Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  –¬“N II, ќѕ–≈ƒ≈Ћяёўјя —»Ќ“≈«  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA- “»ѕј, —ѕќ—ќЅ ≈≈  ќЌ—“–”»–ќ¬јЌ»я » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… PSEUDOMONAS PUTIDA, —ќƒ≈–∆јў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќ”ё ѕЋј«ћ»ƒ” ƒЌ  –¬“N II-ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA-“»ѕј, ј “»¬Ќќ√ќ ѕ–ќ“»¬ Ќј—≈ ќћџ’ ќ“–яƒј COLEOPTERA - ѕатент –‘ 2103363
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  –¬“N II, ќѕ–≈ƒ≈Ћяёўјя —»Ќ“≈«  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA- “»ѕј, —ѕќ—ќЅ ≈≈  ќЌ—“–”»–ќ¬јЌ»я » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… PSEUDOMONAS PUTIDA, —ќƒ≈–∆јў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќ”ё ѕЋј«ћ»ƒ” ƒЌ  –¬“N II-ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA-“»ѕј, ј “»¬Ќќ√ќ ѕ–ќ“»¬ Ќј—≈ ќћџ’ ќ“–яƒј COLEOPTERA
–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  –¬“N II, ќѕ–≈ƒ≈Ћяёўјя —»Ќ“≈«  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA- “»ѕј, —ѕќ—ќЅ ≈≈  ќЌ—“–”»–ќ¬јЌ»я » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… PSEUDOMONAS PUTIDA, —ќƒ≈–∆јў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќ”ё ѕЋј«ћ»ƒ” ƒЌ  –¬“N II-ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA-“»ѕј, ј “»¬Ќќ√ќ ѕ–ќ“»¬ Ќј—≈ ќћџ’ ќ“–яƒј COLEOPTERA

–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  –¬“N II, ќѕ–≈ƒ≈Ћяёўјя —»Ќ“≈«  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA- “»ѕј, —ѕќ—ќЅ ≈≈  ќЌ—“–”»–ќ¬јЌ»я » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… PSEUDOMONAS PUTIDA, —ќƒ≈–∆јў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќ”ё ѕЋј«ћ»ƒ” ƒЌ  –¬“N II-ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“  –»—“јЋЋ»„≈— ќ√ќ »Ќ—≈ “»÷»ƒЌќ√ќ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј CRY IIIA-“»ѕј, ј “»¬Ќќ√ќ ѕ–ќ“»¬ Ќј—≈ ќћџ’ ќ“–яƒј COLEOPTERA

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: биотехнологи€, получение средств защиты растений в отношении жесткокрылых насекомых на основе рекомбинантных грамотрицательных бактерий. —ущность изобретени€: —конструирована рекомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  pBT N 11, определ€юща€ синтез кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина Cry IIIA - типа и на ее основе получен штамм бактерий Psendomonas putida, содержащий вышеуказанную плазмиду, продуцирующий дельта-эндотоксин Cry IIIA - типа, активный в отношении насекомых отр€да Coleoptera. 3 с.п. ф-лы, 3 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2103363
 ласс(ы) патента: C12N15/32, C12N15/78, C12N15/32, C12R1:40, A01N63/00, C12N1/20
Ќомер за€вки: 95119335/13
ƒата подачи за€вки: 23.11.1995
ƒата публикации: 27.01.1998
«а€витель(и): √осударственное федеральное предпри€тие √осударственный научный центр прикладной микробиологии
јвтор(ы): ƒобрица ј.ѕ.;  орецка€ Ќ.√.;  очетков ¬.¬.; —веточ ќ.≈.; Ћосева ќ.».
ѕатентообладатель(и): √осударственное федеральное предпри€тие √осударственный научный центр прикладной микробиологии
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к области биотехнологии и, в частности к генетической инженерии и может быть использовано в производстве препаратов против колорадского жука и других насекомых отр€да Coleoptera.
»звестен штамм бактерий Bacillus thuringiensis - продуцент дельтаэндотоксина Cry IIIA - типа против колорадского жука (SU патент N 1814520 кл. A 01 N 63/00).
ќднако данный штамм имеет те же недостатки, что и другие природные штаммы Bacillus thuringiensis.
Ѕиоинсектициды, создаваемые на их основе содержат жизнеспособные споры и кристаллические включени€ токсина, освобождающиес€ при лизисе спорулирующих клеток. “оксин в таких препаратах быстро разрушаетс€ под воздействием природных факторов, а внесение в окружающую среду значительных количеств спор может в конечном счете негативно вли€ть на экологическую обстановку.
