Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

—ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER, ¬ј ÷»Ќј ƒЋя »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ѕј——»¬Ќќ… «јў»“џ ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ ѕ–ќ“»¬ »Ќ‘≈ ÷»» HELICOBACTER » —ѕќ—ќЅ ќ÷≈Ќ » ЁЌƒќ√≈ЌЌќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, »Ќ‘»÷»–ќ¬јЌЌџ’ HELICOBACTER - ѕатент –‘ 2125891
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
—ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER, ¬ј ÷»Ќј ƒЋя »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ѕј——»¬Ќќ… «јў»“џ ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ ѕ–ќ“»¬ »Ќ‘≈ ÷»» HELICOBACTER » —ѕќ—ќЅ ќ÷≈Ќ » ЁЌƒќ√≈ЌЌќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, »Ќ‘»÷»–ќ¬јЌЌџ’ HELICOBACTER
—ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER, ¬ј ÷»Ќј ƒЋя »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ѕј——»¬Ќќ… «јў»“џ ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ ѕ–ќ“»¬ »Ќ‘≈ ÷»» HELICOBACTER » —ѕќ—ќЅ ќ÷≈Ќ » ЁЌƒќ√≈ЌЌќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, »Ќ‘»÷»–ќ¬јЌЌџ’ HELICOBACTER

—ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER, ¬ј ÷»Ќј ƒЋя »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я «јў»“Ќќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј Ќј »Ќ‘≈ ÷»ё HELICOBACTER ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»–ќ¬јЌ»я ѕј——»¬Ќќ… «јў»“џ ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’ ѕ–ќ“»¬ »Ќ‘≈ ÷»» HELICOBACTER » —ѕќ—ќЅ ќ÷≈Ќ » ЁЌƒќ√≈ЌЌќ√ќ »ћћ”ЌЌќ√ќ ќ“¬≈“ј ” ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, »Ќ‘»÷»–ќ¬јЌЌџ’ HELICOBACTER

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к профилактике и лечению желудочной инфекции у млекопитающих, в том числе у человека. ¬ млекопитающем - хоз€ине индуцируют защитный иммунный ответ против инфекции Helicobacter путем введени€ иммуногенно эффективного количества уреазы или субъединиц уреазы Ќelicobacter в качестве антигена. ƒл€ индуцировани€ защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter используют вакцину, содержащую в качестве антигена полиаминокислотный препарат, представл€ющий эпитопы, про€вл€емые уреазой, эндогенной дл€ организма. ќценку иммунного ответа у млекопитающих, инфицированных Helicobacter, осуществл€ют путем определени€ в пробе, отобранной из желудочно-кишечного тракта, присутстви€ антител, реагирующих с эпитопами, про€вл€емыми уреазой, эндогенной дл€ Helicobacter. 4 с. и 23 з.п.ф-лы, 6 ил., 6 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2125891
 ласс(ы) патента: A61K39/106, C12N15/55
Ќомер за€вки: 94037239/13
ƒата подачи за€вки: 02.11.1993
ƒата публикации: 10.02.1999
«а€витель(и): ќравакс, »нк. (US)
јвтор(ы): ѕьер ћишетти (CH); јндре Ѕлюм (CH);  атрин ƒавен (FR); –айнер ’аас (DE); »рен  ортези-“елаз (CH); ∆ан-ѕьер  рехенбюль (CH); Ёмили€ —арага (CH)
ѕатентообладатель(и): ќравакс, »нк. (US)
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к профилактике и лечению желудочной инфекции у млекопитающих, в том числе у человека. Ѕолее конкретно данное изобретение касаетс€ вакцины, пригодной дл€ применени€ дл€ профилактики и лечени€ инфекции Helicobacter у млекопитающих, в том числе у человека, и способа лечени€ больных, страдающих от желудочной инфекции, ее последствий, таких, как хронический гастрит или пептическа€ €зва, и профилактики рака желудка.
»нфекци€ микроорганизмов Helicobacter эпители€ желудка человека, вызывающа€ гастрит, €вл€етс€ основным фактором в развитии пептических €зв и лимфомы желудка и может быть фактором риска дл€ развити€ рака желудка /1 - 3/. Ќаиболее частным инфекционным агентом €вл€етс€ Helicobater pylori, за ним следует с гораздо меньшей частотой Helicobater heilmanii. H.pylori представл€ет собой тонкий S-образный грамотрицательный микроорганизм, который рутинно получают из желудочных биопсий взрослых и детей с гистологическим подтверждением гастрита или пептической €звы. ƒоказательство причинной св€зи между H. pylori и гастродуоденальным заболеванием получено в исследовани€х, проведенных на добровольцах, больных с €звами и раком желудка, гнотобиотических свинь€х и не содержащих возбудителей инфекций грызунах. „то касаетс€ этиологии, постулаты  оха были удовлетворены развитием гистологически подтвержденного гастрита в ранее не инфицированных индивидуумах после поглощени€ жизнеспособных микроорганизмов /4 - 11/ и лечением дл€ ликвидации H. pylori с исчезновением гастрита, у больных с пептической €звой, снижение скорости рецидивов /12/.
¬опреки чувствительности in vitro ко многим антимикробным агентам очень часто трудно добитьс€ ликвидации установленных инфекций H. pylori при помощи антимикробных агентов in vitro /13/. ћикроорганизм обнаружен внутри слизистой оболочки, покрывающей эпителей желудка, и в желудочных €мках. Ёти местоположени€, по-видимому, не позвол€ют достичь адекватных антимикробных уровней, даже при пероральном введении антибиотиков в высокой дозе. ¬ насто€щее врем€ больша€ часть специалистов рекомендует "тройную терапию", а именно соль висмута в сочетании с лекарственными средствами, такими, как тетрациклин и метронидазол, в течение 2 - 4 недель. ќднако эффективность этого или других химиотерапевтических режимов остаетс€ субоптимальной.  роме того, такое лечение может вызывать серьезные побочные реакции.
¬ насто€щее врем€ мало известно относительно роли иммунной системы слизистой оболочки в желудке. –аспределение продуцирующих иммуноглобулин /Ig/ клеток в нормальном желудочном пространстве указывает, что продуцирующие IgA клетки плазмы составл€ют 80% всей попул€ции клеток плазмы.  роме того, число продуцирующих IgA клеток плазмы, присутствующих в желудочном пространстве, сравнимо с другими покрытыми слизью мембранами /14,15/. –€д исследований на человеке /16/ и животных модел€х /8, 10/ продемонстрировали специфические IgG и IgA ответные реакции в сыворотке и в желудочных секреци€х в ответ на инфекцию Helicobacter. ќднако наблюдение, что инфекци€ H. pylori сохран€етс€ в виде хронической инфекции годами вопреки индукции местного и общего иммунного ответа, не вдохновл€ет на развитие стратегий иммунизации.
Lee et al. сообщили о способности инфицировать не содержащих возбудителей заболеваний грызунов бактерии Helicobacter felis, близко родственной H. pylori, и воспроизводимо документировали гистологический гастрит /9, 10/. — тех пор эта пара бактери€-хоз€ин была прин€та в качестве хорошей модели дл€ исследовани€ вызываемого Helicobacter гастрита и инициирующих его факторов /17/. Czinn et al. показали, что повтор€ема€ пероральна€ иммунизаци€ неочищенным лизатом H. pylori с холерным токсином в качестве адьюванта индуцирует сильный желудочно-кишечный у мышей и хорьков в виде образовани€ антител против H. pylori /13/.  роме того, Chen et al и Czinn et al недавно сообщил, что пероральна€ иммунизаци€ неочищенным лизатом H. felis индуцировала защиту против инфекции H. felis у мышей /21, 22/. ќднако точна€ природа антигена /антигенов/, ответственных за индикацию этой защиты, не была определена, и ни в одной из информаций нет предположений о том, что защитный антиген /антигены/ H. felis, которые индуцируют защиту против этого патогена, будут индуцировать перекрестно-реактивную защиту против другого вида Helicobacter.
ћы впервые показали, что H. pylori и H. felis, разрушение ультразвуком, вызывают образование антител и некоторые из антител против H. pylori могут давать перекрестную реакцию с H. felis и наоборот /24, 25/. ќснова этой перекрестной реактивности неизвестна.
