Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Способ получения цитохрома С включает экстракцию фарша из сердец лососевых трихлоруксусной или серной кислотами при pH 4,8-5,6, отделение балластных белков на природном адсорбенте - перлите, добавляемом к экстракционной массе из расчета 20-30 г на 100 г исходного сырья, отделение экстракта, его нейтрализацию до нейтрального pH, осаждение белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома С ТХУ или серной кислотой, промывку его насыщенным раствором сульфата аммония для отделения примесей, растворение в воде с последующим замораживанием - размораживанием, фильтрование, диализ, стерильную фильтрацию и расфасовку. Полученный цитохром С имеет наиболее приближенный аминокислотный состав к цитохрому С человека. 2 з.п. ф-лы.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2105559
Класс(ы) патента: A61K35/36
Номер заявки: 95100463/14
Дата подачи заявки: 17.01.1995
Дата публикации: 27.02.1998
Заявитель(и): Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии
Автор(ы): Эпштейн Л.М.; Чередниченко С.И.; Быстрова И.М.; Сидорова Н.Д.; Селиванов Е.А.
Патентообладатель(и): Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии.
Известен способ получения цитохрома C (авт. св. N 351546, кл. A 61 K 35/34) из сердец крупного рогатого скота. Способ включает измельчение сердца в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8-4,1; 2 высаливания балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохромата C 20%-ным раствором трихлоруксуной кислоты, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C оставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мл, стерильно фильтруют, разливают во фланцы и лиофилизируют.
Этот способ не позволяет выделить цитохром из сердца гидробинтов.
Наиболее близким техническим решением является способ получения цитохрома C [1] Способ включает измельчение сердца морского котика в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8 4,1, нейтрализацию гидроксидом натрия до pH 6,0-7,0, высаливание балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома C 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, обработку осадка насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугирование, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мг, стерильно фильтруют, разливают во флаконы и лиолифилизируют.
Недостатком этого способа является невозможность выделения цитохрома C из сердца гидробионтов.
Задача, решаемая изобретением, получение цитохрома C из нового сырья - сердец гидробионтов, в котором аминокислотный состав соответствует цитохрому C человека.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.
В качестве сырья используют сердце лососевых пород рыб. Сырье промывают от крови, измельчают (гомогенизируют). Фарш также отмывают от крови. К полученному фаршу добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 2% -ной серной кислоты до pH 4,8-5,5. Экстракт в течение 2 ч при периодическом перемешивании.
В экстракционную массу добавляют природный адсорбент-перлит в соотношении 4: 1. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют гидроокись натрия до pH 7,0 и осаждают белки кристаллическим сульфатом аммония.
К фильтрату добавляют 20%-ный раствор ТХУ или 10% H2SO4. Выпадает осадок, который отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают раствором сульфата аммония и центрифугируют. Осадок цитохрома C растворяют в дистиллированной воде и замораживают при температуре минус 10 15oC, затем размораживают и фильтруют. Крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ. Полученный раствор нагревают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором, стерильно фильтруют во флаконы и лиофилизуют.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
К 300 г фарша сердец лососевых (вид Oncorhynchus keta) добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,85 при t=18oC и два часа экстрагируют при периодическом перемешивании. В конце экстракции в экстракционную массу добавляют 60 г (из расчета 20 г на 100 г сырья) обработанного перлита марки Sil Flo 272. Выдерживают 30 мин. Экстракт отделяют на нутч-фильтре. Объем экстракта 280 мл.
Для нейтрализации экстракта в него добавляют 10% NaOH до pH 7,05. Осаждают балластные белки кристаллическим сульфатом аммония (из расчета 500 г/л). На 200 мл экстракта добавляют 100 г сульфата аммония. Получают 230 мл фильтрата.