»звестны штаммы Bacillus thuringiensis, синтезирующие белки, токсичные против насекомых отр€да Coleoptera и известны последовательности этих токсинов и кодирующих их генов (≈– N 0498537 A 2, C 12 N 15/32, 1992 и за€вка PCT WO 91/14778, c 12 N 15/32, 1991). ¬ цитируемых документах предлагаютс€ возможные способы использовани€ данных штаммов, генов дельта-эндотоксинов и кодируемых ими продуктов, включа€ конструирование новых рекомбинантных микроорганизмов.
ќднако в этих источниках не содержитс€ подробной информации о способах конструировани€ новых штаммов и их характеристиках.  роме того, данные гены кодируют токсины, отличные от токсина Cry IIIA - типа, продуцируемого за€вл€емым штаммом P. putida.
Mycogen Corporation осуществл€ет разработку и испытание инкапсулированных биопестицидов на основе убитых клеток Pseudomonas fluoresoens, в том числе клеток с Cry IIIA - белком. ќднако конкретные данные относительно системы регул€ции и уровн€ экспрессии клонированных Cry-генов в рекомбинантных штаммах псевдомонад не сообщаютс€.
(Feitelson J. , Payne J., Kim L.// Bio/ Technol., 1992, v.10, p. 271 - 275).
ќднако конкретные данные относительно системы регул€ции и уровн€ экспрессии клонированного cry-гена в рекомбинантных штаммах псевдомонад, не сообщаютс€.
«адача предлагаемого изобретени€ - конструирование рекомбинантной плазмидной ƒЌ , кодирующей синтез инсектицидного белка и создание штамма Pseudomonas putida - продуцента кристаллического дельта-эндотоксина, активного против колорадского жука и других насекомых отр€да Coleoptera.
—оздана плазмида pBTN11, кодирующа€ дельта - эндотоксин Cry IIIA -типа и способна€ поддерживатьс€ в клетках различных грамотрицательных бактерий, состо€ща€ из следующих элементов:
полной последовательности сконструированной векторной плазмиды pBTN4 (размер 14,8 т.п.н.) с широким кругом бактериальных хоз€ев;
полной последовательности HindIII-фрагмента ƒЌ  B.thuringiensis subsp. tenebrionis (размер 3,0 т.п.н.) и содержит:
интактный ген дельта-эндотоксина B.thuringiensis subsp. tenebrionis;
ген устойчивости к канамицину (Kmr);
гены, ответственные за мобилизацию плазмиды при конъюгативном переносе (oriT, mob);
промотор гена cryIA(b) B. thuringiensis subsp. berliner 1715;
промотор Pm оперона мета-пути деградации ароматических углеводородов плазмиды pWWO;
ген xylS, участвующий в позитивной регул€ции этого оперона;
сайты расщеплени€ эндонуклеазой PstI с координатами 0; 5,3; 5,7, 7,1 и 17,8 т.п.н.;
сайты расщеплени€ эндонуклеазой HindIII с координатами 2,4, 6,5 и 9,5 т. п.н.;
сайты расщеплени€ эндонуклеазой BamHI с координатами 3,2; 4,8 и 6,0 т.п. н.;
сайты расщеплени€ эндонуклеазой BglII с координатами 3,6 и 9,4 т.п.н.;
сайты расщеплени€ эндонуклеазой EcoRI с координатами 6,0; 8,1; 8,8 и 9,8 т.п.н.;
–азмер плазмиды pBTN11 равен 17,8 т.п.н.