Ќа основе гемологии, существующей между различными аминокислотными последовательност€ми различных известных уреаз, было сделано предположение, что уреаза могла бы примен€тьс€ в качестве вакцины против H. pylori /26/. “ем не менее кросс-реактивность не €вл€етс€ правилом. Guo и Liu показали несколько лет назад, что уреазы Proteus vulgaris, Proteus mirabilis и Providencia rettgeri обнаруживают кросс-реактивность друг с другом, тогда как уреазы канавалии мечевидной и Morganella morganii иммуннологически отличаютс€ перекрестна€ реактивность уреазы H. pylori с другими уреазами других Helicobacter была разумным требованием, не было данных, демонстрирующих, что она имеет место, до тех пор, пока мы не показали, что часть моноклональных антител против H. felis прекрасно реагировали с уреазой H.pylori /25/. ¬ дальнейшем J.Pappo показал, что мыши, инфицированные H.felies, продуцируют антитела, которые прекрасно реагируют с уреазой H.pylori, но не с уреазой канавалии мечевидной (J.Pappo, неопубликованные данные, 1993).
ѕрименение уреазы H. pylori или родственных уреаз в качестве вакцины против инфекции H.pylori было предложено ранее A.Labigne в ≈–ќ 367 644 /28/. ќднако эта за€вка не содержит доказательства вакцинации какого-либо млекопитающего против какой-либо инфекции Helicobacter при помощи уреазы.
Ѕолее того, в то врем€ как гомологи€ последовательности с другими бактериальными уреазами может поддерживать применение уреазы в качестве кандидата на применение в вакцине против H.pylori, текущие знани€ об инфекции H.pylori у человека не поддерживают возможность применение уреазы. ¬о-первых, вопреки факту, что инфицированные индивидуумы часто дают сильную ответную реакцию с образованием антител на уреазу, иммунный ответ в виде антител против уреазы не приводит к удалению бактерий или контролю инфекции. ¬о-вторых, H.pylori способна выводить уреазу из клетки и сбрасывать ее с поверхности клетки /19, 20/. ѕоэтому уреаза может не представл€ть собой подход€щую мишень дл€ развити€ защитного иммунного ответа слизистой оболочки. ƒействительно считают, что иммунна€ защита слизистой оболочки опосредована в основном секреторным IgA, агглютинирующа€ активность которого будет ослаблена, если узнаваемый антиген может быть сброшен патогеном-мишенью и вследствие этого служить ловушкой дл€ защитных антител. ¬-третьих, уреаза, по-видимому, токсична дл€ эпителиальных клеток в культуре, и предполагают, что она принимает участие в разрушении слизистой оболочки и в образовании пептических €зв in vivo. —ледовательно, ее применение в качестве антигена может быть токсичным.
Ќесмотр€ на это мы решили, что этот антиген не мог бы быть потенциально эффективной вакциной, если:
- во-первых, мы вводили бы ее перорально в достаточно высокой дозе, чтобы вызвать более сильный иммунный ответ, чем природно наблюдаемый ответ,
- во-вторых, количество продуцируемых антител было бы достаточно высоким, чтобы св€зывать всю уреазу, сброшенную и несброшенную микроорганизмом,
- в-третьих, мы примен€ли бы субъединицы уреазы или вид молекул, которые не €вл€ютс€ токсичными.
 ороче говор€, остаетс€ потребность в эффективном лечении и профилактике вызываемой H.pylori желудочной инфекции у человека. ѕолученные недавно данные предполагают возможность получени€ вакцины против этого заболевани€, но не дают €сной идентификации определенного антигена /антигенов/, общей дл€ всех штаммов H. pylori, которые могли бы быть включены в надежную и эффективную вакцину.
¬ данном изобретении мы идентифицировали уреазный антиген H.pylori как кандидат дл€ вакцины и показали его эффективность на модели животных. Ёти результаты были неожиданными в свете естественной истории инфекций, называемых Helicobacter.
Ѕыло обнаружено, что можно индуцировать иммунитет у млекопитающих, восприимчивых к желудочно-кишечной инфекции, вызываемой Helicobacter, путем использовани€ эпитопов уреазы, про€вл€ющихс€ на или около поверхностей организмов Helicobacter, и применени€ их в качестве вакцины-мишени /целевой вакцины/. »ммунитет можно было индуцировать при помощи природной уреазы, но также субъединицы рекомбинатной уреазы, продуцируемой в виде ферментативно неактивной, т. е. нетоксичной формы. »зобретение обеспечивает способ индуцировани€ иммунитета к инфекции Helicobacter путем введени€ на поверхность слизистой оболочки млекопитающего полиаминокислотного препарата, т.е. смеси пептидов и/или белков, вместе с подход€щим адьювантом. Ётот полиаминокислотный препарат представл€ет множество эпитопов, характерных дл€ уреазного фермента, эндогенного дл€ инфицированного организма Helicobacter. ¬ведение полиаминокислотного препарата можно проводить пероральным путем.
јктивный ингредиент препарата может содержать природные или биосинтетические эпитопы и быть в различных формах. Ќеисчерпывающий перечень возможных препаратов включает в себ€ очищенные, встречающиес€ в природе или рекомбинантные препараты бактериального или иного происхождени€, переваренные ферментами препараты уреазы, слитые белки, содержащие эпитопы уреазы, усеченные формы уреазы или пептиды, гомологичные аминокислотной последовательности уреазы. ѕоскольку развитие иммунитета зависит от индукции гуморальных или/и клеточных иммунных ответных реакций, которые св€зывают инфицирующий организм Helicobacter, предпочтительными препаратами €вл€ютс€ те, которые наиболее точно воспроизвод€т эпитопы уреазы, эндогенной дл€ инфицирующего организма. Ќапример, препараты, обнаруживающие эпитопы уреазы H.pylori, предпочтительны дл€ введени€ больным, восприимчивым к H.pylori. ќднако согласно важному аспекту данного изобретени€, было обнаружено, что можно примен€ть также и уреазу из других видов. Ќапример, мы показали, что инфекцию H. felis у мышей можно предупредить введением уреазы из H.pylori.
—огласно одному аспекту изобретени€ обеспечен способ индуцировани€ в млекопитающем-хоз€ине защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter, предусматривающий введение к поверхности слизистой оболочки хоз€ина иммунологически эффективного количества антигена уреазы, способного индуцировать защитный иммунный ответ, предпочтительно уреазы H.pylori или B субъединицы уреазы H.pylori.
—огласно другому аспекту данного изобретени€ обеспечена композици€ вакцины, пригодна€ дл€ предупреждени€ инфекции Helicobacter, содержаща€ эффективное количество антигена, предпочтительно уреазы H.pylori или субъединицы B уреазы H.pylori, способного вызывать в хоз€ине защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter, в соединении с фармацевтически приемлемыми носителем или разбавителем.
—огласно дальнейшему аспекту данного изобретени€, обеспечен способ наделени€ млекопитающего-хоз€ина пассивной защитой против инфекции Helicobacter, предусматривающий введение к поверхности слизистой оболочки хоз€ина иммунологически эффективного количества антител, специфических дл€ уреазы, продуцируемых в хоз€ине, иммунизированном уреазой, предпочтительно уреазой H. pylori или субъединицей B H.pylori, способными вызывать защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter.
»зобретение будет описано далее со ссылкой на сопутствующий рисунки, в которых фиг. 1 - фиг. 6 €вл€ютс€ графическими представлени€ми результатов, даваемых в табл. 1 - 6.
јвторы данного изобретени€ обнаружили, что пероральное введение полиаминокислотных препаратов, имеющих эпитопы уреазы H.pylori, дает повышение защитного иммунологического ответа против H.felis у мышей, модели животных общеприн€той значимости дл€ исследовани€ иммунного ответа на инфекцию Helicobacter /9/. Ёффект защитного иммунного ответа заключаетс€ в том, что иммунизированные животные при введении патогена обнаруживают значительно сниженную частоту инфицировани€ по сравнению с неиммунизированными животными.  роме того, авторы изобретени€ обнаружили, что пероральна€ иммунизаци€ мышей с применением субъединицы B H.pylori, полученной в виде ферментативно неактивного рекомбинантного белка, дает повышение защитного иммунологического ответа у мышей против H. felis. Ёффект этого защитного иммунного ответа заключаетс€ в том, что иммунизированные животные при введении патогена обнаруживают также значительно сниженную частоту инфицировани€ по сравнению с неиммунизированными животными, которые действительно заражаютс€.
“аким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ индуцировани€ в млекопитающем-хоз€ине защитного иммунного ответа против инфекции Helicobacter. —пособ предусматривает стадию введени€ к поверхности слизистой оболочки млекопитающего, в том числе человека, иммунологически эффективного количества антигена уреазы, предпочтительно уреазы H.pylori, способного индуцировать такой защитный иммунный ответ.
