Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ - Патент РФ 2103346
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: биотехнология, микробиология. Сущность изобретения: новый штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F - 722 - продуцент лимонной кислоты, который способен синтезировать лимонную кислоту с 80% выходом от содержащегося в среде этилового спирта, 110%- ным от смеси этилового спирта и сахарозы. Использование штамма позволяет применять в качестве углеродсодержащего субстрата сахаросодержащие среды с повышенным содержанием этилового спирта.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2103346
Класс(ы) патента: C12N1/14, C12P7/48
Номер заявки: 96113685/13
Дата подачи заявки: 27.06.1996
Дата публикации: 27.01.1998
Заявитель(и): Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ
Автор(ы): Винаров А.Ю.; Сидоренко Т.Е.; Сметанина С.Е.; Яшина В.Н.
Патентообладатель(и): Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ
Описание изобретения: Предлагаемое изобретение относится к области микробиологической промышленности и представляет новый непатогенный штамм гриба Aspergillus niger (ВСБ-945(2)), способный синтезировать лимонную кислоту при глубинном культивировании.
Лимонная кислота, полученная микробиологическим путем, находит применение как в пищевой, так и в легкой промышленностях.
Лимонная кислота может образовываться в результате метаболизма грибных, дрожжевых, бактериальных культур (Journal of science, 1986, 51, n 2, Биотехнология, 1992, 1, с. 46-49, заявка ФРГ N 3417777, заявка Великобритании N 1603887).
В качестве источника углерода при биосинтезе лимонной кислоты чаще всего используют пищевые источники углерода: сахар, мелассу, а в качестве продуцентов гриб Aspergillus niger. Однако с точки зрения экономической эффективности использование таких непищевых источников углерода, как этиловый спирт предпочтительнее. Существующие штаммы микроорганизмов не способны эффективно синтезировать лимонную кислоту, используя технический спирт в повышенных концентрациях в среде.
Наиболее близким по биосинтетической активности является штамм Aspergillus niger F-710. При выращивании этой культуры на сахарозе выход лимонной кислоты составляет 90-95% (Авчиева П.Б., Винаров А.Ю., Козлова И.А. Биосинтез лимонной кислоты из глюкозы при непрерывной ферментации Asporgillus niger. Прикладная биохимия и микробиология. Т.29, 1993, вып. 4, с. 567-575), однако на этиловом спирте лимонная кислота синтезируется этим штаммом с выходом 50%, при этом концентрация в среде этилового спирта больше 2,5% ингибирует рост культуры, что усложняет проведение процесса ферментации.
В связи с изложенным задача предлагаемого изобретения заключалась в селекции активного непатогенного штамма гриба Aspergillus niger, характеризующегося производственными свойствами, способностью синтеза лимонной кислоты на этиловом спирте и сахарозе, высокой продуктивностью, технологичностью при выращивании.
Предлагаемый новый штамм гриба Aspergillus niger F-722 получен автоселекцией штамма Aspergillus niger F-710 на минеральной питательной среде, содержащей этиловый спирт 4-6%, сахарозу 3%, сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, сернокислый магний 0,5 г/л, сернокислый цинк семиводный 0,01 г/л.
Посев клеток производился двухсуточной культурой гриба Aspergillus niger F-710 по 1 петле на жидкую питательную среду (100 мл). Выращивание вели при перемешивании, аэрации, температуре 30oC в течение 45 сут.
В процессе выращивания и в конце выращивания определяли содержание лимонной кислоты методом окислительного бромирования, основанного на образовании пентабромацетона с последующим спектральным анализом.
Ив двух полученных суспензий (4% этилового спирта и 6% этилового спирта) были посеяны культуры на сусло-агар, на качественную среду с добавлением индикатора бромкрезолзеленого.
Разведения подбирали так, чтобы вырастало 50-80 колоний. Из каждой экспозиции выбирали колонии, которые окрашивали в ярко-желтый цвет. Отобранные 20 культур грибов выращивали на питательной среде приведенного вышe состава в течение 7 сут. В культуральной жидкости определяли содержание лимонной кислоты. На основании полученных результатов был отобран штамм гриба Aspergillus nuger ВСБ-945(2).
Приспособившийся к потреблению этилового спирта в высоких концентрациях штамм проверяли на устойчивость вновь приобретенного свойства. Он пересевался на жидкую питательную среду, содержащую источники минеральных солей, азота, фосфора, а также источники углерода: этиловый спирт, сахарозу, взятых в различных концентрациях.