—пособ конструировани€ плазмиды pBTN11, кодирующей синтез Coleoptera-специфического эндотоксина, заключающейс€ том, что ƒЌ  плазмиды pBTO22, несущей ген cryIA(b) B. thuringiensis subsp. berliner 1715, расщепл€ют эндонуклеазой Clal, смешивают с ƒЌ  плазмиды pC194, подвергнутой частичному гидролизу Taql, фрагменты ƒЌ  соедин€ют с помощью ƒЌ -лигазы и полученной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и трансформанты высевают на агаризованную среду, содержащую ампициллин (Ap) и хлорамфеникол (Cm), и из клеток устойчивых к Am и Cm клонов выдел€ют ƒЌ  плазмиды pBTO3, в структуре которой меньший Clal-фрагмент плазмиды pBTO22 заменен на фрагмент pC194, состо€щий из трех Taql (A, D и E) фрагментов, ƒЌ  плазмиды pBTO3 и экспрессирующего вектора с широким кругом бактериальных хоз€ев - плазмиды pNM185 - гидролизуют EcoRI, продукты гидролиза соедин€ют с помощью ƒЌ -лигазы и после трансформации клеток E.coli клоны, содержащие гибридную плазмиду, отбирают по устойчивости к канамицину и хлорамфениколу, отобранные клоны провер€ют на отсутствие индуцируемой 3-метилбеназоатом (0,5 - 1 мћ) устойчивости к стрептомицину и из полученных клонов выдел€ют ƒЌ  плазмиды pBTN3, в структуре которой ориентации промоторов Pm и cryIA(b) - гена совпадают, ƒЌ  плазмиды pBTN3 подвергают частичному гидролизу эндонуклеазой ClaI и обрабатывают ƒЌ -лигазой фага T4, полученным препаратом трансформируют клетки E.coli и отбирают клоны, устойчивые к канамицину, но неспособные расти на среде с хлорамфениколом, из этих клонов выдел€ют ƒЌ  плазмиды pBTN4, затем ƒЌ  плазмиды pUC19 и B. thuringiensis subsp. tenebriones расщепл€ют HindIII, образовавшиес€ фрагменты лигируют, трансформируют лигазной смесью клетки E.coli JM103 и отбирают бесцветные колонии на среде ћак- онки с ампициллином, отобранные клоны провер€ют на наличие последовательностей ƒЌ , гомологичных соответствующим последовательност€м cryIIIA-гена B. thuringiensis subsp. tenebrionis, из клонов, содержащих эти последовательности, выдел€ют ƒЌ  плазмиды PBTT51 с cryIIIA-геном, смесью ƒЌ  pBTT51 и pBTN4, последовательно обработанной эндонуклеазой HindIII и ƒЌ -лигазой, трансформируют клетки E.coli, отбирают устойчивые к канамицину клоны, провер€ют их на индуцируемую 3-метилбеназоатом устойчивость к стрептомицину, и из клеток чувствительных к стрептомицину клонов выдел€ют плазмиду pBTN11, содержащую HindIII-фрагмент c cryIIIA-геном в пр€мой ориентации к промотору Pm.
—оздан штамм:
Pseudomonas putida IPM-36, содержащий рекомбинантную плазмиду ƒЌ  pBTNII - продуцент кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина Cry IIIA - типа, активного против насекомых отр€да Coleoptera. Ўтамм депонирован в ÷ентральной коллекции микроорганизмов –оссийского акционерного общества "Ѕиопрепарат", регистрационный номер - ÷ ћ ¬ - 63 »
Ўтамм P.putida IPM-36 получен в результате трансформации плазмиды pBTN11 в клетки штамма E.coli S17 - 1 и последующего конъюгационного переноса этой плазмиды из E.coli S17-1 (pBTN11) в клетки штамма P. putida BS1356.
ѕолученный штамм характеризуетс€ следующими признаками.
 ультурно-морфологические признаки.
 летки палочковидные, размером (2,0 - 3,2) х (0,7 - 0,9) мкм, подвижные, перетрихи, грамотрицательные, спор не образуют. (–азмеры клеток даны дл€ односуточной культуры, выращенной на ћѕј при 30oC.)
Ўтамм хорошо растет на следующих средах: ћѕЅ (м€сопептонный бульон), LB (триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, pH 7,2),  инга B (пептон - 20 г/л, глицерин - 10 мл/л, MgSO4 x 7H2O - 1,5 г/л), питательном агаре на основе гидролизата кильки (ƒ»ѕ—, г. ћахачкала) - 35 г/л, на минимальной синтетической среде M9 следующего состава: K2HPO4 - 7 г/л; KH2PO4 - 3 г/л; NH4Cl - 1 г/л; глюкоза - 1 г/л.
Ќа м€со-пептонном агаре колонии гладкие, блест€щие, с ровными кра€ми. ¬ м€со-пептонном бульоне наблюдаетс€ помутнение, осадок и желто-зеленый флуоресцирующий пигмент.
Ќа стандартных средах  инга продуцирует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, феназиновые пигменты не образует.
‘изиолого-биохимические признаки.
ќблигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30oC, не растет при 42oC, оптимум pH 6,8 - 7,6.
Ќитраты редуцирует, молоко не пептонизирует, не использует в качестве источников углерода трегалозу, и д-коилозу, утилизирует этиловый спирт.
јссимилирует аммонийный и нитратный азот. ¬ качестве источника углерода использует д-глюкозу, д-фруктозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, ацетат, пропинат, бутират, сукцинат, пируват, фумарат, бензоат, лактат, цитрат, катехол, протокатехоат.
ќксидазна€ реакци€ положительна€.
јргининдегидролаза присутствует.
”стойчивость к антибиотикам.
ѕро€вл€ет устойчивость к канамицину (50-100 мкг/мл) и стрептомицину (200 мкг/мл), обусловленную присутствием плазмиды pBTN11, а также устойчивость к ампициллину (500 мкг/мл).
”слови€ хранени€ штамма.
Ўтамм может хранитьс€ в лиофильно-высушенном состо€нии или в 0,6%-агаризованной среде (Nutrient Broth (Difco) - 4 г/л, NaCl - 5 г/л, агар - 6 г/л, pH 6,8) под вазелиновым маслом.
