Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ ВЫЗЫВАТЬ ЦИТОЛИТИЧЕСКИЙ Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА IN VIVO, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ
ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ ВЫЗЫВАТЬ ЦИТОЛИТИЧЕСКИЙ Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА IN VIVO, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ

ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ ВЫЗЫВАТЬ ЦИТОЛИТИЧЕСКИЙ Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА IN VIVO, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинной композиции, включающей антиген, 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид-А и QS 21 в качестве адъюванта. Данная вакцинная композиция обладает свойством вызывать цитолитический Т-клеточный ответ у млекопитающих. Раскрыт способ получения данной вакцины путем смешивания антигена с 3Д-МФЛ в водной суспензии, а затем вводят QS 21 в водном растворе с хлоридом натрия при рН 6,5+0,5. Вакцинная композиция обладает свойством индуцировать более широкий спектр иммунных ответов, чем известные. 3 с. и 5 з.п.ф-лы, 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2118164
Класс(ы) патента: A61K35/78, A61K39/39
Номер заявки: 94046232/14
Дата подачи заявки: 15.06.1993
Дата публикации: 27.08.1998
Заявитель(и): Смитклайн Бичам Байолоджикалс, С.А. (BE)
Автор(ы): Жан-Поль Приель (BE); Натали Мари-Жозеф Клод Гаркон-Жонсон (FR); Монсеф Слауи (МС); Пьетро Пала (IT)
Патентообладатель(и): Смитклайн Бичам Байолоджикалс, С.А. (BE)
Описание изобретения: Настоящее изобретение относится к новым рецептурам вакцин, способам их производства и использованию в медицине. Конкретно, настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим QS 21, очищенную посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения фракцию, выделенную из коры Quillaja Saponaria Molina и 3-де-О-ацилированному монофосфориллипиду A (3Д-МФЛ).
3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A известен из GB2220 211 (Ribi). С химической точки зрения, он представляет смесь 3-деацилированного монофосфориллипида A с 4, 5 или 6 ацилированными цепями и производится компанией Ribi Immunochen Montana.
QS 21 представляет очищенную посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения нетоксичную фракцию сапонина из коры южноамериканского дерева Quillaja Sceponaria Molina, а способ его получения раскрывается (как QA 21) в патенте США N 5 057 540.
Настоящее изобретение основывается на открытии того факта, что препараты, содержащие комбинации QS 21 и 3Д-МФЛ, синергически усиливают иммунные ответы к данному антигену.
Например, вакцина малярийного антигена, RTS,S в сочетании с 3Д-МФЛ и QS 21 вызывает мощную синергическую индукцию специфического по КС белку ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в селезенке. RTS является гибридным белком, включающим большую часть C-концевой порции белка кольцевого спорозоита (КС) P. falciparum, связанную через четыре аминокислоты пре-S2 порции поверхностного антигена гепатита B с поверхностным (S) антигеном вируса гепатита B. Его полная структура раскрывается в международной патентной заявке N PCT/EP92/02591, опубликованной под номером WO 93/10152, заявляющим приоритет перед патентной заявкой Великобритании N 9124390.7. При экспрессировании в дрожжах RTS вырабатывается в виде липопротеиновой частицы, а при со-экспрессировании с S антигеном ВГБ он вырабатывается в виде смешанной частицы, известной как RTS, S.
Это наблюдение о возможности индуцировать мощный цитолитический ответ Т-лимфоцитов очень важно, поскольку на некоторых животных было показано, что этот ответ обеспечивает защиту от заболевания.
Авторами настоящего изобретения показано, что сочетание двух адъювантов - QS 21 и 3Д-МФЛ с рекомбинантным корпускулярным антигеном RTS, S приводит к мощной индукции специфических по КС балку ЦТЛ в селезенке. QS 21 также сам по себе усиливает индукцию ЦТЛ, в то время как 3Д-МФЛ этим свойством не обладает. Можно сказать, что комбинация действует синергически, поскольку она обладает большим эффектом, чем сумма отдельных эффектов каждого из адъювантов. Синергизм этих двух адъювантов при индукции ЦТЛ имеет большое значение при применении рекомбинантных молекул в качестве вакцин для индукции ЦТЛ-опосредованного иммунитета.
