Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТНОЙ ZEA MAYS - Патент РФ 2128426
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТНОЙ ZEA MAYS
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТНОЙ ZEA MAYS

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТНОЙ ZEA MAYS

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Химический мутагенец пыльцы с последующей селекцией и прорастанием ceмян в присутствии гербицида, например имазетапира, обеспечивает получение гербицидоустойчивых растений кукурузы. 3 з.п. ф-лы, 23 ил., 5 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2128426
Класс(ы) патента: A01H1/06, C12N15/01
Номер заявки: 5010372/13
Дата подачи заявки: 16.05.1990
Дата публикации: 10.04.1999
Заявитель(и): Зенека Лимитед (GB)
Автор(ы): Саймн Уильям Джонатан Брайт (GB); Минг Танг Чанг (CN); Ян Джеффри Ивэнс (GB); Мейри Джейн МакДональд (GB)
Патентообладатель(и): Зенека Лимитед (GB)
Описание изобретения: Изобретение относится к гербицидоустойчивым растениям кукурузы, ее семенам и потомству.
Цель получения растений культуры, которые невосприимчивы к действию гербицида, - облегчить уничтожение сорняков, растущих между растениями сплошным применением гербицидно-эффективной концентрации гербицида, который уничтожит растение культуры в его обычном, чувствительным к гербициду состоянии. Такие невосприимчивые растения полезны также в очаге при выносе элементов гербицида из предшествующего урожая в достаточно короткий срок.
Известны методы, при помощи которых можно получить популяции растений, содержащих большое число произвольных мутаций. Такие методы включают технику тканевых культур, где спонтанное сомаклональное изменение происходит в присутствии или отсутствии мутагена. Применением к культурам некоторой формы селекционного давления можно восстановить клетки, которые невосприимчивы к этому давлению. В зависимости от вида растений иногда можно регенерировать растения полностью из устойчивых клеток. Такие методы отбора тканевой культуры использовались в прошлом для выбора устойчивости к гербицидам.
Neuffer и Coc [maydica XXIII (1978) 21-28, стр. 21] описали процедуру мутагенеза пыльцы с использованием мутагенов, суспендированных в легком парафиновом масле с последующим опылением растения-реципиента мутагенированной пыльцой. При этом нет указания, что когда-либо делалась попытка локализировать и изолировать коммерчески важные мутанты, и, хотя говорилось, что полученные растения исследовались на мутанты, не указывались подробности в отношении свойств мутантов, которые могли бы быть получены, хотя бы визуальным осмотром.
В Plant Breeding Peviews 15, стр. 39-180, Bird и Neuffer пишут об использовании мутагенных процессов для получения вариации в кукурузе. Мутагенез пыльцы рассматривается на страницах 150 и 151. Мутагенез пальцы дает относительно высокую вариацию в M1 генерации по сравнению с другими известными процедурами. Однако не делается предположения в отношении использования мутагенеза пыльцы для генерации мутантов, которые показывают устойчивость к действию гербицидов. Раздел III (стр. 149) касается некоторых проблем использования мутагенеза как источника генетической вариации. Одним важным аспектом является способ, которым популяция предполагаемых мутантов экранируется для полезных фенотипов.
Цель настоящего изобретени - получить кукурузу, устойчивую к гербициду.
В соответствии с этим предлагается способ получения мутанта Zea mays, обладающего устойчивостью к обычно летальной концентрации выбранного гербицида, включающий подвержение изолированной пыльцы Zea mays действию химического мутагена, восстановление мутагенизированной пыльцы, опыление ею женского родителя, сбор семян зрелого растения, выращивание семян при давлении отбора выбранного гербицида или второго гербицида с таким же воздействием, как выбранный гербицид, восстановление потомства, невосприимчивого к применяемому давлению отбора.
Предпочтительным химическим путагеном является этилметансульфонат.
Предпочтительным гербицидом, используемым для применения давления отбора является ингибитор ацетолактат-синтазы, и более конкретно - имазетапир.
Давление отбора применяется использованием гербицида с семенами до прорастания.
Предпочтительно, чтобы концентрация гербицида, используемого для давления отбора, была недостаточной, чтобы замедлить всхожесть, но достаточной, чтобы замедлить рост восприимчивых к нему растений.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением, мы предлагаем гербицидоустойчивые кукурузные растения, семена, которые были депонированы в Национальный депозитарий National Collection of Industrial and marine Bacteria, Aberdeen, United Kingdom, официальные данные депонированных продуктов приведены в табл. 1.
Каждый из этих депозитов - генетическая смесь, изолирующая мутантные и немутантные семена. Мутанты являются гетерозиготными для гена, дающего устойчивость к гербициду. Из этих семян можно получить мутантные растения выращиванием при условиях, описанных ниже под заголовком "Экранирование" в присутствии гербицида имазетапир.
Изобретение также предусматривает семена растения и потомство, которые были получены скрещиванием растений этого изобретения с другими линиями кукурузы.
