Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКАТАЛИЗАТОРА - Патент РФ 2103366
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКАТАЛИЗАТОРА
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКАТАЛИЗАТОРА

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКАТАЛИЗАТОРА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Использование: энзимология и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения ферментативной активности биокатализаторов, а именно, микроорганизмов, ферментов и т.д. Сущность изобретения: способ определения ферментативной активности биокатализатора включает приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов после реакции, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора. 6 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2103366
Класс(ы) патента: C12Q1/00
Номер заявки: 96113522/13
Дата подачи заявки: 25.06.1996
Дата публикации: 27.01.1998
Заявитель(и): Саратовский государственный университет им.Н.Г.Чернышевского; Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Автор(ы): Игнатов О.В.; Хоркина Н.А.; Щеголев С.Ю.; Игнатов В.В.
Патентообладатель(и): Саратовский государственный университет им.Н.Г.Чернышевского; Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к энзимологии и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения ферментативной активности биокатализаторов, а именно, микроорганизмов, ферментов и т.д.
Известны различные физико-химические способы определения ферментативной активности: цитометрия, флуоресценция, спектрофотометрия и т.п.
Известен, например, способ определения ферментативной активности, предусматривающий иммобилизацию ферментного субстрата на одном конце оптического волокна, приведение ферментного субстрата в контакт с пробой для инициации ферментативной реакции и образования иммобилизованного продукта реакции, имеющего иные спектральные свойства, чем свойства ферментного субстрата. Ферментативную активность определяют на основе изменений спектральных свойств субстрата (Патент США N 238809A, кл. C 12 Q 1/00, C 12 M 1/00, 1/34, опубл. 24.08.93).
Недостатком данного способа является необходимость предварительной иммобилизации новой порции субстрата на поверхности оптического волокна перед каждым измерением.
Известен также способ акустического определения активности ферментов путем инкубации фермента с раствором специфического субстрата и регистрации изменения скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси при ферментативной реакции, которую проводят непосредственно в акустической камере. В качестве акустической камеры используют акустический резонатор, а для определения скорости распространения акустических колебаний в камере с исследуемой средой создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора (Патент Российской Федерации N 2007460 кл. C 12 Q 1/00, заявл. 18.04.91 и опубл. 15.02.94).
Однако данный способ не предназначен для определения ферментативной активности микробных клеток.
Известен также способ определения активности популяций микроорганизмов, окисляющих углеводы, путем инкубирования нефлуоресцирующего органического соединения с микроорганизмами и измерения возникающих в результате этого флуорохромированных клеток при помощи сканирующего флуоресцентного микроскопа или проточного цитометра и оценки полученной гистограммы (Патент ГДР N 268000 кл. C 12 Q 1/02 публ. 17.05.89.).
Данный способ предназначен только для определения активности микробных клеток, окисляющих углеводы.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью (Патент СССР N 1353809 A 1 кл. C 12 Q 1/00 заявл. 10.02.86 и опубл. 23.11.87.). Способ заключается в приготовлении исследуемого и эталонного образцов, проведении ферментативной реакции гидролиза аминоациламинонафталинсульфамидов, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность в максимуме поглощения красителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции и далее активность фермента, сравнивая ее с эталонным образцом.
Однако данный способ не применим для определения ферментативной активности по отношению к другим субстратам.
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа определения ферментативной активности различных биокатализаторов и расширение диапазона используемых субстратов.
Поставленная цель достигается тем, что в способе определения ферментативной активности биокатализаторов, включающем приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.
В известной авторам научно-технической литературе не обнаружены способы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях. Преимуществами способа являются высокая скорость анализа и возможность проведения исследований, не повреждая и не разрушая клетки.
Способ заключается в следующем:
Предварительно получают биомассу клеток по принятой для данного штамма технологии. Далее биомассу отделяют от среды центрифугированием, отмывают и подготавливают для анализа.
Готовят эталонный образец, состоящий из суспензии известного количества биокатализатора, и исследуемый образец, состоящий из суспензии такого же количества биокатализатора с добавлением определяемого субстрата.
Образцы инкубируют при температуре, оптимальной для проявления ферментативной активности, в течение фиксированного интервала времени.
После окончания ферментативной реакции регистрируют величины оптических плотностей образцов. Затем обеспечивают воздействие электрическим полем на эталонный и исследуемый образцы и регистрируют величины оптических плотностей образцов при следующих частотах электрического поля: 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц и определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.
Пример 1. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к акриламиду.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л акриламида в деионизированной воде.
Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 20 мин. Далее эталонный образец вводят в измерительную ячейку и определяют величину оптической плотности, затем обеспечивают воздействие электрическим полем и определяют величины оптических плотностей во время данного воздействия на следующих частотах электрического поля - 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц, используя электрический анализатор ELBIC. Определяют отношение величин оптических плотностей до и во время воздействия электрическим полем для каждой частоты электрического поля. Аналогично поступают с исследуемым образцом. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов (фиг. 1).
Пример 2. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к ацетамиду.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л ацетамида в деионизированной воде.
Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 15 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 2.
Пример 3. Определение амидазной активности клеток штамма. Brevibacterium sp. по отношению к пропионамиду.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л пропионамида в деионизированной воде.
Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 30 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 3.
Пример 4. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к бутирамиду.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л бутирамида в деионизированной воде.
Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 40 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 4.
Пример 5. Определение ферментативной активности клеток штамма Pseudomonas sp. C-11. по отношению к p-нитрофенолу.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л р-нитрофенола в деионизированной воде.
Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 100 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 40 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 5.
Пример 6. Определение ферментативной активности клеток штамма Pseudomonas sp. БА-11 по отношению к p-нитрофенолу.
Готовят следующие растворы.
Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.
Раствор 2. 1 г/л p-нитрофенола в деионизированной воде. Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 100 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35oC в течение 60 мин. Далее эталонный образец вводят в измерительную ячейку и определяют величину оптической плотности, затем обеспечивают воздействие электрическим полем и определяют величины оптических плотностей во время данного воздействия на следующих частотах электрического поля - 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц, используя электрооптический анализатор ELBIC. Определяют отношение величин оптических плотностей до и во время воздействия электрическим полем для каждой частоты электрического поля. Аналогично поступают с исследуемым образцом. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов (фиг. 6).
Формула изобретения: Способ определения ферментативной активности биокатализатора, включающий приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, отличающийся тем, что после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.