Индукцию ЦТЛ легко видеть, когда антиген-мишень синтезируется внутриклеточно (например, при вирусных инфекциях; инфекциях, вызванных внутриклеточными бактериями или в опухолях), поскольку пептиды, полученные в результате протеолитического распада антигена могут претерпевать соответствующий процессинг, приводящий к презентации в ассоциации с молекулами класса 1 на клеточной мембране. Однако обычно растворимый антиген не достигает этого процессинга и презентации и не выявляет ограниченных по классу 1 ЦТЛ. Таким образом, стандартные неживые вакцины, вызывая ответы по антителами и Т-хелперам, обычно не индуцируют ЦТЛ-опосредованного иммунитета. Сочетание этих двух адъювантов, QS 21 и 3Д-МФЛ, может преодолеть это серьезное ограничение, касающееся вакцин, основанных на рекомбинантных белках, и вызвать более широкий спектр иммунных ответов.
Показано, что ЦТЛ, специфичные к КС белку, защищают от малярии мышей (Roneero и др. Nature 341:323 (1989). В испытаниях на добровольцах, когда людей иммунизировали с помощью облученных спорозоитов P. falciparum они оказались защищенными от заражения малярией и демонстрировали индукцию ЦТЛ, специфичных в отношении эпитопов КС (Malic и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3300 (1991)).
Способность индуцировать ЦТЛ, специфичные в отношении антигена, введенного в виде рекомбинантных молекул, весьма ценна для разработки вакцины против малярии, поскольку применение облученных cпорозоитов непрактично с точки зрения их производства и природы иммунного ответа.
В добавление к малярийным вакцинам способность индуцировать ЦТЛ ответы улучшит также вакцины против вируса Herpes simplex, цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также во всех случаях, при которых патоген имеет стадию внутриклеточной жизни. Подобно этому ЦТЛ, специфичные к известным опухолевым антигенам, могут быть индуцированы сочетанием рекомбинантного опухолевого антигена и этих двух адъювантов. Это позволит разработать противораковые вакцины.
В некоторых системах комбинация 3Д-МФЛ и QS 21 оказалась способной синергически усиливать выработку интерферона γ. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали синергический потенциал 3Д-МФЛ и QS 21 посредством использования антигена Herpes simplex, известного как gD2t, является растворимым усеченным гликопротеином D из ВГС-2 и вырабатывается клетками яичника китайского хомячка, согласно методике Berman и др. Sience 222, 524-527.
Секреция интерферона γ связана с защитными реакциями против внутриклеточных патогенов, включая паразитов, бактерии и вирусы. Активация макрофагов интерфероном γ усиливает внутриклеточное уничтожение микроба и повышает экспрессию рецепторов Fс. Может наблюдаться также прямая цитотоксичность, особенно в синергизме с лимфотоксином (другим продуктом клеток THI). Интерферон γ является как индуктором, так и продуктом клеток NK, которые являются основными врожденными эффекторами защиты. Ответы типа THI как через интерферон γ , так и посредством иных механизмов, обеспечивают предпочтительную помощь для выработки изотипов IgG2a.
Гликопротеин D находится в вирусной оболочке и обнаруживается также в цитоплазме инфицированных клеток (Sisenberg P.J. и др., J. of Virol, 1980, 35, 428-435). Он состоит из 393 аминокислот, включая сигнальный пептид, и имеет молекулярный вес приблизительно 60 кДа. Из всех гликопротеинов оболочки вируса Herpes simplex (ВГС) этот гликопротеин изучен наиболее полно (Cohen и др. J. Virology 60 (157-166). Известно, что in vivo он играет главную роль при присоединении вируса к клеточной мембране. Помимо этого гликопротеин D способен вызывать выработку нейтрализующих антител in vivo (bing. и др., J. Med. Virology, 127:59-65). Тем не менее латентный ВГС2 может реактивироваться и индуцировать рецидив заболевания, несмотря на присутствие в сыворотке пациента высокого титра нейтрализующих антител. Очевидно, потому, что способность индуцировать только нейтрализующие антитела является недостаточной для адекватного контроля над заболеванием.
Чтобы предотвратить рецидив заболевания, необходима стимуляция вакциной не только выработки нейтрализующих антител, но и клеточного иммунитета, опосредованного Т-клетками, в частности, цитотоксическими Т-клетками.
