Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО МОНОКОМПОНЕНТНОГО ИНСУЛИНА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО МОНОКОМПОНЕНТНОГО ИНСУЛИНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО МОНОКОМПОНЕНТНОГО ИНСУЛИНА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Натрий инсулин с содержанием монофракции не менее 85% подают в хроматографическую колонну с сульфокатионитом КУ-23И с диаметром частиц от 200 до 300 мкм. Элюируют инсулин 0,018-0,022 М фосфатным буфером линейным и выделяют инсулин изоэлектрическим осаждением. Инсулин растворяют в 1 М уксусной кислоте и подают в хроматографическую колонну (сефадексом G-50 St фирмы Pharmacia), проводят элюирование инсулина 1 М уксусной кислотой. Часть элюата, содержащую инсулин и которая элюируется в интервале от 0,6 - 0,7 до 0,9 - 1,0 объема насадки в колонне, направляют на вход колонны для рециркуляции и продолжают элюирование 1 М уксусной кислоты. Полученный после циркуляционной гельпроникающей хроматографии монопиковый инсулин подают в колонну с анионообменным силикагелем PEA-300 фирмы Amicon с размером частиц от 35 до 70 мкм. Элюируют инсулин со скоростью от 20 до 45 мл/см2 · ч-1, используя экспоненциальный градиент по концентрации хлористого натрия. Полученный инсулин содержит не менее 98,5% монофракции, не более 0,5% дезамидоинсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей (метод ВЭЖХ) и не более 10 п.п.м. проинсулина и его производных. При этом выход по массе составляет от 55 до 65% от исходной субстанции натрий инсулина. 2 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2120299
Класс(ы) патента: A61K38/28
Номер заявки: 95109646/14
Дата подачи заявки: 08.06.1995
Дата публикации: 20.10.1998
Заявитель(и): Акционерное Курганское общество "Синтез"
Автор(ы): Луцив В.Р.; Каминская М.И.; Ермолаев А.С.; Габов А.М.
Патентообладатель(и): Акционерное Курганское общество "Синтез"
Описание изобретения: Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к способу получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина животного происхождения, применяемого для лечения сахарного диабета.
Целью изобретения является повышение качества и выхода монокомпонентного инсулина.
Известен способ (1) получения монокомпонентного инсулина, который включает в себя хроматографическую очистку натрий инсулина на катионите, двукратную хроматографию инсулина на сефадексе G-50 st, ионообменную хроматографию на сефадексе QAE - сефадекс A-25 в среде 0,06 M ТРИС-0,02 M HCL-буферного раствора, содержащего 0,08M NaCL и 60% по объему этанола. Для улучшения качества и увеличения выхода монокомпонентного инсулина по предлагаемому способу перекристаллизованный натрий инсулин, содержащий не менее 85% (определено методом ВЭЖХ) монофракций и не более 35 тысяч п.п.м. проинсулина и его производных (определено методом РИА), последовательно подвергают трем хроматографическим очисткам: катионообменной хроматографии на макропористом сульфокатионите КУ-23И отечественного производства в линейном градиенте по значению pH; циркуляционной гельпроникающей хроматографии на сефадексе G-50 sf фирмы Pharmacia; анионообменной хроматографии на среднеосновном анионообменном силикагеле типа РАЕ-300 фирмы Amikon в экспоненциальном градиенте по ионной силе.
Для катионообменной хроматографии, уравновешенный в 0,018-0,022 M фосфатном буфере с pH 6,7-6,8 катионит КУ-23 И с диаметром частиц от 200 до 300 мкм, помещают в хроматографическую колонну и формируют слой насадки высотой не менее 50 см. В колонну при комнатной температуре вводят раствор натрий инсулина в 0,018 - 0,022 M фосфатном буфере с концентрацией инсулина от 0,8 до 1,5% и общим количеством инсулина от 1 до 7 г/л насадки при pH раствора от 6,7 до 6,8. Элюируют инсулин при комнатной температуре 0,018 - 0,022 M фосфатным буфером линейным в течение 2-3 колоночных объемов градиентом по значению pH от 6,7-6,8 до pH 7,9-8,0. Из основной фракции элюата с pH не более 7,4 и с оптической плотностью не менее 2 оптических единиц при длине волны 280 нм (кювета 1 см) выделяют натрий инсулин методом изоэлектрического осаждения при pH 5,3 - 5,5.
