроорганизмов. При иммунизации белок pC обеспечивал полную защиту. Напротив, иммунизация ospA белком с массой 21 кд или белком с массой 94 кд не обеспечивала никакой защиты. Как следует из табл. 2, защитный эффект наблюдался для всех песчанок, иммунизованных белком pC, в то время как ни для одной из песчанок, иммунизованных ospA, белком с массой 21 кд или белком с массой 94 кд, не наблюдался сколько-нибудь отчетливо выраженный эффект.
Пример 4. Охарактеризование белка pC, как липопротеина.
В. burgdorferi, выращенные в присутствии 3H-пальмитиновой кислоты, включают эту меченную радиоактивной меткой жирную кислоту в свои липопротеины. Эти меченые липопротеины разделяют с помощью ДСН-ПАГЭ и идентифицируют флюорографически. Один такой липопротеин, идентифицированный в штамме Orth-1, имеет такую же кажущуюся молекулярную массу (около 24 кд), что и белок pC этого штамма. При обработке меченных 3H-пальмитиновой кислотой цельных клеток штамма Orth-1 B. burgdorferi трипсином с последующим ДСН-ПАГЭ анализом наблюдается характерная двойная полоса, соответствующая частично гидролизованному белку pC. Вестерн-блотирование этого материала pC-специфическими моноклональными антителами подтверждает, что эти полосы действительно относятся к белку pC. Этот дублет, характерный для белка pC, обнаружен также при флюорографическом анализе материала, обработанного трипсином. Аналогичный эксперимент с использованием протеиназы К, которая существенно уменьшает количество ассоциированного с клетками белка pC, приводит к почти полному исчезновению липопротеина с массой 24 кд. Эти данные, проиллюстрированные фиг. 2, подтверждают, что белок pC является липопротеином.
Методические подробности.
Внесение радиоактивной метки в клетки В. burgdorferi: клетки штамма Orth-1 В. burgdorferi (3,5 мл культуры, содержащей 1.6х107 клеток/мл) выращивают в среде BSK с добавкой, содержащей радиоактивную метку пальмитиновой кислоты (70 мкл 3H-пальмитиновой кислоты, 55 Ки/ммоль; 1 мКи/мл) в течение 48 часов при 33oC, дважды промывают буфером ФСБ/5мМ MgCl2 и ресуспендируют каждую аликвоту в 190 мкл буфера ФСБ/MgCl2.
Протеолитический гидролиз: к 190 мкл клеточной суспензии добавляют 10 мкл или ФСБ/MgCl2 (контроль), или 62,5 мкг трипсина в 1 мМ HCl, или 62,5 мкг протеиназы К в воде. Образцы инкубируют при встряхивании при температуре 25oC в течение 50 минут (протеиназа К) или в течение 100 минут, после чего добавляют 2 мкл ФМСФ (50 мг фенилметилсульфонилфторида/мл в этаноле). Клетки осаждают центрифугированием (10 мин, 8000g) ) и дважды промывают 500 мкл ФСБ/5 мМ MgCl2/0,5 мг/мл ФМСФ для удаления продуктов гидролиза.
Анализ образцов: стандартными методами осуществляют ДСН-ПAГЭ и вестерн-блоттирование. Клетки, используемые для флюорографии, инкубируют на 1 час в EN3HANCE (NEN), 30 минут промывают водой, сушат при 65oC в течение 2 часов и экспонируют, используя Hyperfilm МР (Амершам), при -80oC.
Пример 5. Экспрессия рекомбинантного белка pC.
ДНК экстрагируют из штамма Orth-1 В. burgdorferi, частично гидролизуют с помощью Sau ЗА, фракционируют по размерам и клонируют в сайт Bam Н1 вектора pUC18. Тестирование осуществляют с помощью зонда олигонуклеотидной гибридизации, обнаруженный ген секвенируют.
Перед клонированием в вектор экспрессии ген pC амплифицируют полимеразной реакцией синтеза цепи (ПРСЦ).
Используют следующие праймеры ПРСЦ.
Праймер 1, соответствующий началу открытой рамки считывания pC (стартовый кодон выделен)

Праймер 2, соответствующий концу открытой рамки считывания pC (стоп-кодон выделен)

Реакцию ПРСЦ проводят, следуя инструкциям производителя, используя VentR ДНК-полимеразу (Нью Ингленд Биолабз). Ренатурацию праймеров к матричной ДНК (рекомбинантная плазмида pUC18 с полученным из В. burgdorferi фрагментом ДНК, содержащим ген pC вместе с фланкирующей ДНК) проводят при 57oC и удлиняют праймеры при 74oC. Всего было осуществлено 25 циклов продолжительностью 1 мин каждый, после чего образец нагревали при 50oC в течение 5 мин.