С этой точки зрения, gD2t представляет гликопротеин ВГС из 308 аминокислот, который включает с 1 по 306 аминокислоты натурального гликопротеина с добавочными аспарагином и глутамином на C-конце усеченного протеина. Эта форма белка включает сигнальный пептид, который отщепляется, в результате чего получается зрелый белок из 283 аминокислот. Выработка такого белка клетками яичника китайского хомячка описывается в европейском патенте EP-B-139 417.
Зрелый усеченный гликопротеин (rgD2t) или эквивалентные белки, секретируемые клетками млекопитающих, предпочтительно используются в вакцинных препаратах настоящего изобретения.
Препараты настоящего изобретения являются очень эффективными в отношении выработки защитного иммунитета в модели генитального герпеса на морских свинках. Даже при очень низких дозах антигена (например, 5 μг rgD2t) препараты защищают морских свинок от первичной инфекции, а также стимулируют выработку специфических нейтрализующих антител. Авторы, используя препарат настоящего изобретения, продемонстрировали также ответы типа THI, опосредованные эффекторными клетками, у мышей.
Настоящее изобретение создает вакцину или фармацевтическую композицию, включающую антиген, в сочетании с 3 деацилированным монофосфориллипидом A и QS 21. Такая композиция удобна для целого ряда моновалентных или поливалентных вакцин.
Предпочтительно вакцинные препараты должны содержать антиген или антигенную композицию, способные вызвать иммунный ответ против патогена человека или животных, и выделенные из ВИЧ-1 (такие как gp120 или gp160), любого из вирусов кошачьего иммунодефицита, вирусов герпеса человека или животных, такие как или его производные, или прямой ранний белок, такой как ICP27 из ВГС1 или ВГС2, цитомегаловирусов (такие как B или его производные), вируса Varicella Zoster (такие как gpI, II или III) или из вируса гепатита, таких как вирус гепатита B, например, поверхностный антиген гепатита B или его производные, вирус гепатита A, вирус гепатита C и вирус гепатита E, или из других патогенных вирусов, таких как респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека или вирус гриппа, или выделенные из патогенных бактерий, таких как Salmonella, Neisseria, Borrelia (например, O pA или O cB или их производные), хламидий или Berdetella (например, P.69, PT и FHA) или выделенные из паразитов, таких как плазмодий или токсоплазмы.
Препараты могут содержать также противоопухолевый антиген и применяться для иммунотерапевтического лечения раковых опухолей.
Эти препараты могут также применяться с легкими герпетическими частицами, как описано в международной патентной заявке N PCT/GB92/00824 и в международной патентной заявке N PCT/GB92/00179.
Производные поверхностного антигена гепатита B хорошо известны специалистам и включают, среди прочих, пре-S1, пре-S2 антигены, описанные в европейских патентных заявках EP-A-414 374, EP-A-0304 578 и EP 198 474.
Настоящее изобретение обеспечивает вакцину, которая описывается в настоящем документе, для использования в медицине.
Соотношение QS 21:3Д-МФЛ обычно составляет от 1:10 до 10:1, предпочтительно от 1:5 до 5:1, значительно чаще - 1:1. Предпочтительное соотношение для оптимального синергизма составляет от 2,5:1 до 1:1 3Д-МФЛ:QS 21. При использовании для человека QS 21 и 3Д-МФЛ присутствуют в вакцине в количестве 1 - 100 г, предпочтительно, 10 - 50 г на дозу. Часто вакцина не требует какого-либо специфического носителя и приготавливается на основе водного или другого фармацевтически приемлемого буфера. В некоторых случаях предпочтительно, чтобы вакцины настоящего изобретения содержали квасцы или были представлены в виде эмульсии "масло в воде", или с другим подходящим носителем, например, липосомами, микросферами или инкапсулированными антигенными частицами.
Приготовление вакцин в целом описано в New Trends and Developments' in Vaccines, изданном Voller и др. University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978. Инкапсуляция в липосомы описаны, например, Fullerton, патент США 4 235 877. Конъюгация белка с макромолeкулами раскрывается, например, Likhite, патент США 4 372 945 и Armo и др., США 4 474 757.