¬о втором аспекте данное изобретение обеспечивает способ индуцировани€ в млекопитающем-хоз€ине защитного иммунного ответа против инфекции Helicobacter. —пособ предусматривает стадию введени€ к поверхности слизистой оболочки животного, в том числе человека, иммунологически эффективного количества антигена субъединицы B рекомбинантной ферментативно неактивной уреазы, предпочтительно субъединицы B рекомбинантной уреазы H.pylori, способного индуцировать такой защитный иммунный ответ.
»зобретение предусматривает также внутри сферы его действи€ лечение или профилактику млекопитающих, в том числе человека, от вызываемой Helicobacter инфекции, иммунологически эффективное количество уреазы или ее единицы, способных индуцировать защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter, ввод€т к поверхности слизистой оболочки больного. ѕредпочтительной уреазой €вл€етс€ уреаза H.pylori или субъединица B H.pylori. ”реаза может вводитьс€ отдельно или в соединении с гидроксилированным фосфатом кальци€, например гидроксиапатитом, в качестве частицы-носител€.  роме того, предпочтительно введение уреазы H.pylori в соединении с адьювантом дл€ слизистой оболочки, субъединицей B холерного токсина, мурамилдипептидом или другими подобными адьювантами.
Ќе будучи св€занными какой-либо теорией, авторы данного изобретени€ убеждены, что введение антигена уреазы или ее субъединицы B к поверхности слизистой оболочки стимулирует общую иммунную систему слизистой оболочки и, возможно, локальные сайты в слизистой оболочке желудка, в том числе по€вление IgA антител, специфических дл€ H.pylori, в желудочных секреци€х, которые предупреждают инфекцию Helicobacter. ѕоскольку проведение предклинических испытаний кандидатов-вакцин дл€ применени€ в лечении человека на модел€х животных €вл€етс€ рутинным, авторы считают, что методологи€ данного изобретени€ эффективна дл€ человека, в частности, в профилактике и лечении пептических €зв, гастрита, злокачественных заболеваний желудка и других состо€ний, возникающих как результат присутстви€ H.pylori и/или H.heilmanii. A-Ѕактериальные культуры и очистка уреазы.
Ўтамм H.pylori, примен€емый в этом исследовании, происходил из больного с €звой двеннадцатиперстной кишки и был субкультивирован на чашках с BHI агарозой до гомогенности. H.pylori культивировали в подход€щей среде, обычно в BHI /Brain-Heart Ifusion/ среде, содержащей 0,25% дрожжевого экстракта и 10% эмбриональной сыворотки теленка с добавлением 0,4% селективного комплемента Campylobacter/ конглютинин Skirrow; Oxoid 69/. Ѕактерии инкубировали в течение ночи при микроаэрофильных услови€х при 37oC в колбах, которые закрывали герметично и встр€хивали при 37oC в течение 2 - 3 дней дл€ получени€ жидкой культуры.  ультуру можно также приготовить на чашках с агарозой, содержащей BHI с 0,25% дрожжевого экстракта и 5% овечьей крови при микроаэрофильных услови€х при 37oC в течение 3 дней.  оличество бактерий определ€ли по оптической плотности раствора BHI при 660 нм, причем одна единица оптической плотности соответствовала 108 бактерий.  ультуры на чашках с агарозой перед этим ресуспендировали в 154 мл NaCl.
ќдним из предпочтительных в насто€щее врем€ источников полиаминокислоты, несущей эпитопы уреазы, €вл€етс€ очищенна€ уреаза, например уреаза H.pylori, полученна€ по особому способу Duann et al., J.Biol. Chem. 265, 9464 - 9469, модифицированному как описано ниже. ѕосле культивировани€ H.pylori собирали в воду, перемешивали вращением и откручивали еще раз дл€ получени€ супернатанта. «атем раствор, содержащий уреазную активность H.pylori /оцениваемую по быстрому тесту на уреазу, см. ниже/, хроматографировали на колонке CL-6B и фракции, обладающие сильной уреазной активностью, собирали и диализовали в течение ночи и вновь хроматографировали на анионо-обменном геле. ‘ракции элюировали в буфере с NaCl с увеличивающейс€ концентрацией и собранные фракции с сильной уреазной активностью подвергали раздельно гель-электрофорезу с DC-Na с последующим окрашиванием  умасси. ƒве отдельные полосы с мол. массами приблизительно 63 и 29 кƒа идентифицировали как уреазу. ‘ракции, содержащие уреазу, соедин€ли вместе, получа€ очищенную уреазу H.pylori с чистотой 95 - 99%.
B-ѕероральна€ иммунизаци€ уреазой, очищенной из H.pylori.
’от€ предпочтительно примен€ть очищенную уреазу H.pylori, полученную, как описано, в качестве антигенного материала, следует понимать, что также можно использовать в качестве антигенного материала любую уреазу или ее субъединицу, либо встречающиес€ в природе либо полученные техникой рекомбинантной ƒЌ , а также переваренный фрагмент уреазы, слитые белки, содержащие фрагменты целой уреазы, усеченные конструкции уреазы и другие пептидные или белковые препараты, про€вл€ющие эпитопы уреазы, которые способны индуцировать защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter /см. ниже/. “аким образом, можно примен€ть уреазу, имеющую существенную гомологию относительно уреазы H.pylori и эффективную в индуцировании защитной перекрестной иммунной ответной реакции на Helicobacter. ѕримером такой уреазы €вл€етс€ уреаза канавалии мечевидной, котора€ имеет 70% гомологии с уреазой H.pylori. »зобретение, следовательно, не лимитировано применением интактной уреазы и охватывает применение любого полиаминокислотного препарата, который имеет эпитопы уреазы и эффективен в генерировании защитного иммунологического ответа у хоз€ина на инфекцию Helicobacter. ќбычно уреаза, имеюща€ гомологию 70 - 95%, например гомологию 80 - 90%, относительно уреазы H.pylori, может примен€тьс€ в качестве уреазы в данном изобретении.
Ќеограничивающий перечень источников потенциально применимых препаратов уреазы включает в себ€ эндогенные уреазы разных видов Helicobacter, уреазу из других бактерий, таких, как Klebsiella Pneumoniae или Proteus mirabilis, и по аналогии любую другую уреазу при условии, что эти уреазы имеют общие перекрестно реактивные эпитопы с уреазой H.pylori. √ены уреазы всех упом€нутых выше организмов €вл€ютс€ потенциальным инструментом дл€ экспрессии рекомбинантных уреазных продуктов в виде целого белка или в виде его части.
Ќеограничивающий перечень потенциально применимых препаратов уреазы включает в себ€ пептиды, полученные из очищенной уреазы /источники упом€нутые выше) при помощи физических и/или химических способов расщеплени€/ с применением протеаз, например V8-протеазы, трипсина или др./, или пептиды, синтезированные химически и содержащие общие последовательные эпитопы с уреазой.
ƒругими потенциально применимыми эпитопами €вл€ютс€ эпитопы, идентифицированные по их перекрестной реактивности с уреазой в результате скрининга при помощи антител против уреазы. “акими пептидами могут быть природные пептиды или полученные химическим синтезом.  роме того, такие пептиды могут быть результатом экспрессии рекомбинантного произвольного олигонуклеотида.
ƒругим источником потенциально применимых эпитопов €вл€ютс€ эпитопы, подобные уреазе и полученные как результат генерировани€ антиидиотипических антител в уреазе. “акие антиидиотипические антитела, генерируемые в любом иммуннокомпетентном хоз€ине, получают иммунизацией этого хоз€ина антителами противоуреазы дл€ генерировани€ антител против антител против уреазы, которые сохран€ют структурные гомологии с уреазой.
ќбсуждение здесь фокусируетс€ на применении уреазы, природно продуцируемой H. pylori /раздел B/. ќднако должно быть пон€тно, что уреаза или ее субъединицы или конструкции, упом€нутые выше, способные индуцировать желаемый защитный иммунный ответ, могут быть получены техникой рекомбинантной ƒЌ , хорошо известной исследовател€м. Ёффективность отдельных препаратов можно определить рутинным введением с применением моделей животных, пероральными введением кандидата-вакцины и введением патогена с применением протокола, подобного описанной ниже процедуре или идентичного этой процедуре.