При пересеве клеток Aspergillus niger ВСБ-945(2) на агаровую среду с концентрацией 4% этилового спирта клетки приспособившегося штамма образуют колонии большего размера, чем клетки гриба Aspergillus niger F-710 через трое суток выращивания.
Определение систематического положения отобранного штамма, проведенное в соответствии с определителем грибов (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology - Baltimore. Hong-Kong : London : Sydney, 1989,V. 1,2,3,4).
Определение степени патогенности селекционированного штамма Aspergillus niger подтвердило отсутствие патогенности.
Характеристика штамма грибов Aspergillus niger F-722.
Культуральные признаки: колонии на сусло-агаре белые, мохнатые, через трое суток наблюдается образование спор коричневого цвета при Т-30oС. При выращивании на среде Чапека при Т = 28oC, рH 6,0 образуется разветвленный мицелий гриба без зернистых включений. На МПА рост отсутствует.
Морфологические признаки: мицелий состоит из гиф, переплетенных между собой, бесцветных, диаметр гиф 3-6 мкм. При поверхностном росте возвышаются органы плодоношения - конидиеносцы, представляющие собой утолщенные несептированные гифы длиной до 2000 мкм.
Физиолого-биохомические признаки: ассимилирует этиловый спирт, сахарозу, глюкозу. Не нуждается в витаминах и в факторах роста. Расчет при температуре 20-40oC, оптимальные значения 28-30oC, растет при pH 1,0-7,0, оптимальные значения 5,8-6,2.
Штамм Aspergillus niger ВСБ-945(2) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института Генетики под номером F-722.
Штамм Aspergillus niger F-722 был испытан в камеральных условиях в ферментере Y 20 л, Т = 130oC, n = 400 об/мин при аэрации 0,3 м3/ч, PH 1,5-6,5 на синтетической питательной среде, следующего состава: этиловый спирт 3%, сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, сернокислый магний 0,5 г/л, сернокислый цинк семиводный 0,012 г/л, в течение 30 ч, при этом этиловый спирт вносили дробно: концентрация этилового спирта в среде не превышала 2,5%. Засевную биомассу готовили путем выращивания двухсуточной культуры грибов на вышеприведенной среде.
Для сравнительной оценки исследования были проведены со следующими штаммами гриба: Aspergillus niger F-710, Aspergillus niger F-228.
При выращивании гриба Aspergillus niger F-722 на питательной среде, содержащей этиловый спирт, синтезировал лимонную кислоту с выходом 80% от поданного субстрата, в то время как штаммы грибов F-228, F-710 показали низкую синтетическую активность (выход составил 48% и 52% соответственно).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Пример 1. Штамм гриба Aspergillus niger F-722 культивировали в лабораторном ферментере с рабочим объемом 20 л на минеральной среде, следующего состава: сернокислый аммоний 2 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л, магний сернокислый 0,5 г/л, сернокислый цинк 0,012 г/л. В среду вносили 2% этилового спирта, 7% сахарозы. Выращивание вели при Т = 32oC, исх. pH 6,5 при перемешивании 400 об/мин, аэрации 0,4 м3/ч., PH не поддерживали. В результате эксперимента было синтезировано 100 г/л лимонной кислоты, выход составил 110%.
Пример 2. Штамм гриба Aspergillus niger F-722 выращивали также, как в примере 1, только в питательной среде содержалось 4% этилового спирта, 6% сахарозы. Выход продукта биосинтеза - лимонной кислоты составил 93%.
Пример 3. Штамм Aspergillus niger F-710 выращивали также, как в примере 1, при этом выход лимонной кислоты от поданных углеродсодержащих субстратов составил 90%.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Aspergillus niger F-722 является этанол-ассимилирующим продуцентом лимонной кислоты, характеризующийся следующими отличительными признаками от прототипа Aspergillus niger F-710:
синтезирует лимонную кислоту на питательной среде, содержащей повышенные концентрации этилового спирта и сахарозы, при этом выход от субстратов составляет 90-110%;
устойчив по своим морфолого-культуральным и физиологическим свойствам.
На основании данных приведенных исследований штамм гриба Aspergillus niger F-722 рекомендован в качестве нового продуцента лимонной кислоты.
Формула изобретения: Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-722 продуцент лимонной кислоты.