Количество белка в каждой дозе вакцины подбирается таким образом, чтобы индуцировать иммунозащитный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов типичных вакцин. Это количество варьирует в зависимости от вида специфического иммуногена и от того, в какой форме он представлен. Обычно каждая доза содержит 1-1000 г белка, предпочтительно 2-100 г наиболее предпочтительно 4-40 г. Оптимальное количество для конкретной вакцины можно установить с помощью стандартных исследований, включая наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов экспериментов. Вслед за первоначальной вакцинацией субъекты могут получать одну или несколько активных иммунизаций через адекватные промежутки времени.
Препараты настоящего изобретения могут применяться как для профилактических, так и для лечебных целей.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает также способ лечения, включающий введение эффективного количества вакцины настоящего изобретения пациенту.
Примеры.
1.0. Синергизм между 3Д-МФЛ и QS 21 в отношении индукции секреции интерферона γ.
С целью исследования способности препаратов rgD2t, содержащих адъюванты 3Д-МФЛ и QS 21, индуцировать иммунный ответ, опосредованный эффекторными клетками, вакцинировали группы мышей Balb/c и исследовали клетки их лимфатических узлов на способность секретировать интерферон γ, как описано ниже.
1.1 Препараты rgD2t.
В этом эксперименте сравнивали три препарата, содержащие адъюванты:
1) rgD2t в 3Д-МФЛ;
2) rgD2t в QS 21;
3) rgD2t в 3Д-МФЛ/QS 21.
Эти препараты готовили следующим образом: rgD2t производился клетками яичника китайского хомячка и соответствовал зрелому 1-283 аминокислот ВГС-2 gD, произведенному согласно методике Berman (Supra) и EP 0139417.
*rgD2t/3Д-МФЛ:
5 μг rgD2t/ на дозу инкубировали 1 ч при перемешивании при комнатной температуре, затем смешивали с суспензией 3Д-МФЛ (25 μг /на дозу). Объем доводили до 70 μл /на дозу с помощью раствора хлорида натрия (5M, pH 6,5 ± 0,5) и воды для инъекций до получения конечной концентрации 0,15 M хлорида натрия, pH сохраняли на уровне 6,5 ± 0,5.
*rgD2t/QS 21:
5 μг rgD2t/на дозу инкубировали 1 ч при комнатной температуре и перемешивании. Объем доводили с помощью раствора хлорида натрия (5 M, pH 6,5 ± 0,5) и воды для инъекций до 70 μл. Затем добавляли QS 21 (10 μг/на дозу). pH сохраняли на уровне 6,5 ± 0,5, а конечная концентрация хлорида натрия составляла 0,15 M.
*rgD2t/3Д-МФЛ/QS 21:
5 μг rgD2t/на дозу инкубировали при помешивании и комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляли 3Д-МФЛ (25 μг /на дозу) в виде водной суспензии. Конечный объем в 70 μл достигался добавлением водного раствора QS 21 (10 μг /на дозу), уровень pH составлял 6,5 ± 0,5, а концентрация хлорида натрия - 0,15 M.
1.2 Иммунизация.
Мышам инъецировали по 35 μл препарата в подушечки задних лапок. Таким образом, каждая мышь получала 70 μл. Иммунизацию производили на 0 и 14 дни. Животных умерщвляли на 21 день.
1.3 Определение интерферона.
Клетки подколенных лимфоузлов иммунизированных мышей стимулировали in vitro с помощью rgD2t в количестве 10, 1, 0,1, 0 μг /мл. Утроенные культуры (объемы 200 μл ) помещали в 96-луночные микротитрационные планшеты, используя 2 · 105 иммунокомпетентных клеток и 2 · 105 облученных (3000 рад) сингенных клеток селезенки не подвергавшихся воздействию животных. Использовалась среда RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки теленка. Аликвоты по 100 μл культуральной среды из каждой повторности собирали для определения интерферона γ. Культуры исследовали через 72 ч. Для всех исследований контролем была группа, в которой использовали Con A (Bochringer Mannheim) в количестве 5 μг /мл. Контроль был всегда положительным. Секрецию интерферона γ определяли с помощью коммерческого EZISA производства Holland Biotechnology (Gibco). Исследования выполняли на 100 μл надосадочной жидкости из трех лунок.