“абл. 1 и 2 ниже и фиг. 1 - 5 описывают результаты, полученные при пероральной иммунизации мышей очищенной уреазой H.pylori. ¬ этом первом эксперименте введение антигена H. pylori проводили путем перорального введени€ мышам уреазы H. pylori, очищенной как описано в разделе A, и соединенной с кристаллами гидроксиапатита, примен€емыми в качестве носител€ дл€ усилени€ св€зывани€ M-клеток и поглощени€. ’олерный токсин /Sigma/ давали в качестве адьюванта дл€ слизистой оболочки. ¬ этом эксперименте группы самок SPF BALB/c шестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг очищенной уреазы H. pylori, соединенной с 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина в качестве адьюванта, во временных точках 0, 7, 14 и 21 (дни). «атем мышам вводили дважды 108 H.felis на 28-ой и на 30-ый день. ƒл€ сравнительныхцелей подобные самки SPF BALB/c шестинедельных мышей перорально иммунизировали полным лизатом /гомогенатом, полученным при разрушении клеток ультразвуком/ H.pylori и 10 мкг холерного токсина в те же дни 0, 7-ой, 14-ый и 21-ый. ћышам вводили на 28-ой и 30-ый день H.felis. Ћизат H.pylori получали сбором клеток из клеточных культур, осаждением их центрифугированием, ресуспендированием осадка в 0,9% NaCl с последующей обработкой ультразвуком.
¬ качестве контрол€ самки SPF BALB/c шестинедельных мышей были перорально ложно иммунизированы 10 мкг холерного токсина и 1 мг гидроксиапатита в те же дни 0, 7-ой, 14-ый и 21-ый. ¬сех мышей содержали, иммунизировали и заражали параллельно. ¬сех мышей убивали на 35-ый день.
C - ѕероральна€ иммунизаци€ субъединицами рекомбинантной уреазы H.pylori.
√ены, колирующие структурные единицы A и B уреазы H.pylori, были получены при помощи клонировани€ с применением полимеразной цепной реакции /ѕ÷–/ в соответствии со стандартными процедурами, основывающимис€ на ранее опубликованных последовательност€х /29/. Ёти гены встраивали в вектор /названный pEV 40/, предназначенный дл€ высокоэффективной экспрессии и легкой очистки чужеродных генов в E.coli. ¬кратце чужеродный ген встраивали справа от терморепрессированного промотора и в рамке последовательности, кодирующей повтор из шести гистидинов. ƒл€ отбора трансформаторов на векторе присутствовал ampR ген. ѕри подход€щих температурных услови€х полученный рекомбинантный белок имел шесть гистидинов на N-конце, что делало возможной ее одноступенчатую очистку на содержащей никель колонке.  ак субъединицу A, так и субъединицу B рекомбинантной уреазы H.pylori экспрессировали раздельно в E.coli и очищали на содержащей никель колонке до чистоты 95%.
’от€ предпочтительно применение рекомбинантной уреазы H.pylori, полученной как описано выше, следует понимать, что можно также примен€ть в качестве антигенного материала любую уреазу или субъединицу уреазы, полученные рекомбинантной техникой /например, слитый белок/, имеющие антигенные сайты уреазы, которые способны вызвать защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter. “ак, можно примен€ть конструкцию гена уреазы, имеющей существенную гомологию с уреазой H.pylori и эффективный в индуцировании перекрестного защитного иммунного ответа на Helicobacter. ѕримером такой уреазы €вл€етс€ уреаза канавалии мечевидной, котора€ имеет 70% гомологии с уреазой H.pylori, или уреазой H. felis, котора€ имеет 88% гомологии с уреазой H.pylori. —ледовательно, изобретение не лимитировано применением генов H.pylori и их генных продуктов и включает в себ€ применение любой рекомбинантной уреазы или ее субъединицы, которые эффективны в генерации защитного иммунологического ответа в хоз€ине на инфекцию Helicobacter.  ак правило, рекомбинантна€ уреаза, имеюща€ 70 - 95% гомологии, например 80 - 90% гомологии, с уреазой H. pylori может примен€тьс€ в данном изобретении в качестве антигена рекомбинантной уреазы.
ќбсуждение здесь фокусируетс€ на применении субъединиц A и B рекомбинантной уреазы H.pylori, продуцируемой E.coli /раздел C/. ќднако должно быть пон€тно, что рекомбинантна€ уреаза или ее субъединицы или конструкции, упом€нутые выше, способные вызывать желаемый защитный иммунный ответ, могут быть получены с применением других способов рекомбинантной ƒЌ  и других эукариотических или прокариотических экспрессирующих векторов, хорошо известных в данной области исследований.
“абл. 3, 4 и 5 ниже на фиг. 6 описывают результаты, полученные при пероральной иммунизации мышей субъединицами уреазы H.pylori, полученными E.coli. ¬ этом эксперименте введение антигена H.pylori проводили пероральным введением мышам субъединиц A или B рекомбинантной уреазы H.pylori, полученных в E.coli и очищенных, как описано выше, и соединенных с кристаллами гидроксиапатита, примен€емых в качестве носител€ дл€ усилени€ св€зывани€ M-клеток и поглощени€. ’олерный токсин /Sigma/ давали в качестве адьюванта слизистой оболочки. ¬ этом эксперименте группы самок SPF/BALB/c шестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг субъединиц A и B рекомбинантной уреазы H.pylori, соединенных с 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина в качестве адьюванта, в дни 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый. «атем мышам трижды вводили 108 H.felis на 32-ой, 34-ый и 36-ой день. ƒл€ сравнени€ подобных самок SPF BALB/c шестинедельных мышей перорально иммунизировали 30 мкг субъединицы B рекомбинантной уреазы H.pylori, соединенной с гидроксиапатитом и 10 мкг холерного токсина, на 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый день. ћышей заражали трижды на 32-ой, 34-ый и 36-ой день H.felis. ¬ качестве контрол€ самок SPF BALB/c шестинедельных мышей перорально ложно иммунизировали 10 мкг холерного токсина и 1 мг гидроксиапатита на 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый день. «атем мышам вводили H.felis на 32-ой, 34-ый и 36-ой день. ¬сех мышей иммунизировали и заражали в параллел€х. ∆ивотных убивали на 48-ой день /через 12 дней после заражени€/ или через 10 недель после заражени€.
D-јнализ желудочных биопсий, крови и кишечных секреций
Ѕиопсии брали из желудка, кровь получали из сердца.  ишечник удал€ли и промывали 1 мћ ‘ћ—‘ /Boeringer/ в PBS буфере дл€ получени€ кишечных секреций дл€ твердофазного иммунноферментного анализа /ELISA/. ƒл€ оценки защиты против колонизации H.felis желудочные биопсии из каждого животного подвергали скринингу на присутствие H.felis путем быстрого определени€ уреазной активности по тесту Tatrox HP/Rohm Pharma/. ¬кратце желудочные биопсии погружали в 0,5 мл смеси поставщика из мочевины и фенолового красного, индикатора pH. ”реазна€ активность продуцирует аммиак и бикарбонат из мочевины и сопровождаетс€ калориметрическим изменением раствора в сторону более высокого поглощени€ при 550 нм. ”реазную активность измер€ют количественно спектрофотометрически.
∆елудочные биопсии каждого экспериментального животного раздела B также культивировали в чашках с BHI агарозой с описанными выше добавками дл€ обнаружени€ H. felis. ѕосле 3 - 10 дней инкубации в микроаэрофильных услови€х присутствие H. felis подтверждали окрашиванием на грамотрицательный или грамположительные бактерии и определением уреазной активности. ѕоскольку наблюдали значительную коррел€цию при детектировании культур H.felis в первой серии экспериментов /см. табл. 3/, то дл€ обнаружени€ H.felis в эксперименте, описанном в разделе C, проводили только уреазные тесты желудочных биопсий. ќбнаружение H.felis подтверждалось микроскопией двум€ независимыми исследовател€ми с применением двух разных красителей /акридинового оранжевого и крезилового фиолетового/.
ѕробы крови коагулировали в течение 3 ч при RT (комнатной температуре), собирали сыворотки и замораживали их при -20oC до проведени€ анализа.  ишечные инфекции откручивали в течение 5 мин при 4oC дл€ удалени€ остатков клеток и хранили замороженными при -20oC. «атем пробы сыворотки и кишечные пробы каждого животного анализировали при помощи ELISA дл€ оценки активности против Helicobacter согласно стандартным процедурам. ¬кратце пластинки с 96 €чейками покрывали гомогенатом, полученным после обработки клеток H.pylori ультразвуком с последующим насыщением 5%-ным обезжиренным молоком. ѕробы сериально разбавл€ли от 1:1 до 1:1000 и инкубировали в течение ночи при 4oC на пластинках ELISA. Ѕиотинилированные IgA против мышей /сыворотка/ и IgA, обработанные затем стрептавидином - пероксидазой хрена, были использованы дл€ определени€ уровней антител.
–езультаты введений H.felis после иммунизаций очищенной уреазы H.pylori представлены в табл. 1 - 3 и фиг. 1 - 4, а результаты введени€ H.felis после иммунизации субъединицами A и B рекомбинантной уреазы H.pylori представлены в табл. 4 - 6 и фиг. 5 и 6.