Ўтамм не патогенен дл€ теплокровных животных.
ѕолученный штамм Pseudomonas putida IPM-36- продуцент дельта-эндотоксина обладает следующими преимуществами перед B. thuringiensis:
возможность защиты энтомотоксина от действи€ факторов внешней среды клеточной стенкой продуцента в св€зи с его внутриклеточной локализацией;
уменьшение возможных отрицательных последствий дл€ окружающей среды при использовании препаратов на основе инактивированных вегетативных клеток по сравнению с препаратами, содержащими кристаллы и споры;
повышение продуктивности и технологичности при производстве.
Ќа фиг. 1 представлена схема получени€ векторной плазмиды pBTN4; на фиг. 2 - карта плазмиды pBTN11; на фиг. 3 - клетки P. putida IPM-36 с внутриклеточными включени€ми энтомоцидного белка.
ѕример 1.  онструирование рекомбинантной плазмиды pBTN11.
¬ыдел€ют плазмидные ƒЌ  из клеток E.coli и Bacillus cereus с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цези€ в присутствии бромистого этиди€.
ƒЌ  плазмиды pBTO22 гидролизуют рестрикционой эндонуклеазой ClaI при 37oC в буфере A (10 мм трис-HCl, pH 7,5, 10 мћ MgCl2, 1 мћ дитиотрейтол). ƒЌ  плазмиды pC194 подвергают частичному расщеплению рестриктазой Taql при 65oC в том же буфере. ¬ инкубационную смесь внос€т 5 ћ раствор NaCl до конечной концентрации 0,1 ћ, ƒЌ  осаждают добавлением двух объемов этанола и раствор€ют в буфере “≈ (10 мћ трис-HCl, pH 7,4, 1 мћ Ёƒ“ј, pH 8,0).
√идролизаты ƒЌ  pBTO22 и pC194 смешивают в соотношении 1:5, добавл€ют буфер дл€ лигировани€ (конечна€ концентраци€ - 66 мћ трис-HCl, pH 7,5, 5 мћ MgCl2, 5 мћ дитиотрейтол, 1 мћ ј“‘) и ƒЌ -лигазу фага “4 (1 ед/мкг ƒЌ ).  онцентраци€ ƒЌ  составл€ет 50-100 мкг/мл, объем инкубационной смеси - 50 мкл. –еакцию провод€т при 8oC в течение ночи. ѕолноту гидролиза и лигировани€ ƒЌ  контролируют с помощью электрофореза в геле 0,7% агарозы.
ƒл€ получени€ компетентных клеток, культуру клеток Escherichia coli DH5 α выращивают в среде LB при 37oC до середины логарифмической фазы роста.  летки осаждают центрифугированием. (Ёту и дальнейшие операции провод€т при 2-4oC). ќсадок ресуспендируют в 1/2 первоначального объема 10 мћ раствора CaCl2, выдерживают 20 мин и после центрифугировани€ ресуспендируют в 1/50 первоначального объема 50 мћ CaCl2. „ерез 12-24 ч хранени€ при 2-4oC 0,2 мл суспензии смешивают с 10 мкл раствора лигированной ƒЌ  (10-50 мкг/мл) и инкубируют 30-60 мин на льду. “рансформационную смесь перенос€т на 2 мин в вод€ную баню при 42oC, добавл€ют к суспензии 1 мл LB, инкубируют 1 ч при 37oC и высевают на агаризованную среду LB с хлорамфениколом (5 мкг/мл).
„ашки инкубируют при 37oC в течение 20-24 ч, выросшие колонии отбирают, из полученных клонов выдел€ют плазмидные ƒЌ  и провод€т рестрикционный анализ выделенных плазмид. –екомбинантную плазмиду, в которой ClaI-фрагмент cryIA(b) гена в плазмиде pBTO22 заменен на фрагмент ƒЌ  pC194, состо€щий из трех TaqI (A, D и E) фрагментов, с пр€мой ориентацией гена хлорамфениколрезистентности (CAT) по отношению к промотору cryIA(b) детерминанта, обозначают как pBTO3.
ƒЌ  плазмид pBTO3 и pNM185 (по 2 мкг) смешивают и обрабатывают эндонуклеазой EcoRI в 50 мкл буфера B (10 мћ трис-HCl, pH 7,5, 50 мћ NaCl, 10 мћ MgCl2, 1 мћ дитиотрейтол). Ћигирование продуктов гидролиза, получение компетентных клеток E. coli DH5lgЋ 50 = lgCм-σ(ΣL-0,5), и трансформацию этих клеток рекомбинантными молекулами ƒЌ  провод€т как описано выше. —успензию трансформированных клеток высевают на агаризованную среду LB с канамицином (50 мкг/мл) и хлорамфениколом (5 мкг/мл).