Секреция интерферона γ свыше 50 пг/л контроля наблюдалась для всех трех групп препаратов (см. таблицу). Помимо этого для QS 21 и 3Д-МФЛ наблюдался синергический эффект. В то время как каждый адъювант в отдельности индуцировал клетки, способные секретировать интерферон γ в ответ на rgD2t, их сочетание индуцировало более чем в два раза больший ответ, чем сумма отдельных ответов.
1.4 Результаты
Синергизм QS 21 и 3Д-МФЛ в отношении индукции секреции интерферона (см. таблицу 1).
Количество интерферона γ выражено в пг/мл.
Таблица ясно показывает, что комбинированная вакцина индуцирует секрецию интерферона γ синергически.
2.0 Синергизм 3Д-МФЛ и QS 21 в отношении индукции ЦТЛ. С целью исследования способности частиц RTS, S в 3Д-МФЛ и QS 21 адъювантных препаратов индуцировать ЦТЛ группы мышей BIO.BR иммунизировали и клетки их селезенок стимулировали in vitro и исследовали на цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих КС белок.
2.1 Препараты частиц RTS,S
Частицы RTS,S помещали в три различные композиции:
1. Частицы RTS,S (10 μг ) с QS 21 (10 г) и 3Д-МФЛ (25 μг );
2. Частицы RTS,S (10 μг ) с QS 21 (10 μг );
3. Частицы RTS,S (10 μг ) с 3Д-МФЛ (25 μг ).
Препараты приготовили следующим образом:
RTS,S/3Д-МФЛ
10 μг RTS, S частиц/ на дозу инкубировали при комнатной температуре и перемешивании в течение 1 ч, а затем смешивали с водной суспензией 3Д-МФЛ (25 μг /на дозу). Объем доводили до 70 μл /на дозу с помощью воды для инфекций и раствора хлорида натрия (5H, pH 6,5 ± 0,5) до конечной концентрации хлорида натрия 0,15 M (pH сохраняли на уровне 6,5 ± 0,5).
RTS,S/QS 21
10 μг частиц RTS,S/на дозу инкубировали 1 ч при комнатной температуре и перемешивании. Объем доводили с помощью воды для инъекций и раствора хлорида натрия (5H, pH 6,5 ± 0,5), а затем с помощью водного раствора QS 21 (10 μг /на дозу) до конечного объема 70 μл /на дозу. pH сохраняли на уровне 6,5 ± 0,5, а конечная концентрация хлорида натрия составляла 0,15 M.
RTS,S/3Д-МФЛ/QS 21
10 μг частиц RTS,S/на дозу инкубировали 1 ч при комнатной температуре и перемешивании, а затем смешивали с водной суспензией 3Д-МФЛ (25 г/на дозу). Объем доводили с помощью воды для инъекций и раствора хлорида натрия (5H, pH 6,5 ± 0,5), а затем с помощью водного раствора QS 21 (10 μг /на дозу) до конечного объема 70 μл /на дозу. pH сохраняли на уровне 6,5 ± 0,5, а конечная концентрация хлорида натрия составляла 0,15 M
2.2 Иммунизация мышей частицами RTS,S.
4-6-недельных самок мышей линии BIO.BR (H-2K) приобрели у IFFA CREDO (Франция). Группы из трех животных иммунизировали инъекцией в подушечки задних лопаток по 35 μл антигенного препарата в каждую. Животных повторно иммунизировали в такой же дозе антигена спустя две недели.
2.3 Стимуляция in vitro анти-КС ЦТЛ.
Спустя две недели после повторной иммунизации брали клетки селезенки и стимулировали in vitro, используя сингенные фибропласты, трансфецированные геном белка кольцевидного опорозоита P. falciparum (клон 7G8). Эти КС-трансфецированные клетки описаны в статье Kumar S. и др. (1988) Nature, 334: 258-260.
Культуры помещали в среду RPMI 1640, содержащую 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка и обычные добавки, хорошо известные специалистам.
Иммунокомпетентные клетки культивировали в концентрации 106 клеток/мл в присутствии 105 КС-трансфектантов на мл. Для предотвращения пролиферации КС-трансфектантов их облучали в дозе 2 · 104 ряд. Культуральную среду заменяли наполовину на 3 и 6 дни и исследовали на цитолитическую активность на 7 день.
2.4 Исследование анти-КС ЦТЛ на цитотоксичность.