¬ табл. 1, относ€щейс€ к эксперименту, описанному в разделе B, "ч" обозначает часы, "Ig" обозначает иммуноглобулин, "ND" обозначает "не определ€ли", "уреаза + HF" обозначает, что мышей иммунизировали уреазой /соединенной с гидроксиапатитом и холерным токсином/ и затем заражали H.felis, "уреаза" обозначает, что мышей иммунизировали уреазой (соединенной с гидроксиапатитом и холерным токсином) и не заражали, "CT + HF"обозначает, что мышей ложно иммунизировали холерным токсином и заражали H.felis, "HP Sonicate+ HF" обозначает, что мышей иммунизировали гомогенатом, полученным при обработке клеток H.pylori ультразвуком, с холерным токсином и заражали H.felis, а "HF Sonicate" обозначает, что мышей иммунизировали гомогенатом, полученным обработкой клеток H. pylori ультразвуком, с холерным токсином и не заражали. ¬ табл. 1 числа дл€ результатов с антителами даютс€ как измерение поглощени€ при 595 нм, умноженное на 1000. »змеренный фон в отсутствие антител вычитали.
–езультаты эксперимента, описанного в разделе B, полученные на основе уреазы тестов желудочных биопсий и √рам-окрашивани€ культур H.felis, представлены в табл. 2. »нфекцию определ€ли с применением одного или нескольких маркеров колонизации H. felis, в том числе при помощи уреазного теста или √рам-окрашивани€ культур.
»з результатов, представленных в табл. 1 и 2, видно, что при пероральной иммунизации уреазой H. pylori по сравнению с вариантами, в которых вводили либо гомогенат, полученный обработкой клеток H.pylori ультразвуком, либо холерный токсин, получали статистически значимую защиту против заражени€ H.felis.  ак видно из табл. 2, из 10 иммунизированных животных только 3 инфицировались, по сравнению с 6 животными, иммунизированными гомогенатом клеток H. pylori, полученными при обработки ультразвуком, и 9 животными, иммунизированными холерным токсином. “абл. 2 показывает, что 70% животных были защищены от заражени€ H.felis по сравнению с 33% животных, иммунизированных гомогенатом клеток при обработке ультразвуком, и 10% животных, иммунизированных холерным токсином и подвергнутых затем введению H.felis. ƒругими словами, 90% контрольных мышей, экспонированных с H.felis, были инфицированы патогеном, тогда как у мышей, иммунизированных уреазой H.pylori за 28 дней до экспозиции с H.felis, скорость инфицировани€ была только 30%. Ёто означает значительное снижение заражени€ /p = 0,0198 в точном тесте ‘ишера по сравнению с контрольными мышами/. ѕри пероральной иммунизации мышей гомогенатом клеток H.pylori, полученным при обработке клеток ультразвуком, скорость инфицировани€ была 67% /незначительно отличалась от контрол€/. «ащита, полученна€ с применением уреазы H.pylori, была неожиданной и не могла быть предсказана на основании результатов, наблюдаемых при использовании гомогената клеток H.pylori, полученного при обработке клеток ультразвуком.
‘иг. 1 представл€ет графически результаты тестов на антитела в сыворотке /IgG/ и кишечной секреции /IgA/ у мышей, не защищенных после иммунизации уреазой. Ёти мыши соответствуют нормам 1, 4 и 6 в табл. 1 и составл€ют группу A.
‘иг. 2 показывает ответ в виде образовани€ антител у мышей, которые были защищены после иммунизации уреазой /группа B/, т.е. мышей 2, 3, 5 и 7 - 10.
‘иг. 3 и 4 относ€тс€ к результатам, полученным с мышами 31 - 39. ‘иг. 3 /группа C/ изображает образование антител у мышей, не защищенных после иммунизации гомогенатом H.pylori /номера мышей 31, 32, 33, 35, 36 и 38/. ‘иг. 4 /группа D/ изображает образование антител у мышей, защищенных после иммунизации гомогенатом H.pylori /номера мышей 34, 37 и 39/. »нтересно отметить, в отношении фиг. 3 и 4, что обозначение IgA антител /но не IgG/ выше у мышей защищенных, чем у незащищенных мышей, что предполагает коррел€цию между защитой и образованием IgA антител. ќбразование IgG не обнаруживает подобной коррел€ции.  ак известно, IgA слизистой оболочки, а не IgG сыворотки играют роль в защите против бактериальных инфекций кишечника.
–езультаты коррел€ции между детектированием H.felis в желудочных биопси€х при помощи уреазных тестов и при помощи культур представлены в табл. 3.
“абл. 3 показывает, что существует очень значительна€ коррел€ци€ между результатами уреазных тестов, проведенных на желудочных биопси€х, и идентификацией H.felis в культурах. ¬ дальнейших экспериментах предпочтение отдавали уреазным тестам дл€ диагностики инфекции H.felis в мышах вследствие большей чувствительности этих тестов. Ётот подход позволил проводить уреазные тесты с большими фрагментами желудка каждой мыши и увеличить далее чувствительность уреазного теста.  роме того, применение способа с наивысшей чувствительностью предохран€ет от завышенной оценки защиты, полученной с испытуемыми препаратами. ѕри использовании положительной культуры в качестве стандарта дл€ инфицированна€ защита, индуцированна€ после иммунизации уреазой во врем€ эксперимента, представленного в разделе B, так же значительна, как при применении сочетани€ уреазного теста и культуры /p = 0,021 против p = 0,019/.
–езультаты экспериментов, описанных в разделе C /субъединицы рекомбинантной уреазы/, полученные на основании уреазных тестов желудочных биопсий, представлены в табл. 1, 5 и 6 и изображены на фиг. 6.
¬ табл. 4 "CT" обозначает холерный токсин, "ureA" обозначает субъединицу A уреазы H.pulori, "ureB" обозначает субъединицу B уреазы H.pylori и "HAP" обозначает кристаллы гидроксиапатита. ћышей 20 - 54 убивали через 12 дней после инфицировани€, а мышей 68 - 82 - через 10 недель /106 дней/ после инфицировани€. –езультаты уреазного теста, проведенного на биопси€х желудка каждого животного, представлены в виде величин OD при 550 нм. «наки + и - обозначают конечное состо€ние инфекции каждого животного в соответствии с положительным или отрицательным уреазным тестом дл€ обнаружени€ H.felis. ѕоложительна€ реакци€ соответствует OD 550 > 0,2.
»з результатов, представленных в табл. 4, 5 и 6, видно, что статистически значимую защиту против инфицировани€ H.felis получали при пероральной иммунизации B субъединицей рекомбинантной уреазы H.pylori по сравнению с защитой, полученной с применением либо субъединицы A H.pylori, либо холерного токсина. »з табл. 4 видно, что через 12 дней после инфицировани€ из 10 иммунизированных животных только 3 были инфицированы в группе с субъединицей B уреазы по сравнению с 10 животными, иммунизированными субъединицей A уреазы H.pylori, и 10 из 10 животных, иммунизированных холерным токсином. “абл. 4 показывает, что 70% животных были защищены от инфицировани€ H.felis по сравнению с 0% животных, иммунизированных субъединицей A H.pylori и 0% животных, иммунизированных холерным токсином и затем подвергнутых инфицированию H.felis. ƒругими словами, 100% контрольных мышей, инфицированных H.felis, заражались, тогда как у мышей, иммунизированных субъединицей B рекомбинантной уреазы H.pylori, скорость (коэффициент) инфицировани€ была только 30%. Ёто свидетельствует о значительном снижении инфицировани€ /p = 0,0031, точный тест ‘ишера/, по сравнению с контрольными мышами.
“от факт, что защита, наблюдаема€ при применении уреазы H.pylori, полностью зависела от иммунизации субъединицей B уреазы и субъединица A не давала такого эффекта, не был предсказуем на основании этого эксперимента с очищенной уреазой. —ледовательно, это определение роли 2 структурных субъединиц уреазы в развитии защитного иммунного ответа €вл€етс€ новым. «ащита, полученна€ с применением субъединицы B рекомбинантной уреазы, котора€ ферментативно неактивна, свидетельствует также о том, что нетоксичные формы уреазы могут быть использованы в качестве пероральной вакцины против инфекции Helicobacter.  роме того, эти результаты €вл€ютс€ сильным свидетельством в пользу того, что дл€ защиты не требуетс€ узнавание активного сайта, поскольку едва ли можно думать, что неактивна€ субъединица B уреазы способна индуцировать антитела,которые будут узнавать и ингибировать каталитический сайт нативной уреазы.