¬ыросшие колонии перекалывают, дублиру€ чашки с этой средой и средой LB, содержащей канамицин (50 мкг/мл), хлорамфеникол (5 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и 3-метилбензоат (68 мкг/мл), и после выращивани€ в течение 20-24 ч при 30oC отбирают колонии клонов, способных к росту только на среде без стрептомицина. »з клеток этих клонов выдел€ют плазмидные ƒЌ  и провод€т рестрикционный анализ. ѕлазмиду, в которой ориентаци€ промотора Pm и cryIA(b) гена совпадают, обозначают как pBTN3.
ƒЌ  плазмиды pBTN3 подвергают частичному гидролизу рестриктазой ClaI, обрабатывают ƒЌ -лигазой и трансформируют компетентные клетки E. coli DH5σ как описано выше.  летки трансформантов высевают на агаризованную среду LB с канамицином (50 мкг/мл), и выросшие колонии перекалывают, дублиру€ чашки с этой средой и средой, содержащей канамицин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (5 мкг/мл).
»з колоний клонов, не способных к росту на среде с хлорамфениколом, выдел€ют плазмидные ƒЌ  и анализируют их структуру.
ѕлазмиду, представл€ющую собой укороченный вариант плазмиды pBTN3 с делецией ClaI-фрагмента, содержащего ген CAT, обозначают как pBTN4.
»з клеток штамма Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, синтезирующего энтомоцидный белок против личинок колорадского жука, выдел€ют ƒЌ . Ѕактерии выращивают в 1 л среды LB до поздней логарифмической фазы роста при 30oC, клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 50 мл TES-буфера (0,01 ћ “рис-HCl, pH 8,0, 0,001 ћ Ёƒ“ј, 0,1 ћ NaCl) и добавл€ют 5 мл раствора лизоцима (20 мг/мл). —успензию клеток инкубируют при 37oC в течение 30 мин, затем добавл€ют 3 мл 20% раствора додецилсульфата натри€. Ћизат экстрагируют дважды равным объемом смеси хлороформа и изоамилового спирта (24: 1). ѕрепарат ƒЌ  обрабатывают –Ќ -азой (конечна€ концентраци€ 50 мкг/мл) в течение 1 ч при 37oC и осаждают этанолом. „истоту и концентрацию препаратов ƒЌ  определ€ют спектрофотометрически. «атем смешивают 0,1 мкг ƒЌ  pUC19, выделенной из клеток Escherichia coli, и 2 мкг ƒЌ  B. thuringiensis subsp. tenebrionis и гидролизуют рестриктазой HindIII (10 ед) в 50 мкл буфера Ѕ, как указано выше дл€ фермента EcoRI, при 37oC в течение 2 ч. ѕолученные фрагменты ƒЌ  осаждают спиртом, перераствор€ют, лигируют и трансформируют компетентные клетки E. coli JM103, как описано выше.  летки высевают на среду ћак онки (Difco) с ампициллином и отбирают бесцветные колонии.
»з клеток отобранных колоний выдел€ют плазмидные ƒЌ  и, использу€ эти ƒЌ  в качестве матриц, провод€т полимеразную цепную реакцию (ѕ÷–). ѕраймерами в ѕ÷– служат олигодезоксинуклеотиды, имеющие следующую структуру: 5' - GGTTCCAACCAGGATATT - 3' и 5' - CAGACCGCAAGATTTGAT - 3'. ѕервый соответствуют фрагменту cryIIIA - гена B. thuringiensis subsp. tenebrionis с 1034 по 1051 нуклеотид и второй комплементарен последовательности этого детерминанта с 1215 по 1232 нуклеотид. ѕоследовательности ƒЌ , исследуемые на наличие детерминанта Coleoptera-специфического инсектицидного белка, амплифицируют in vitro с помощью полимеразной цепной реакции в 50 мкл реакционной смеси, содержащей ƒЌ  (около 10 нг), праймеры (концентраци€ каждого праймера - 0,3 мкм), 60 мћ трис-HCl, 16 мћ (NH4SO4, 1,5 мћ MgCl2, 1 мћ дитиотрейтол, 0,01% тритона X-100, 0,01% “вин-20, бычий сывороточный альбумин (0,1 мг/мл), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дј“‘, д√“‘, д÷“‘ и д““‘ - по 0,2 мћ) и 2 ед. Tth-полимеразы; pH смеси - 8,8 при 25oC. –еакцию амплификации провод€т под вазелиновым маслом в течение 30 циклов: 94oC - 1 мин, 45oC - 2 мин и 67oC - 2 мин.