Белок pC экспрессируют в виде гибрида со связывающим мальтозу белком (СМБ), используя коммерчески доступную экспрессирующую систему (Нью Ингленд Биолабз).
Конструирование гибридных плазмид.
ПРСЦ-амплифицированный ген pC внедряют ниже гена malE (в направлении 5'-3'), присутствующего в плазмидных векторах экспрессии рМAL-р2 и pMaL-c2 (100 нг плазмидной ДНК расщепляют рестриктазой Xmn 1 и лигируют с 20 нг продукта ПРСЦ, т. е. с геном pC). Лигированную ДНК трансформируют α -комплементирующего хозяина Е. coli (например, TBI или DН5a) и отбирают клоны, содержащие ген pC, на LB-агаре, содержащем ампициллин и X-gal. Введение гена pC в клонирующий вектор, придающее стойкость к ампициллину, прекращает male lacz a слияние и приводит к изменению фенотипа колонии (изменение окраски с голубой на белую) при выбранных условиях тестирования. Конструкции, содержащие ген pC в правильной ориентации по отношению к tac-промотору вектора, экспрессируют гибридный белок pC-СМБ, что было подтверждено вестерн-блотированием специфическими для pC моноклональными антителами. Гибридный белок pC-СМБ вырабатывается и с сигнальным пептидом (рМАL-р2), направляющим гибридный белок к периплазме, и без сигнальной последовательности, в каковом случае белок слияния остается в цитоплазме (pMaL-c2). Уровень цитоплазматической экспрессии выше, чем периплазматической, но последняя потенциально предпочтительнее, так как дает растворимый продукт.
Очистка рекомбинантного pC.
Сырые экстракты, содержащие периплазматически и цитоплазматически экспрессированный pC-СМБ, получают согласно описаниям производителя. Гибридный белок очищают аффинной хроматографией, используя то свойство, что СМБ специфически связывается с амилозной аффинной смолой. СМБ отщепляют от гибридного белка pC-СМБ, получая полный белок pC, поскольку гибридный белок содержит единственный участок узнавания для протеазного фактора Ха, который расположен рядом с началом аминокислотной последовательности pC. Образующийся при этом СМБ, а также остатки нерасщепленного гибридного белка удаляют пропусканием через амилозную смолу (СМБ связывается с ней, а pC нет). Можно также использовать другие методы очистки, пригодные для pC, например ионообменную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию, аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом.
Согласно этому способу получаемый белок pC является полным. Вместе с тем, используя соответствующие праймеры ПРСЦ, можно получать "усеченные" формы белка pC (например, без мнимой лижерной последовательности).
Формула изобретения: 1. Иммуногенная композиция против боррелиоза Лайма, содержащая иммуногенно активные белки Borrelia burgdorferi и физиологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве иммуногенно активного белка она содержит одну или несколько серологических форм белка pC бактерии Borrelia burgdorferi в гомогенной форме, вариант pC белка или его миметик в эффективном количестве.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит иммуногенно активные белки в количестве от 1 до 100 мкг на одну дозу.
3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит иммуногенно активные белки в количестве от 10 до 50 мкг на одну дозу.
4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит адьювант.
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что в качестве адьюванта она содержит гидроокись алюминия.
6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит один или несколько антигенов B. burgdorferi, отличных от белка pC.
7. Способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза Лайма, предусматривающий введение иммуногенной композиции в организм млекопитающего, отличающийся тем, что в качестве иммуногенной композиция используют композицию по пп. 1 6.
8. Способ получения белка pC B. burgdorferi, предусматривающий разрушение клеток B. burgdorferi, фракционирование мембранного компонента, ресуспендирование его в неденатурирующем детергенте с последующим выделением растворимого белка и очисткой, отличающийся тем, что очистку проводят ионообменной хроматографией и фракции, содержащие целевой белок, концентрируют путем гидроксилапатитной хроматографии.
9. Диагностический агент для обнаружения B. burgdorferi в образце, отличающийся тем, что он представляет собой белок B. burgdorferi, полученный способом по п. 8.
10. Агент по п. 9, отличающийся тем, что образец представляет собой жидкость тела млекопитающего.
11. Способ обнаружения антител к B. burgdorferi в образце жидкости тела, предусматривающий инкубацию образца с диагностическим агентом, отличающийся тем, что образец инкубируют с диагностическим агентом по п. 9.