»з табл. 6 видно, что в случае, когда мышей убивали через 10 недель после инфицировани€, 60% /6 мышей из 10/ животных, иммунизированных субъединицей B уреазы, и 80% /4 мыши из 5/ животных, иммунизированных субъединицей B H. pylori, были защищены против инфекции H.felis. “от факт, что защита, полученна€ иммунизацией субъединицей B уреазы, сохран€етс€ с течением времени и что иммунизаци€ субъединицей A уреазы вызывает защиту, котора€ исчезает со временем по сравнению с защитой, вызываемой субъединицей B уреазы, был неожиданным после нашего эксперимента с очищенной уреазой или других проведенных ранее экспериментов. ‘акт, что иммунизаци€ субъединицей B уреазы вызывает защиту, определенно доказывает, что дл€ защиты не требуетс€ узнавани€ активного сайта. ‘иг. 6 суммирует результаты, полученные после пероральной иммунизации субъединицами A и B рекомбинантной уреазы /описанные в табл. 5 и 6/.
ƒанное изобретение также обеспечивает композиции вакцин, пригодные дл€ профилактики инфекции Helicobacter. Ёти композиции содержат эффективное количество антигена уреазы, предпочтительно субъединиц уреазы H.pylori или рекомбинантной уреазы H.pylori, способного индуцировать в хоз€ине защитный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter, в соединении с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
¬акцины ввод€т в количествах, легко определ€емых лицами с обычной квалификацией в этой области. “ак, дл€ взрослых подход€ща€ доза лежит в диапазоне 10 мкг - 100 мг, например 50 мкг - 50 мг. Ѕлизкие диапазоны доз применимы дл€ детей. —истемы носител€ могут представл€ть собой капсулы с высвобождением активного компонента в желудке, защищающие антиген от кислой среды в желудке и содержащие антиген уреазы в нерастворимой форме в виде слитых белков. ¬акцина может вводитьс€ в качестве первичного профилактического средства дл€ взрослых и детей, в качестве вторичного профилактического средства, после успешной ликвидации H.pylori в инфицированном хоз€ине или в качестве терапевтического средства с целью индуцировани€ иммунного ответа в хоз€ине дл€ уничтожени€ H.pylori.
 ак отмечалось выше, подход€щим адьювантом дл€ слизистой оболочки €вл€етс€ холерный токсин. ћожно использовать также мурамилдипептид или его производные, нетоксичные производные холерного токсина, в том числе его B-субъединицу, и/или конъюгаты или генетически сконструированные сли€ни€ (слитые белки) антигена уреазы с холерным токсином или его B-субъединицей. ƒругими подход€щими средствами доставки €вл€ютс€ биодеградируемые микрокапсулы или иммуностимулирующие комплексы /IS COM'S/ или липосомы, генетически сконструированные ослабленные живые векторы, такие, как вирусы или бактерии, и рекомбинантные /химерные/ подобные вирусу частицы, например вирусу блутанга /"синего €зыка"/.  оличество адьюванта слизистой оболочки зависит от типа этого адьюванта. Ќапример, в случае холерного токсина его примен€ют в количестве 5 мкг - 50 мкг, в частности 10 мкг - 35 мкг. ¬ случае микрокапсул примен€емое количество будет зависеть от количества, примен€емого в матриксе микрокапсул дл€ достижени€ желаемой дозы. ќпределение этого количества вполне доступно лицам с обычной квалификацией в этой области. ѕригодными носител€ми дл€ вакцин данного изобретени€ €вл€ютс€ желудочные капсулы с покрытием и поликислотные-гликолидные микросферы. ¬ качестве разбавителей пригодны 0,2N NaHCO3 и/или солевой /физиологический/ раствор.
√идроксилированный фосфат кальци€ /HCP/ в виде частиц особенно применим в качестве носител€ дл€ уреазы H. pylori дл€ нанесени€ на поверхность слизистой оболочки. —читаетс€, что конъюгат уреазы H. pylori с гидроксилированным фосфатом кальци€ транспортируетс€ через эпителий, где он вызывает иммунный ответ в виде образовани€ поли - Ig. ѕредпочтительно применение гидроксилированного фосфата кальци€ в форме микрочастиц, пригодных дл€ транспорта через эпителий, в частности клетками, специализированными дл€ этой цели /ћ - клетками/. ѕредпочтительной формой гидроксилированного фосфата кальци€ €вл€етс€ гидроксиапатит, коммерчески доступный кристаллический фосфат кальци€ Ca10(PO4)6(OH)2.
 оммерческий гидроксиапатит обычно состоит из стержнеподобных кристаллов, которые химически и физически аналогичны неорганическому гидроксиапатиту в нормальной костной ткани. ѕоэтому прием внутрь гидроксиапатита €вл€етс€ безопасным, что подтверждаетс€ существованием пищевых кальций-фосфорных добавок, получаемых из размолотых костей и предназначенных дл€ глотани€.  оммерческий очищенный гидроксиапатит /из Cal Biochem/ состоит из кристаллов, широко варьирующих по размеру.  ристаллы длиной более 1 мкм, веро€тно, не поглощаютс€ ћ - клетками. ѕоэтому дл€ применени€ в данном изобретении кристаллы коммерческого гидроксиапатита разбивают на небольшие, относительно однородные кристаллические фрагменты, например, разрушением ультразвуком. ѕредпочтительно основна€ часть гидроксиапатита присутствует в виде фрагментов приблизительно 0,01 - 0,0 мкм. ‘рагментаци€ может быть изменена либо при помощи электронной микроскопии, либо по рассеиванию света обычными способами.
ѕредпочтительными способами введени€ антигена H.pylori €вл€етс€ пероральный, назальный, ректальный и глазной способы. ѕероральный способ введени€ может обеспечить доставку к слизистой оболочки не только желудка, но и кишечника.
¬акцины данного изобретени€ можно вводить к поверхности слизистой оболочки в форме аэрозол€, суспензии, капсулы и/или суппозитори€. —пособ введени€ легко определ€ют лица с обычной квалификацией в этой области.
ƒанное изобретение предусматривает также пассивную иммунизацию млекопитающих, в том числе человека, против инфекции Helicobacter. Ёто достигаетс€ введением к поверхности слизистой оболочки больного эффективного количества специфических дл€ уреазы антител, предпочтительно IgA моноклональных антител, специфических дл€ H.pylori.
ѕоскольку уреаза H. pylori представл€ет антиген, участвующий в индуцировании защитного иммунитета, дальнейшим аспектом данного изобретени€ €вл€етс€ применение уреазы H.pylori в качестве диагностического реагента дл€ измерени€ иммунного ответа лиц, получивших вакцину на основе уреазы, или дл€ определени€ иммунности или восприимчивости /т.е. необходимости вакцинации/ индивидуума. ƒанное изобретение также предусматривает применение уреазы или специфических дл€ уреазы антител дл€ составлени€ реакционных смесей и наборов /китов/ дл€ диагностики иммунитета к инфекции Helicobacter, оценки восприимчивости к инфекции Helicobacter и определени€ иммунного ответа на вакцину.
ѕримеры. ƒалее изобретение будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие изобретение примеры.
a) Ѕактериальные штаммы
H. felis был получен у J Fo /division of Cooperative Medicine, Mass. Institute of Technology, Boston. USA/. H.pylori был выделен из больных с €звенными заболевани€ми /CHUV, Lausanne, Switzer Land/.
b) Ѕактериальные культуры
∆идка€ культура - бактерии культивировали на BHI /Brian Heart Infusion, BioMerieux/ жидкой среде, содержащей 0,25% дрожжевого экстракта /Difco/ и 10% эмбриональной сыворотки теленка Inotech/ с добавлением 0,4% выбранного комплемента Campylobacter /Oxoid/. Ѕактерии инкубировали в течение ночи при микроаэрофильных услови€х при 37oC и затем качали при 37oC в течение 2 - 3 дней.
 ультура на агарозных чашках - бактерии культивировали на агарозных чашках, содержащих BHI, 0,25% дрожжевого экстракта и 50 овечьей крови, при микроаэрофильных услови€х в течение 3 дней при 37oC.
ќпределение количества бактерий - количество бактерий определ€ли по оптической плотности раствора BHI при 660 нм /1 единица оптической плотности соответствует 108 бактерий/.
c) ѕриготовление гомогентов разрушенных ультразвуком клеток
H.pylori собирали из 31 чашки, содержащих агарозу с кровью в 0,15 ћ NaCl и откручивали 5 мин при 1400 g при 4oC. ќстаток ресуспендировали в 3 мл NaCl и обрабатывали звуком /"озвучивали в течение 4 мин.  оличество белка определ€ли по Ѕредфорду /BioRadKit в соответствии с поставщиком/.
d) —оединение иммуногена с гидроксиапатитом
»ммуноген /уреазу или ее субъединицу/ инкубировали в течение часа при 4oC с гидроксиапатитом. 1,0 г гидроксиапатита примен€ли дл€ 30 мкг иммуногена на мышь. ¬ конце инкубировани€ добавл€ли 10 мкг холерного токсина в конечном объеме 200 мкл PBS.