Для циркуляционной гельпроникающей хроматографии инсулина набухший, дегазированный и уравновешенный в 1 M уксусной кислоте сефадекс G-50 sf помещают в хроматографическую колонну и формируют слой насадки высотой от 50 до 90 см. Как предпочтительный вариант используют от 2 до 3 одинаковых хроматографических колонн, соединенных последовательно.
В термостатированную при 4-6 oС колонну вводят раствор очищенного на катионите КУ-23И натрий инсулина с содержанием монофракции не менее 95% в 1 M уксусной кислоте с концентрацией инсулина от 4 до 12% и с общим количеством инсулина от 1 до 3,5 г/л насадки при pH раствора от 2,4 до 2,5. Элюируют инсулин 1 M уксусной кислотой со скоростью потока от 5 до 13 мл/см2·ч-1 при температуре от 4 до 6oC. При этом измеряют суммарный объем элюата, выходящего из колонны. Основную часть элюата инсулина, который элюируется в интервале от 0,6-0,7 до 0,9-1,0 объема насадки в колонне, направляют на вход колонны для рециркуляции и продолжают элюирование 1 M уксусной кислотой. Монопиковый инсулин выделяют в виде цинк инсулина из части элюата от 1,45 - 1,50 до 1,75 - 1,85 объема насадки в колонне.
Для анионообменной хроматографии инсулина водную суспензию анионита РАЕ-300 с размером частиц от 35 до 70 мкм помещают в хроматографическую колонну и формируют слой насадки высотой не менее 40 см.
Колонну термостатируют при температуре от 6 до 8oC и уравновешивают элюентом следующего состава: 35-45 мм Трис-HCL, 10-20 мм трилона Б 50-60% (объемных) этанола, PH 7,8-8,5. В колонну вводят охлажденный до температуры 6-8oC раствор монопикового инсулина в элюенте, которым был уравновешен анионит. Концентрация инсулина в растворе от 2 до 2,5%, общее количество инсулина от 3 до 10 мг/л насадки. Элюируют инсулин экспоненциальным градиентом по концентрации хлористого натрия в течение 4,5-5,5 объемов насадки. При этом концентрацию хлористого натрия в элюенте, состав которого описан выше, увеличивают от 0 до 1 M, соблюдая следующую зависимость:
C = K· eN,
где
C - концентрация хлористого натрия в элюенте, M;
K - коэффициент крутизны градиента, K = 0,0041 = 0,0111;
e - основание натурального логарифма, e = 2,71828...;
N - отношение объема элюата к объему насадки.
Элюацию инсулина ведут со скоростью потока от 20 до 45 мл/см2·час-1. Монокомпонентный инсулин выделяют в виде кристаллического цинк инсулина из части элюанта, которая соответствует основному пику с оптической плотностью не менее 0,8 оптических единиц при длине волны 280 нм (кювета 1 см).
Пример 1. 600 г в пересчете на сухое вещество перекристаллизованного натрий инсулина, выделенного из поджелудочных желез свиней, с содержанием монофракции 88,7%, дезамидоинсулина 1,5%, неидентифицированных примесей 9,8% (определено методом ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 26 тысяч п.п.м. (определено методом РИА) растворяют в 60 л 0,02 л М фосфатного буфера при pH 6,75.
119 л уравновешенного в 0,02 М фосфатном буфере при pH 6,75% сульфокатионита КУ-23И помещают в хроматографическую колонну G-45/100 фирмы Amikon с внутренним диаметром 45 см и высотой 100 см, получают слой насадки высотой 75 см.