ѕродукты ѕ÷– раздел€ют с помощью электрофореза в геле 2,5% агарозы и отбирают клоны, содержащие плазмиды, €вл€ющиес€ матрицей дл€ синтеза фрагментов ƒЌ  размером около 0,2 т.п.н. при использовании в ѕ÷–, представленных выше праймеров. ѕлазмиду, в структуре которой ген дельта-эндотоксина входит в состав HindIII-фрагмента размером около 3 т.п.н. и находитс€ в пр€мой ориентации по отношению к lac-промотору, обозначают как pBTT51.
ƒЌ  плазмид pBTT51 и pBTN4 смешивают в соотношении 10:1 (общее количество - 2 мкг) гидролизуют эндонуклеазой HindIII, полученные фрагменты объедин€ют с помощью ƒЌ -лигазы фага T4 и трансформируют рекомбинантными молекулами ƒЌ  CaCl2-обработанные клетки E. coli DH5ΣL как описано выше. “рансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB с канамицином (50 мкг/мл) и выросшие через 20-24 ч инкубации при 37oC колонии перекалывают, дублиру€, на чашки с этой средой и средой, содержащей дополнительно стрептомицин (100 мкг/мл) и 3-метилбензоат (68 мкг/мл). „ашки инкубируют при 30oC в течение 20-24 ч. »з клеток трансформантов, не способных к росту на среде с стрептомицином и 3-метилбензоатом, выдел€ют плазмидные ƒЌ  и провод€т рестрикционный анализ выделенных ƒЌ . ѕлазмиду, содержащую HindIII-фрагмент с геном энтомотоксина в пр€мой ориентации к промотору Pm обозначают как pBTN11.
—хема конструировани€ векторной плазмиды pBTN4 и карта плазмиды pBTN11 представлены на фиг. 1 и 2.
ѕример 2. ѕолучение штамма-продуцента.
ƒл€ получени€ на основе штамма Pseudomonas putida BS1356 продуцента, способного к индуцированному синтезу энтомоцидного белка в виде "телец включени€" конструируют донорный штамм E. coli S17-1 (pBTN11), из которого плазмида pBTN11 может быть передана путем конъюгации в клетки различных грамотрицательных бактерий. ¬ состав генома E. coli S17-1 вход€т гены tra-системы плазмиды RP4 с этой целью ƒЌ  плазмиды pBTN11 трансформируют компетентные клетки E. coli S17-1, полученные как описано в примере 1. ќтбор трансформантов провод€т на агаризованной среде LB, содержащей канамицин (50 мкг/мл).
—крещиваемые штаммы E. coli S17-1 (pBTN11) и P. putida BS1356 выращивают в течение ночи при 30oC.  ультуры донора и реципиента смешивают в соотношении 1:10 (общий объем 1 мл). —успензию клеток фильтруют через нитроцеллюлозный фильтр (средний диаметр пор - 0,45 мкм, диаметр фильтра - 25 мм) и фильтр помещают на поверхность агаризованной среды LB. »нкубацию провод€т 16 - 20 ч при 30oC, затем клетки смывают с фильтра 1 мл 0,9% раствора NaCl и дл€ отбора трансконъюгантов высевают на чашки со средой, содержащей канамицин (50 мкг/мл) и ампициллин (200 мкг/мл).
¬ клетках трансконъюгантов определ€ют продукцию дельта-эндотоксина с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (»‘ј). ƒл€ построени€ калибровочной кривой в »‘ј используют очищенный препарат кристаллического белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis. –езультаты выражают в процентах от общего содержани€ клеточного белка, растворимого в 0,1 ћ NaOH, определ€емого по Ћоури. ¬ качестве стандартов используют серию разведений кристаллического белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis и бычьего сывороточного альбумина.
ѕример 3. ƒл€ получени€ дельта-эндотоксина свежую 16 ч ночную культуру штамма P. putida IPM-36, полученную инкубированием в среде LB при 30oC развод€т в 100 раз в среде LB с канамицином (25 мкг/мл), раст€т в течение 4 ч при 30oC, добавл€ют 0,5 мћ индуктора 3-метилбенарата и продолжают инкубировать в тех же услови€х еще 16 ч.  оличество дельта-эндотоксина, синтезируемого клетками штамма P. putida IPM-36 в указанных выше услови€х составл€ет 500-700 мг/л или 62% от общего растворимого клеточного белка. ƒельта-эндотоксин локализуетс€ в клетках в виде "телец-включени€" (фиг. 3).
ѕример 4. ќценку инсектицидной активности штамма P. putida IPM-36 провод€т на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) первого или второго возраста, отродившихс€ из одной природной попул€ции.