Культуры иммунокомпетентных клеток собирали, отмывали и смешивали в соотношениях от 100:1 до 0,3:1 с постоянным количеством в 2 000 клеток-мишеней в объемах 200 μл в 96-луночных планшетах с V-образным дном. Клетками-мишенями являлись сингенные фибропласты, меченные 51Cr.
Применяли два различных типа клеток-мишеней:
1. Z клетки;
2. КС-трансферованные Z клетки.
Эти клетки подробно описываются у Kumar S. и др. (1988), 334:258-260.
Планшеты инкубировали в течение 6 ч при 37oC, а затем определяли количество радиоактивности, перешедшее в надосадочную жидкость в результате лизиса клеток-мишеней. Цитолитическая активность выражалась в % специфического лизиcа, (см. таблицу 2).
Иммунизация мышей BIO. BR частицами RTS,S с адъювантами QS 21 и 3Д-МФЛ индуцировала в селезенке высокие уровни ЦТЛ, специфичных к КС компоненту RTS,S (препарат 1). Иммунизация частицами RTS,S с адъювантом QS 21 также индуцировала ЦТЛ в селезенке, но в количестве, составляющем лишь около 1/30 уровней препарата 1 (препарат 2). Частицы RTS,S с 3Д-МФЛ (препарат 3) не индуцировали ЦТЛ.
Поскольку клетки-мишени, которые использовались в этом исследовании, не экспрессировали молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II, можно считать эффекторные клетки принадлежащими к ограниченным по классу I CD8+ ЦТЛ.
3. Препарат поверхностного антигена гепатита B, гидроксид алюминия, 3Д-МФЛ и QS 21.
Приготовление поверхностного антигена гепатита B (HBsAg) описывается, например, Harford и др., Develop. Biol. Standard. 54, с. 125 (1983), Gregg и др. Biotechnology 5, с. 479 (1987), EP-A-0 226 846 и EP-A 229 108, включенных в настоящий документ в качестве ссылок.
3Д-МФЛ получали от Rib. Immunochem QS 21 - от Cambridge Biotech., гидроксид алюминия - от Supertos' (Alhydrogel).
Для исследований иммунитета, опосредованного клетками-эффекторами, у мышей и обезьян Rhesus приготавливали несколько различных препаратов.
3.1 Препарат 1 приготавливался на фосфатном буфере (pH 6,8) и включал следующие ингредиенты на 60 μл дозу:
20 μг - HBsAg
30 μг - Al(OH)3
30 μг - 3Д-МФЛ
10 μг - QS 21
10 мМ - PO34-
0,15 M - NaCl
Препарат приготавливали следующим образом: 20 μг HBsAg/ на дозу инкубировали с Al(OH)3 в течение одного часа при комнатной температуре, слегка встряхивая. Затем добавляли 3Д-МФЛ в виде водной суспензии, QS 21, фосфатный буфер и хлорид натрия и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Готовый препарат имел pH между 6,5 и 7,0 и использовался для иммунизации мышей посредством инъекций в подушечки лапок.
3.2 Препарат 2 приготавливался на фосфатном буфере (pH 6,8) и включал следующие ингредиенты на 200 μл дозу:
1 μг - HBsAg
100 μг - Al(OH)3
50 μг - 3Д-МФЛ
20 μг - QS 21
10 мМ - PO34-
0,15 M - NaCl
Препарат приготавливали следующим образом: HBsAg и Al(OH)3 инкубировали совместно в течение одного часа при комнатной температуре, слегка встряхивая. Затем добавляли Al(OH)3, 3Д-МФЛ в виде водной суспензии, QS 21 с фосфатным буфером и раствором хлорида натрия и снова инкубировали 30 мин. pH препарата поддерживали между 5,6 и 7,0 и использовали для изучения гуморального иммунитета у мышей.
3.3 Препарат 3 приготавливался таким же способом на фосфатном буфере (pH 6,5-7,0) и включал следующие ингредиенты на 1 мл дозу:
10 μг - HBsAg
500 μг - Al(OH)3
50 μг - 3Д-МФЛ
10 μг - QS 21
Этот препарат использовали для экспериментов на обезьянах.
4. Заключение.