Полученный раствор натрий инсулина подают со скоростью 795 мл/мин (30 мл/см2·час-1) в хроматографическую колонну. Градиентное элюирование инсулина ведут с такой же скоростью 0,02 М фосфатным буфером: 7,5 часов линейный градиент по значению pH от 6,75 до 8,00, затем 2,5 часа изократическая элюция при pH 8,00. В элюате регистрируют значение pH и оптическую плотность при длине волны 280 нм и длине оптического пути 1 см. Собирают элюат с оптической плотностью более 2-х оптических единиц и со значением pH не более 7,4. Получают 83 л элюата с оптической плотностью 5,9 оптических единиц. Элюат охлаждают до температуры 4oC и 10%-ным раствором HCL устанавливают pH 5,35. Выпавший осадок инсулина отделяют центрифугированием. Получают 482 г в пересчете на сухое вещество инсулина с содержанием монофракции 97,7%, дезамидоинсулина 1,3%, неидентифицированных примесей 1,1% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 900 п.п.м. (метод РИА).
Полученный осадок инсулина растворяют в 5 л охлажденной до 4oC 1М уксусной кислоты. Ледяной уксусной кислотой устанавливают pH 2,45.
170 л уравновешенного в 1 М уксусной кислоте сефадекса G-50 sf помещают в две хроматографические колонны BPSS 600/300 фирмы Fharmacia с внутренним диаметром 60 см и высотой 30 см (фиг. 1). Колонны соединяют последовательно, получают слой насадки высотой 60 см. Колонны термостатируют при 4oC.
Полученный раствор инсулина с содержанием монофракции не менее 95%, со скоростью 400 мл/мин (8,5 мл/cм2·ч-1) подают в хроматографические колонны. Элюирование инсулина ведут охлажденной до 4oC 1 М уксусной кислотой со скоростью 400 мл/мин. Первые 88 л элюата сбрасывают в отходы, следующие 22 л элюата собирают в сборник для хвостовых фракций, следующие 60 л элюата направляют на вход хроматографических колонн для рециркуляции, при этом временно прекращают подачу элюата.
После этого продолжают элюирование: 43 л элюата сбрасывают в отходы, следующие 42 л в сборник для хвостовых фракций и 50 л элюата собирают в сборник для основной фракции. Получают 50 л основной фракции с оптической плотностью 6,6 оптических единиц при длине волны 280 нм (кювета 1 см). В элюат при охлаждении до 4oC добавляют 1650 мл 10% раствора цинка уксуснокислого и 12,5% раствором аммиака устанавливают pH 7,0. Выпавший в осадок цинк инсулина отделяют центрифугированием. Получают 324,5 г в пересчете на сухое вещество цинк инсулина с содержанием монофракции 98,0%, дезамидоинсулина 1,3%, неидентифицированных примесей 0,7% (метод ВЭЖК) и с содержанием проинсулина и его производных 6,5 п.п.м. (метода РИА).
В элюат хвостовых фракций с объемом 64 л и оптической плотностью 2,3 оптических единиц добавляют 740 мл 10% раствора цинка уксуснокислого и при охлаждении до 4oC при pH 7,0 осаждают цинк инсулин, как было описано выше для основной фракции элюата. Полученный осадок цинк инсулина растворяют в 6,5 л подкисленной HCl до pH 3,0 дистиллированной воды, добавляют 48,4 г трилона Б, устанавливают 20% раствором гидроокиси натрия pH 8,5, добавляют 380 г хлористого натрия и перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре. Образовавшиеся кристаллы натрий инсулина отделяют центрифугированием и промывают 2 л 0,5 М раствора хлористого натрия. Получают 139,5 г в пересчете на сухое вещество натрий инсулина, который очищают методом циркуляционной гельпроникающей хроматографии, как было описано выше для осадка инсулина после катионообменной хроматографии. Для сохранения оптимальной нагрузки на сефадекс предпочтительно накапливать для очистки хвостовые фракции от 3-х опытов. Получают 91,5 г в пересчете на сухое вещество цинк инсулина с содержанием монофракции 97,7%, дезамидоинсулина 1,4%, неидентифицированных примесей 0,9% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 5,0 п.п. м. (метод РИА).