ѕример 1.
a) Ёкстракци€
H. pylori из 30 чашек с кровью и агаром собирали в 0,15 ћ NaCl на льду. –аствор откручивали 5 мин при 1400 g при 4oC. ќсадок ресуспендировали в 20 мл H2O и откручивали 45 с при максимальной скорости. «атем экстракт откручивали 20 мин при 6700 g при 4oC. —упернатант извлекали и оценивали количества белка /см. выше/, после чего осаждали 70%-ным сульфатом аммони€.
b) ќчистка уреазы
–аствор хроматографировали на колонке Sepharose CL-6B /Pharmacia/ с PBS /физиологический раствор с фосфатным буфером/ в качестве подвижной фазы. 22 собранные фракции, которые обнаружили активную уреазную активность, соедин€ли вместе и диализировали в течение ночи при 4oC против 3 л PEB (20 нћ фосфатный буфер, pH 7) и затем хроматографировали на Q Sepharose fast flow /Pharmacia/ с PEB в качестве подвижной фазы. ‘ракции элюировали при помощи градиента 0 - 500 нћ NaCl. 10 собранных фракций с сильной уреазной активностью отдельно наносили на гель с DC-Na с последующим окрашиванием  умасси. 6 фракций обнаружили 2 отдельные полосы, соответствующие мол.массам 63 и 28  ƒа. Ёти фракции соедин€ли и рассматривали как очищенную уреазу.
ѕример 2 /см. также раздел B/.
ћышей, примен€емых в исследовании иммунизации, подвергали легкой анестезии эфиром перед внутрижелудочной иммунизацией. «атем озвученный препарат или очищенную уреазу, гидроксиапатит и холерный токсин суспендировали в PBS и 200 мкл доставл€ли в желудок соответствующих мышей при помощи полиэтиленовой трубки, соединенной со шприцем дл€ подкожных инъекций. Ётот способ назван пероральной иммунизацией.
ќценивались протоколы трех пероральных иммунизаций. ќни описаны ниже.
ѕротокол B1 - ¬акцинаци€ очищенной уреазой
—амок BALB/c шестинедельных мышей /20/ перорально иммунизировали 30 мкг очищенной уреазы H.pylori и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0, 7-ой, 14-ый и 21-ый дни. 10 мышей инфицировали на 28-ой и 30-ый дни 5·107 и 108 H.felis из жидкой культуры.
ѕротокол B2 - ¬акцинаци€ озвученными гомогенатами He
—амок BALB/c шестинедельных мышей /20/ перорально иммунизировали 2 мг раствора после обработки ультразвуком клеток H.pylori на 0, 7-ой, 14-ый и 21-ый дни. 10 мышей инфицировали на 28-ой и 30-ый дни 5·107 и 108 H.felis.
ѕротокол B3 -  онтроль
—амок BALB/c шестинедельных мышей /20/ перорально иммунизировали 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0, 7-ой, 14-ый и 21-ый дни. ћышей инфицировали на 28-ой и 30-ый дни 5·107 и 108 H.felis.
Ќа 35-ый день мышей убивали и были вз€ты биопсии из желудка, а также кишечные секреции и кровь.
«ащита и оценка
ƒл€ оценки защиты биопсии скринировали на уреазную активность при помощи теста Tetrox HP /Rohm Pharma/ в соответствии с инструкци€ми поставщика. ”реазу определ€ли количественно путем спектрофотометрического измерени€ при 550 нм. «атем биопсии культивировали в присутствии H.felis и оценивали по √рам-окрашиванию. Ѕиопсии полости желудка гомогенизировали и разбавл€ли /1: 100 и 1:1000/ в 0,15 ћ NaCl и высевали в чашки с кровью и агаром и инкубировали при микроаэрофильных услови€х при 37oC в течение 4 - 10 дней.
ELISA /твердофазный иммуноферментный анализ/
 ишечные секреции и кровь анализировали при помощи ELISA дл€ оценки титра антител. јнализ проводили следующим образом. ѕланшеты из полистирола /96 €чеек/ покрывали 1 мкг/€чейку очищенной уреазой при 37oC в течение 2 ч. —айты неспецифического св€зывани€ блокировали 5%-ным порошкообразным молоком в PBS - 0,1% Tween при 37oC в течение 30 мин. ѕланшеты промывали один раз PBS - 0,1% Tween. ѕробы крови тестировали при разведении 1:100, а кишечные секреции при разведении 1:1. 100 мкл каждой пробы добавл€ли к покрытым антигеном планшетам. ѕосле 2 ч инкубации планшеты промывали 3 раза PBS - 0,1% Tween. јнтимышиные биотинилированные целые антитела из козы и антимышиные биотинилированные IgA, IgG и IgM /Amersham/ добавл€ли /100 мкл/ при разбавлении 1: 500 за исключением IgA /1:250/ и инкубировали при 37oC в течение 1 ч. ѕланшеты промывали 3 раза PBS - 0,1% Tween, добавл€ли 100 мкл разведени€ 1:1000 стрептавидин-пероксидазы хрена в PBS - 0,1% Tween и инкубировали при 37oC в течение 30 мин. ѕланшеты промывали 3 раза, добавл€ли 50 мкл разведени€ 1:50 о-фенилдиамина в цитратном буфере pH 5,0 с 1 мкл/мл 30%-ной H2O2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. ¬ каждой €чейке определ€ли поглощение при 495 нм.
ѕример 3 /см. также раздел C/.
ћышей, примен€емых в исследовани€х по иммунизации, подвергали легкой анестезии эфиром перед внутрижелудочной иммунизацией. «атем 30 мкг субъединиц A и B рекомбинантной уреазы H.pylori, продуцировали в E.coli, св€занной с гидроксиапатитом и дополненной холерным токсином, суспендировали в PBS и 200 мкл доставл€ли в желудок соответствующих мышей при помощи полиэтиленовой трубки, соединенной со шприцем дл€ подкожных инъекций. Ёту процедуру называют пероральной иммунизацией.
ќценивали протоколы трех пероральных иммунизаций. ѕротоколы описаны ниже.
ѕротокол C1 - ¬акцинаци€ субъединицей A рекомбинантной уреазы
—амок BALB/c шестинедельных мышей /10/ перорально иммунизировали 30 мкг очищенной субъединицы A рекомбинантной уреазы H.pylori и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый дни. 10 мышей инфицировали на 32-ой, 34-ый и 36-ой дни 108 H.felis из жидкой культуры.
ѕротокол C2 - ¬акцинаци€ субъединицей B рекомбинантной уреазы
—амок BALB/c шестинедельных мышей /10/ перорально иммунизировали 30 мкг очищенной субъединицы B рекомбинантной уреазы H.pylori и 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый дни. ћышей инфицировали на 32-ой, 34-ый и 36-ой дни 108 H.felis из жидкой культуры.
ѕротокол C3 -  онтроль
—амок BALB/c шестинедельных мышей /10/ перорально иммунизировали 1 мг гидроксиапатита и 10 мкг холерного токсина на 0, 8-ой, 14-ый и 21-ый дни. ћышей инфицировали на 32-ой, 34-ый и 36-ой дни 108 H.felis.
Ќа 42-ой 106-ой день мышей убивали и брали множество биопсий их желудка.
«ащита и оценка
ƒл€ оценки защиты биопсии корпуса и полости желудка скринировали на уреазную активность при помощи теста Tatrox HB /Rohm Pharma/ в соответствии с инструкци€ми поставщика. ”реазу определ€ли количественно путем спектрофотометрического измерени€ при 55% нм. “отальные величины OD корпуса и полости желудка складывали дл€ получени€ конечной величины OD дл€ каждой мыши.
Ћитература
1. Blaser, M.J. "Gastric Campylobacter-like organisms, gastritis and peptic ulcer disease" Gastroenterology. 1987, 93, 371-383.
2. Graham, D.Y. "Campylobacter pylori and peptic ulcer disease" Gastroenterology. 1989, 196, 615-625.
3. Parsonnet, J. et al "Helicobacter pylori infection in intestinal and diffuse-type gastric adenocarcinomas" J.Natl. Cancer Inst. 1991, 93, 640-643.