Комбинирование двух адъювантов, QS 21 и 3Д-МФЛ, с корпускулярным рекомбинантным антигеном RTS, S приводило к мощной индукции специфичных по КС-белку ЦТЛ в селезенке. QS 21 усиливает индукцию ЦТЛ, а 3Д-МФЛ не обладает этим свойством. Комбинация этих двух адъювантов действует синергически, поскольку обладает эффектом, большим, чем сумма отдельных эффектов каждого адъюванта. Синергизм между этими двумя адъювантами в отношении индукции ЦТЛ является весьма значительным наблюдением, подтверждающим синергизм между QS 21 и 3Д-МФЛ в отношении индукции Т-клеток, способных секретировать интерферон γ в ответ на стимуляцию растворимым рекомбинантным белком gD2t. Это открытие имеет большое значение для использования рекомбинантных молекул в качестве вакцин для индукции ЦТЛ-опосредованного иммунитета, поскольку комбинация двух адъювантов, QS 21 и 3Д-МФЛ, может преодолеть серьезные ограничения для вакцин, основанных на рекомбинантных белках, и индуцировать более широкий спектр иммунных ответов, чем это было ранее.
Данные по иммуногенности, опосредованной эффекторными клетками, у мышей показывают, что препараты rgD2t, содержащие QS 21, индуцируют значительный синергический ответ Т-клеток типа THI (секреция интерферона γ ).
Показано, что такие Т-клетки типа THI вовлечены в индукцию реакций гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Наши собственные данные по профилактике ВГС инфекции показывают, что совместная индукция нейтрализующих антител и антиген специфичных DTH ответов обеспечивает наилучшую защиту от инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.
Все вместе эти данные предполагают, что препараты rgD2t, содержащие QS 21, могут быть эффективными в отношении индуцирования защитного ответа против ВГС инфекции. Представленные данные демонстрируют неожиданный синергический эффект между 3Д монофосфориллипидом A и QS 21 в отношении индукции секретирующих антигенспецифичных Т-клеток. Этот синергизм может выразиться в улучшенной способности индуцировать защитный ответ против ВГС-инфекции, и, на самом деле, эти препараты являются эффективными в отношении защиты против заболевания морских свинок.
Формула изобретения: \ \ \ 1 1. Вакцинная композиция, обладающая свойством вызывать цитолитический Т-клеточный ответ у млекопитающих, содержащая белковый антиген, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта композиция содержит смесь очищенной нетоксической фракции сапонина (QS 21) и 3-де-O-ацилированного монофосфориллипида A (3Д - МФЛ) при следующих соотношениях компонентов в композиции, мкг на дозу: \\\3 Белковый антиген \\\7 1 - 1000 \\\3 QS 21 \\\7 1 - 100 \\\3 3Д - МФЛ \\\7 1 - 100 \\\2 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что соотношение QS 21 : 3Д - МФЛ составляет от 1 : 10 до 10 : 1. \\\2 3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что способна стимулировать выработку интерферона. \\\2 4. Композиция по любому из пп.1 - 3, отличающаяся тем, что соотношение QS 21 : 3Д - МФЛ составляет от 1 : 1 до 1 : 2,5. \\\2 5. Композиция по любому из пп. 1 - 4, отличающаяся тем, что включает антиген или антигенную композицию, выделенную из вируса иммунодефицита человека, вируса иммунодефицита кошек, вируса Herpes Simplex типа 1, вируса Herpes Simplex типа 2, цитомегаловируса человека, вирусов гепатита A, B, C или E, респираторно-синцитиального вируса, вируса папилломы человека, вируса гриппа, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium или Toxoplasma. \\\2 6. Композиция по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что антиген является опухолевым антигеном. \\\2 7. Способ получения цитолитического Т-клеточного ответа in vivo, включающий введение вакцинной композиции живому организму, отличающийся тем, что вводят вакцинную композицию по пп.1 - 6 в эффективном количестве. \\\2 8. Способ получения вакцинной композиции, обладающей свойством вызывать цитолитический Т-клеточный ответ у млекопитающих, включающий обработку антигена, отличающийся тем, что смешивают при комнатной температуре антиген с 3Д - МФЛ в водной суспензии и затем вводят QS 21 в водном растворе с хлоридом натрия, причем pH смеси поддерживают на уровне 6,5 ± 0,5. \ \ \ 9 Приоритет по пунктам: \\\2 25.06.92 по пп.1 и 2; \\\2 17.12.92 по пп.3 - 8.