Цинк инсулин, полученный из хвостовых фракций (91,5 г) и из основной фракции (324,5 г) объединяют и растворяют в 18 л подкисленной HCl до pH 3,0 дистиллированной воды, добавляют 134 г трилона Б, устанавливают 20% раствором гидроокиси натрия pH 8,5 и добавляют 1053 г хлористого натрия, перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре. Образовавшиеся кристаллы натрий инсулина отделяют центрифугированием и промывают 6 л 0,5 М раствора хлористого натрия. Получают 407,5 г в пересчете на сухое вещество монопикового натрий инсулина с содержанием монофракции 97,7%, дезамидоинсулина 1,3%, неидентифицированных примесей 0,8% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 6,2 п.п.м. (метод РИА).
79 л анионита РАЕ-300 помещают в 2 хроматографические колонны G 45/25 фирмы Amikon с внутренним диаметром 45 см и высотой 25 см. Колонны соединяют последовательно, получают слой насадки высотой 50 см. Колонны термостатируют при 6oC и уравновешивают охлажденным до 6oC элюентом следующего состава: 40 мм Трис/HCL, 10 мм трилона Б, 50% (объемных) этанола, pH 7,95.
Монопиковый натрий инсулин (407,5 г) растворяют в 18 л охлажденного до 6oC элюента с тем же составом, который применялся для уравновешивания анионита РАЕ-300 в колоннах. Полученный раствор монопикового инсулина подают в хроматографические колонны со скоростью 660 мл/мин (25 мл/см2·ч-1). С этой же скоростью элюируют инсулин, применяя экспоненциальный градиент по концентрации хлористого натрия. При этом концентрацию хлористого натрия в элюенте увеличивают от 0 до 1,0 М, соблюдая следующую зависимость:
C = 0,0067 · 2,71828N,
где
C - концентрация NaCl в элюенте;
N - отношение объема элюата к объему насадки в колонне.
Выходная кривая элюирования инсулина и форма градиента показаны на фиг. 2. При элюации регистрируют оптическую плотность элюата при длине волны 280 нм (кювета 1 см) и электропроводность. Монокомпонентный инсулин выделяют из части элюата, соответствующей основному пику с оптической плотностью более 0,8 оптических единиц. Получают 40 л элюата с оптической плотностью 9,7 оптических единиц. В элюат при температуре 4oC добавляют 60 л 2,17% раствора лимонной кислоты, затем 1940 мл 5% раствора хлористого цинка. Раствор фильтруют через фильтр с диаметром пор не более 0,2 мкм. При перемешивании и температуре 4oC ведут кристаллизацию цинк инсулина, дробно снижая значение pH от 8,2 до 6,0. Полученные кристаллы отделяют центрифугированием при температуре 4oC, промывают охлажденным до 0oC 20% этанолом, затем охлажденным до -10oC 96,6% этанолом и сушат при комнатной температуре под вакуумом. Получают 412,6 г (375,5 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного инсулина, не содержащего дезамидоинсулина, с содержанием монофракции 99,3%, неидентифицированных примесей 0,7% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 3,2 п.п.м. (метод РИА). Выход по массе составил 62,6% от неочищенной субстанции натрий инсулина. Выход по монофракции инсулина 70,1%.
Качество инсулина, очищенного по известному способу при прочих равных условиях следующее: содержание монофракции 97,8%, содержание дезамидоинсулина 0,5%, содержание неидентифицированных примесей 1,7% (метод ВЭЖХ), содержание проинсулина и его производных 9,5 п.п.м. (метод РИА). При этом выход по массе составил 25,6% от неочищенной субстанции, выход по монофракции инсулина 28,2%.
Пример 2. Повторяют все процедуры по примеру 1, но исходным материалом является перекристаллизованный натрий инсулин, выделенный из поджелудочных желез крупного рогатого скота: 600 г в пересчете на сухое вещество инсулина с содержанием монофракции 86,9%, дезамидоинсулина 1,3%, неидентифицированных примесей 11,8% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 32 тысячи п.п.м. (метод РИА).
После очистки на сульфокатионите КУ-23И получают 446,9 г в пересчете на сухое вещество инсулина с содержанием монофракции 97,5%, дезамидоинсулина 1,2%, неидентифицированных примесей 1,3% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 4100 п.п.м. (метод РИА).