Ѕактериальную культуру развод€т в 5 раз 0,9% NaCl и готов€т серию из п€ти разведений культуры с шагом 5. ¬ качестве положительного контрол€ используют серию разведений споро-кристаллической смеси B. thuringiensis subsp. tenebrionis, которую получают инкубированием этой бациллы при 30oC сначала в среде LB в течении 16 ч, а затем, после разведени€ в 40 раз, в среде NB или другой среде дл€ спорул€ции еще в течении 48 ч. ¬ приготовленные суспензии опускают листь€ картофел€ примерно одного размера, вынимают, дают им высохнуть при 20oC и помещают в чашки ѕетри. ¬ качестве отрицательного контрол€ используют раствор 0,9% NaCl. Ќа каждое разведение используют по 10 личинок жука и по 2-5 листьев картофел€. ”чет гибели личинок провод€т через 3 сут инкубировани€ в термостате при температуре 21oC и фотопериоде 18 ч.
Ѕиологическую активность штаммов, выраженную в Ћ 50, вычисл€ют по формуле  ербера в процентах концентрации культуральной жидкости ( ∆) в суспензии:
α,
где Cм - максимальна€ из испытанных концентраций;
ΣL - логарифм отношени€ каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведени€);
σ - сумма значений L (доли погибших личинок от числа испытуемых), найденных дл€ всех концентраций с учетом поправки на гибель в контроле по методу јббота:
L = (pо - pk) : (1-pk),
где pо - дол€ погибших личинок при испытании культуры;
pk - дол€ погибших личинок в контрольном опыте.
Ўтамм P. putida IPM-36 по своей инсектицидной активности (Ћ 50 равна 0,13%  ∆) не уступает штамму Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Ћ 50=0,48%  ∆) и даже превосходит его.
ѕредлагаемое изобретение позвол€ет получить новые энтомопатогены на основе грамотрицательных бактерий, в том числе микроорганизмов, колонизирующих растени€, и, в частности псевдомонад, широко представленных в эпифитной микрофлоре. »спользование таких штаммов, благодар€ их высокой колонизирующей активности и внутриклеточной локализации инсектицидного белка, предохран€ющей его от действи€ повреждающих факторов внешней среды, позвол€ет снизить количество вносимого энтомоцидного препарата и уменьшить число обработок.
ѕоложительный эффект предлагаемого изобретени€ достигаетс€ за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды pBTN11, наличию в ее структуре детерминанта инсектицидного белка CryIIIA-типа и генетических элементов, определ€ющих ее способность к передаче путем мобилизации широкому кругу грамотрицательных бактерий, автономной репликации и поддержанию в клетках этих микроорганизмов.
¬озможность индуцированного синтеза целевого продукта, благодар€ включению его детерминанта под контроль промотора Pm, позвол€ет также использовать штаммы Pseudomonas spp. , в том числе предлагаемый штамм P. putida IPM-36, дл€ создани€ энтомоцидных препаратов против колорадского жука и р€да других насекомых отр€да Coleoptera на основе инактивированных клеток бактерий, содержащих большое количество энтомоцидного белка в виде внутриклеточных включений. ”ровень продукции дельта-эндотоксина в клетках P. putida IPM-36 достигает 62% от общего клеточного белка при сохранении его биологической активности (Ћ 50 препаратов дельта-эндотоксина, синтезированных в клетках P. putida IPM-36 и B. thuringiensis subsp. tenebrionis равны соответственно 0,13%  ∆ и 0,48%  ∆). —уществующие способы фиксации бактериальных клеток могут сохран€ть интактной клеточную оболочку, защищающую энтомоцидный белок от действи€ внешних факторов.
ƒругими положительными свойствами предлагаемого штамма P. putida IPM-36 по сравнению с известными продуцентами энтомотоксинов - штаммами Bacillus thuringiensis - €вл€ютс€ возможность получени€ целевого продукта за более короткий период времени (16 - 20 и 40 - 48 ч соответственно), существование дл€ псевдомонад более дешевых питательных сред и технологий их выращивани€, с выходом биомассы, значительно превышающим продуктивность культур Bacillus thuriensis.