4. Marshall, B.J. et al "Attempt to fulfill Koch's postulate for pyloric Campylobacter" Med. J. Aust. 1985, 142, 436-439.
5. Morris, A. et al "Ingestion of Campylobacter pyloridis causes gastritis and fasting gastric pH" Am. J. Gastroenterology, 1987, 82, 192-199.
6. Engstrand, L. et al "Inoculation of barrier-born pigs with Helicobacter pylori: a useful animal model for gastritis type B" Infect. Immun. 1990, 53, 1763-1768.
7. Fox, J.G. et al "Gastric colonization by campylobacter pylori subsp. mustelae in ferrets" Infect. Immun. 1988, 56, 2994-2996.
8. Fox, J.G. et al "Helicobacter mustelae-associated gastritis in ferrets: an animal model of Helicobacter pylori gastritis in humans" Gastroenterology 1990, 99, 352-361.
9. Lee, A, et al "A small animal model of human Helicobacter pylori active chronic gastritis" Gastroeneteroloy 1990, 99, 1315-1323.
10. Fox, J.G. et al "Helicobacter Felis gastritis in gnotobiotic rats: an animal model of Helicobacter pylori gastritis" Infect. Immun 1991, 59, 785-791.
11. Eaton, K.A. et al "Campylobacter pylori virulence factors in gnotobiotic piglets" Infect. Immun. 1989, 57, 1119-1125.
12. Peterson, W. L. "Helicobacter pylori and peptic ulcer disease" N. Engl. J. Med. 1991, 324, 1043-1048.
13. Czinn, S.J. and Nedrud, J.G. "Oral Immunization against Helicobacter pylori" Infect. Immun. 1991, 2359-2363.
14. Brandtzaeg, P. "Role of H chain and secretory component in receptor-mediated glandular and hepatic transport of immunoglobulins in man" Scand. J. Immunol. 1985, 22, 111-146.
15. Brandtzaeg. P. "Production and secreion of immunoglobulins in the gastrointestinal tract" Ann. Allergy 1987, 59, 21-39.
16. Wyatt, J. I. "Local immune response to gastritic campylobacter in non-ulcer dyspepsin" J. Clin. Path. 1986, 39, 863-870.
17. Lee, A. et al "Pathogenicity of Helicobacter pylori: A perspective" Infect. Immun. 1993, 61, 1601-1610.
18. Pallen, M. J. and Clayton, C.L. "Vaccination against Helicobacter pylori urease, letter" Lancet, 1990, 336, 186.
19. Evans, D.J. et al "Urease-associated heat shock protein of Helicobacter pylori Infect. Immun. 1992, 60, 2125-2127.
20. Ferrero, R.L. and Lee, A "The importance of urease in acid protection for the gastric-colonizing bacteria Helicobacter pylori and Helicobacter felis sp. nov." Microb. Ecol. Health Dis. 1991, 4, 121-134.
21. Chem, et al "Immunization against gastric Helicobacter infection in a mouse/Helicobacter felis model, letter" Lancet, 1992, 339, 1120-1121.
22. Czinn, S. et al "Oral immunization protects germ-free mice against infection from Helicobacterl felis". Proceedings of the DDW, American Gastroenterological Assocoation. May 10-13, 1992, 1321, A-331.
23. Guo, M. and Liu, P.V. "Serological specificities of ureases of Proteus species" J. Gen. Microbiol. 1965, 136, 1995-2000.
24. Michetti, P. et al "Specificity of mucosal IgAa response in Balb/c mice following H. felis or H. pylori challenges" Proceedings of the DDW, American Gastroenterology Association. May 10-13, 1992, 1001, A-251.
25. Davin, C. et al "H. pylori urease elicits protection against H. felis infection in mice" Proceedings of the DDW, American Gastroenterology Association, May 16-19, 1993, 1213, A-304.
26. Pallen, M. J. and Clayton, C.L. "Vaccination against Helicobacter pylori urease". Lancet 1990, 336, 186-7.
27. Pimentel, J. L. and Cook, M.E. "Improved growth in the progeny of hens immunized with jackbean urease" Poultry Sci. 1988, 64, 434-439.
28. Labigne, A. "Sequences of nucleotides coding for a protein having an urease activity". EPO patent application #EPO 0 367 644 A1, 1989 Intl publication # WO90/04030, 1990.
29. Clayton, C.L. et al. "Nucleotide sequence of two genes from Helicobacter pylori encoding for urease subunits". Nucleic Acid Res. 1990, 18, 362.
30. McGhee, J.R. and Kyono, H. "New perspectives in vaccine development: mucosal immunity to infections". Infect Agents Dis. 1993, 2, 55-73.9
‘ормула изобретени€: 1. —пособ индуцировани€ у млекопитающих защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter, включающий введение антигена, отличающийс€ тем, что в качестве антигена ввод€т иммуногенно эффективное количество полиаминокислотного препарата, представл€ющего достаточное количество эпитопов, про€вл€емых уреазой, эндогенной дл€ организма Helicobacter, причем введение указанного препарата осуществл€ют к поверхности слизистой оболочки млекопитающих.
2. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит интактную уреазу, очищенную из организма.
3. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит пептиды, гомологичные с ферментивно неактивными част€ми аминокислотных последовательностей уреазы.
4. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит пептиды, негомологичные с аминокислотными последовательност€ми уреазы и обнаруживающие эпитопы, перекрестно реагирующие с уреазой.
5. —пособ по п. 1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит уреазу H.pylori.
6. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит по меньшей мере, субъединицы уреазы с ферментативной активностью или без ферментативной активности.
7. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит антиидиотипические антитела к уреазе.
8. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит пептиды, иммунологически перекрестно реагирующие с уреазой.
9. —пособ по пп.3 и 8, отличающийс€ тем, что указанные пептиды получены при помощи химического синтеза.
10. —пособ по п. 1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит антигены уреазы, полученные техникой рекомбинантных ƒЌ .
11. —пособ по п. 1, отличающийс€ тем, что указанный препарат содержит субгенные фрагменты уреазы, полученные техникой рекомбинантных ƒЌ .
12. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанные препараты содержат субгенные фрагменты уреазы, полученные в виде слитых белков.
13. —пособ по п.12, отличающийс€ тем, что указанные слитые белки содержат субъединицы холерного токсина.
14. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат ввод€т в сочетании с адьювантом дл€ слизистой оболочки.
15. —пособ по п.14, отличающийс€ тем, что указанный адьювант дл€ слизистой оболочки представл€ет собой холерный токсин.
16. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанным млекопитающим €вл€етс€ человек.
17. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанный препарат ввод€т в соединении с гидросилированным фосфатом кальци€.
18. —пособ по п.17, отличающийс€ тем, что указанный гидросилированный фосфат кальци€ представл€ет собой гидроксиапатит.
19. —пособ по п.18, отличающийс€ тем, что указанный гидроксиапатит присутствует в виде частиц, пригодных дл€ транспорта через эпителий.
20. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что указанную уреазу ввод€т перорально, назально, ректально или чрезглазно.
21. ¬акцина дл€ индуцировани€ защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter у млекопитающих, содержаща€ антиген и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающийс€ тем, что в качестве антигена содержит полиаминокислотный препарат, представл€ющий эпитопы, про€вл€емые уреазой, эндогенной дл€ организма.
22. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит адьювант дл€ слизистой оболочки.
23. —пособ индуцировани€ пассивной защиты у млекопитающих против инфекции Helicobacter, включающий введение антител, отличающийс€ тем, что ввод€т иммунологически активное количество специфических дл€ уреазы Ig A антител, причем введение осуществл€ют к поверхности слизистой оболочки млекопитающих.
24. —пособ по п.23, отличающийс€ тем, что указанные антитела представл€ют собой Ig A антитела, специфические дл€ уреазы Helicobacter pylori.
25. —пособ по п.24, отличающийс€ тем, что указанное млекопитающее €вл€етс€ человеком.
26. —пособ оценки эндогенного иммунного ответа млекопитающих, инфицированных Helicobacter, включающий введение антигена и отбор пробы, отличающийс€ тем, что отбор пробы осуществл€ют из желудочно-кишечного тракта млекопитающих, а оценку эндогенного иммунного ответа осуществл€ют путем определени€ в пробе присутстви€ антител, реагирующих с эпитопами, про€вл€емыми уреазой, эндогенной дл€ Helicobacter.
27. —пособ по п.26, отличающийс€ тем, что включает дополнительную стадию введени€ вакцины Helicobacter млекопитающему перед введением Helicobacter.
ѕриоритет по пунктам:
03.11.92 по пп.1 - 3, 5, 6, 8, 10 - 27;
06.07.93 по пп.4, 7, 9.