После очистки на сефадексе G-50 sf получают 395,5 г в пересчете на сухое вещество монопикового инсулина с содержанием монофракции 97,9%, дезамидоинсулина 1,2%, неидентифицированных примесей 0,9% (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 7,8 п.п.м. (метод РИА).
После очиcтки монопикового инсулина на анионите РАЕ-300 получают 387,8 г (356,8 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного инсулина с содержанием монофракции 99,2%, неидентифицированных примесей 0,8%, не содержащего дизамидоинсулина (метод ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина и его производных 3,6 п.п.м. (метод РИА).
Выход по массе составил 59,5% от взятого на очистку исходного натрий инсулина, выход по монофракции инсулина 67,9%.
Качество инсулина, очищенного по известному способу при прочих равных условиях следующее: содержание монофракции 97,9%, содержание дезамидоинсулина 0,6%, содержание неидентифицированных примесей 1,5% (метод ВЭЖХ), содержание проинсулина и его производных 8,5 п.п.м. (метод РИА). При этом выход по массе составил 23,9% от неочищенной субстанции, выход по монофракции инсулина 26,4%.
Источники информации
1. Обзорная информация. Сер. Химико-фармацевтическая промышленность. Методы выделения и очистки инсулина. - Москва, 1981.
Формула изобретения: Способ получения монокомпонентного инсулина, включающий очистку натрий инсулина катионообменной хроматографией на макропористом катионите, гельпроникающую хроматографию на сефадексе G-50, элюцию целевого продукта уксусной кислотой, отличающийся тем, что сульфокатионит КУ-23И с диаметром частиц 200 - 300 мкм помещают в хроматографическую колонну, уравновешивают 0,018 - 0,022 М фосфатным буферным раствором pH = 6,7 - 6,8, вводят раствор инсулина с концентрацией 0,8 - 1,5% и общим количеством инсулина 1 - 7 г/л сульфокатионита с содержанием монофракции не менее 85% в том же буферном растворе, элюируют 0,018 - 0,022 М фосфатным буферным раствором линейным в течение 2 - 3 объемов сульфокатионита в колонне градиентом по значению pH от 6,7 - 6,8 до pH = 7,9 - 8,0, затем при проведении гельпроникающей хроматографии раствор натрий инсулина с содержанием монофракции не менее 95%, с концентрацией инсулина 4 - 12%, с общим количеством инсулина 1 - 3,5 г/л сефадекса при температуре 4 - 6oC вводят на сефадекс, элюируют со скоростью 5- 13 мл/см2 ч-1, при этом часть элюата инсулина, полученную в интервале от 0,6 - 0,7 до 0,9 - 1,0 объема сефадекса в колонне рециркулируют и продолжают элюирование с последующим выделением монопикового инсулина из этой части элюата в интервале от 1,45 - 1,50 до 1,75 - 1,85 объема сефадекса в колонне, затем 2,0 - 2,5%-ный раствор в водно-спиртовом элюенте монопикового инсулина с общим количеством инсулина 3 - 10 г/л силикагеля с pH = 7,8 - 8,5 вводят при температуре 6,0 - 8,0oC в хроматографическую колонну с анионообменным силикагелем, уравновешенным в элюенте с pH = 7,8 - 8,5, состоящим из 35 - 45 мм ТРИС/HCl, 10 - 20 мм трилона Б, 50 - 60 об% этанола, элюируют при температуре 6 - 8oC со скоростью 20 - 45 мл/см2 ч-1 этим же элюентом, концентрация хлористого натрия, в котором в течение 4,5 - 5,5 объемов силикагеля в колонне увеличивается от 0 до 1,0 М по экспоненте и описывается следующим выражением:
C = K · eN,
где
C - концентрация хлористого натрия в элюенте, М/л;
K - коэффициент крутизны градиента,
K = 0,0041 - 0,0111,
e - основание натурального логарифма,
e - 2,71828...
N - отношение объема элюента к объему насадки в колонне.