К полученному после первого высаливания прозрачному фильтрату при перемешивании 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 25 мл/л. Выпадает розовый осадок цитохрома C. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее осадок промывают раствором сульфата аммония из расчета 500 мл/кг сырья, центрифугируют, отделяют осадок. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде. Полученный раствор цитохрома замораживают. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физраствора. Выход цитохрома 0,1 г/кг исходного сырья.
Природный адсорбент перлит обрабатывают следующим образом: перлит отмывают дистиллированной водой до pH 6, затем замачивают в подкисленной серной кислотой до pH 5,8 воде и выдерживают при помешивании 1 ч. Перлит отжимают через бязь или капрон и добавляют в фарш.
Пример 2.
Берут 100 г фарша из сердец лососевых (вид Oncorhynchus nerca) со сроком хранения 4,5 месяца в морозильнике при t=-8oC. Проводят экстракцию 2,5% ТХУ при pH 5,5 в течение 2 ч. В конце экстракции добавляют предварительно подготовленный, как и в примере 1, в количестве 25 г перлит марки Dicalite (США) и при перемешивании выдерживают 0,5 ч. Получают после фильтрации на нутч-фильтре 81 мл экстракта (pH 5,5).
К экстракту добавляют 10% гидроксида натрия до pH 7,3. Для осаждения белков в экстракт добавляют кристаллический сульфат аммония из расчета 450 г/л, перемешивают и выдерживают 30 мин. Фильтруют через бумажные фильтры. Объем полученного фильтрата 62 мл.
Из полученного фильтрата осаждают цитохром C 10% H2SO4, выпадает осадок цитохрома C, фильтруют, надосадочную жидкость сливают, а осадок обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугируют. Собранный осадок цитохрома C растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Замораживают при t-12oC, размораживают и отфильтровывают для отделения криопреципитатных белков. Крепкий раствор цитохрома помещают в целлофановый пакетик, ставят на диализ против физраствора.
Выход цитохрома C от исходного сырья 0,090 г/кг исходного сырья.
Пример 3.
Берут 400 г свежих сердец лососевых (вид Oncorhynchus gorbuscha), промывают от крови, измельчают в фарш, еще раз промывают от крови. К приготовленному фаршу добавляют 2% H2SO4 до pH 4,9, t 23oC. Выход на режим 20 мин. В течение 2 ч проводят экстракцию. По окончании в экстракционную массу добавляют обработанный по примеру 1 перлит марки Flo R (Франция) из расчета 300 г/кг сырья, оставляют на 30 мин для осаждения белков. Отделяют жмых от экстракта через бязь. Далее проводят нейтрализацию экстракта 10% NaOH до pH 7,15.
Проводят высаливание кристаллическим сульфатом аммония из расчета 450 г/л, на 280 мл фильтрата добавляют 126 г сульфата. После фильтрации объем фильтрата 335 мл.
Осаждают цитохром 20%-ной трихлоруксусной кислотой. К 330 мл фильтрата добавляют 6,6 трихлоруксусной кислоты из расчета 20 мл/л. Через 20-30 мин выпадает осадок цитохрома C. Отделяют его центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин и обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония до очистки от примесей. Собранный раствор в 1,7 мл дистиллированной воды. Полученный раствор цитохрома C замораживают при -12oC. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физиологического раствора.
Выход цитохрома C 0,070 мг/кг сырья.
Формула изобретения: 1. Способ получения цитохрома С путем экстракции измельченной сердечной мышцы животного, включающий осаждение балластных басков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома С кислотой, обработку осадка насыщенным раствором сульфата аммония с последующим растворением осадка, содержащего целевой продукт в дистиллированной воде, его замораживание, размораживание, фильтрование и диализ, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют сердце лососевых, экстракцию проводят при рН 4,8 5,5, а в конце экстракции в экстракционную смесь добавляют перлит в соотношении 20 30 г на 100 г исходного сырья.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию измельченной сердечной мышцы проводят 2,0 2,5%-ным раствором серной или трихлоруксусной кислоты.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что осаждение цитохрома С проводят 10 20%-ным раствором серной или трихлоруксусной кислоты.