‘ормула изобретени€: 1. –екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  р¬“N11, определ€юща€ синтез кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина Cry IIIA-типа и способна€ поддерживатьс€ в клетках различных грамотрицательных бактерий, имеет размер 17,8 т. п. н. и состоит из следующих элементов: полной последовательности (размер N 14 т. п. н. ) расщепленной по EcoRI-сайту плазмиды pNM 185 с широким кругом бактериальных хоз€ев; полных последовательностей двух EcoRI - ClaI-фрагментов плазмиды рpB“022 (размеры фрагментов 0,2 и 0,3 т.п.н.); полных последовательностей двух Tag I-фрагментов плазмиды pC194 (размеры фрагментов 0,16 и 0,08 т.п.н.); полной последовательности Hind III фрагмента ƒЌ  B.thuringiensis subsp. tenebrionis (размер 3 т.п.н.) и содержит интактный ген дельта-эндотоксина B.thuringiensis subsp. tenebriones; промотор гена Cry IA (b) B.thuringiensis subsp. berliner 1715; промотор Pm оперона мета-пути деградации ароматических углеводородов TOL плазмиды pWWO; ген xylS, участвующий в позитивной регул€ции этого оперона; ген устойчивости к канамицину (Kmr); ген устойчивости к стрептомицину (Smr); гены, ответственные за мобилизацию плазмиды дл€ конъюгации (OriT и mob); сайты расщеплени€ эндонуклеазой PstI с координатами 0; 5,3; 5,7 и 7,1 т.п.н. сайты расщеплени€ эндонуклеазой Hind III с координатами 2,4; 6,5 и 9,5 т.п.н. сайты расщеплени€ эндонуклеазой Bam MI с координатами 3,2; 4,8 и 6,0 т.п.н. сайты расщеплени€ эндонуклеазой Bgl 11 с координатами 3,6 и 9,4 т.п.н. сайты расщеплени€ эндонуклеазой EcoR I с координатами 6,0; 8,1; 8,8 и 9,8 т.п.н.
2. —пособ конструировани€ плазмиды pBTN11, заключающийс€ в том, что ƒЌ  плазмиды pB“022, несущей Cry IA (b) ген B.thuringiensis subsp. berliner 1715, расщепл€ют эндонуклеазой Cla I, полученные фрагменты соедин€ют с помощью ƒЌ -лигазы с фрагментами ƒЌ  плазмиды pC194, подвергнутой частичному гидролизу Tag I, и смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки E.coli, трансформанты высевают на среду, содержащую ампициллин и хлорамфеникол, и из клеток клонов, устойчивых к данной комбинации антибиотиков, выдел€ют ƒЌ  плазмиды pB“ќ«, в структуре которой меньше Cla I фрагмент плазмиды pB“022 замещен на фрагмент pC194, состо€щий из трех Tag I (A, D и E)B фрагментов, ƒЌ  плазмиды pB“03 и экспрессирующего вектора с широким кругом бактериальных хоз€ев плазмиды pNM185 гидролизуют EcoR I, продукты гидролиза соедин€ют с помощью ƒЌ -лигазы и после трансформации клеток E.coli клоны, содержащие гибридную плазмиду, отбирают по устойчивости к канамицину и хлорамфениколу, отобранные клоны провер€ют на отсутствие индуцируемой 3-метилбензоатом устойчивости к стрептомицину и из полученных клонов выдел€ют ƒЌ  плазмиды pBTN3, в структуре которой ориентации промоторов Pm и Cly IA (b)-гена совпадают, ƒЌ  плазмиды pB“N3 подвергают частичному гидролизу эндонуклеазой Cla I и обрабатывают ƒЌ -лигазой, полученными препаратами трансформируют клетки E. coli и отбирают клоны, устойчивые к канамицину, но не способные расти на среде с хлорамфениколом, из этих клонов выдел€ют ƒЌ  плазмиды pB“N4, затем смесь ƒЌ  плазмиды p»— 19 и B.thuringiensis subsp. tenebrionis расщепл€ют эндонуклеазой Hind III, лигируют, трансформируют лигазной смесью клетки E.coli Jћ103 и отбирают бесцветные колонии на среде, позвол€ющей дифференцировать Lac+ и Lac--колонии и содержащей ампициллин, отобранные клоны провер€ют на наличие последовательностей ƒЌ , гомологичных соответствующим последовательност€м Cly IIIA гена B.thuringiensis subsp. tenebrionis с помощью полимеразной цепной реакции, из клонов, содержащих эти последовательности, выдел€ют ƒЌ  плазмиды pB““51, содержащей 3 т.п.н. - фрагмент ƒЌ  B. thuringiensis subsp. tenebrionis с Cry IIIA-геном, смесью ƒЌ  pB“N4 и pB““51, последовательно обработанной эндонуклеазой Hind III и ƒЌ -лигазой, трансформируют клетки E. coli, отбирают устойчивые к канамицину клоны, провер€ют их на индуцируемую 3-метилбензоатом устойчивость к стрептомицину и из клеток, чувствительных к стрептомицину клонов, выдел€ют плазмиду pB“N11, содержащую Hind III фрагмент с Cry IIIA-геном в пр€мой ориентации к промотору Pm.
3. Ўтамм бактерий Pseudomonas putida IPM-36, содержащий рекомбинантную плазмиду ƒЌ  pB“N11 продуцент кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина Cry IIIA-типа, активного против насекомых отр€да Coleoptera.