Известно, что растения этого изобретения устойчивы к некоторым членам имидазолинонового семейства гербицидов, например, имазетапир 5-этил-2-/5-изо-пропил-5-метил-4-оксо-2-имидазолин-2-ил/ никотиновой кислоте: /Товарный знак PURSUIT Американский цианамид). Была также выявлена устойчивость гибрида к гербицидам семейства сульфонилмочевины, хлорсульфурону, например, а также устойчивость к феноксипиримидинам и триазолопиримидинам. Растения могут быть также устойчивы к другим семействам гербицидов, что еще не проверялось.
Гербициды, которые проверялись на растениях до сих пор, те, механизмом которых является подавление фермента ацетолактат синтазы (АЛС), известного также как ацетогидроксикислотная синтаза (AHAS). На гербициды удобно ссылаться по товарным знакам, подо которыми они продаются. На фиг. 2 чертежей показаны химические структуры активных ингредиентов.
Подробная экспозиция молекулярной базы устойчивости к сульфонилмочевинным гербицидам дается в европейской патентной заявке 257993 (E.I. Du Pont de hemours and Col. Изоляция имидазолинон-устойчивой кукурузы из тканевой культуры представлена в патенте США 4761373 /Molecular Genetiсs Inc/. В литературе даются сведения об использовании различных видов растений и нескольких гербицидов в процессах тканевых культур для изоляции устойчивых мутантов.
В отличие от этого, настоящее изобретение не использует тканевую культуру. Устойчивость вводится мутагенезом пыльцы химическим мутагеном. Отбор осуществляется непосредственно на семенах после оплодотворения мутагенированной пыльцой, либо обработкой семян до всхожести или на стадии рассады, либо того и другого.
Некоторые преимущества дает использование мутагенеза пыльцы как способа создания мутантов по сравнению с более традиционным способом получения вариации, полагаясь на сомаклональную вариацию. Чтобы имела место сомаклональная вариация, необходимо создать культуру ткани растения. Это требование ограничивает выбор генотипа, который может использоваться, так как не всегда представляется возможным регенерировать полностью растения из культивируемой ткани. С другой стороны, мутагенированную пыльцу можно применить к любому генотипу реципиента кукурузы, включая коммерчески важные и хорошо разработанные элитные генеологические линии. Кроме того, снижается вероятность нежелательных мутаций, которые, как известно, может давать сомаклональная вариация.
В этом изобретении отбор идет на M1 генерации, с тем результатом, что отбираются только доминантные мутации. Кроме того, при проведении способа на целых растениях или на семенах до всхожести, или на том и другом, позволяют концентрации гербицида сымитировать полевые условия более близко, чем это возможно с применением давления отбора гербицида к тканевой культуре. В способе отбора тканевой культуры необходимо регенерировать целые растения из ткани и выращивать до зрелости, чтобы получить какое-либо указание действия потомства при концентрациях гербицида в полевых условиях. В нашем способе отбор делается непосредственно на растениях при концентрациях гербицида, которые сравнимы с концентрациями, рекомендуемыми для нормальной активности, убивающей сорняки в полевых условиях. Отбор на M2 генерации, как и со способом тканевой культуры, отбирает рецессивные мутации, а также доминантные признаки. Доминантность желаемого признака рассматривается как более полезная и более удобная в разработке селекционной программы, особенно гибридных культур.
Мы считаем, что мутанты, отобранные давлением гербицида, варьируются в соответствии с определенным членом семейства используемых гербицидов. Все наши мутанты отбирались под давлением имазетапира. Если бы использовался другой гербицид имидазолинона, был бы отобран другой спектр мутантов.
Совершенно неожиданно мы выявили, что мутанты, которые были изолированы способом изобретения, свободны от вредных мутаций. Это явилось неожиданностью и причина этого преимущества не совсем ясна. Мы полагаем, но не хотим связывать себя этим объяснением, что здесь играет роль степень контроля на этапе отбора, использование точно контролируемых концентраций в применении гербицида, например, хорошая общая и однородная степень доступности.
Далее подробно описывается способ изобретения, с помощью которого были получены гербицидоустойчивые растения по изобретению.
На чертежах к данной заявке представлены:
фиг. 1 - схема получения нескольких генераций потомства из растений по изобретению,
фиг. 2 - химические структуры гербицидов, используемых в этом изобретении.
фиг. 3 - график АЛС ферментной активности в присутствии имазетапира. Фермент экстрагируется из растений, гетерозиготных для устойчивого гена,
фиг. 4 - график активности АЛС фермента в присутствии имазапира. Фермент экстрагируется из растений, гетероизоготных для устойчивого гена,
фиг. 5 - график активности АЛС фермента в присутствии имазахина. Фермент экстрагируется из растений, гетероизоготных для устойчивого гена,
фиг. 6 - график активности АЛС фермента в присутствии хлорсульфорона. Фермент экстрагируется из растений, гетерозиготных для гена устойчивости,
фиг. 7 - график активности АЛС фермента в присутствии хлоримурона. Фермент экстрагируется из растений, гетерозиготных для гена устойчивости,
фиг. 8 - график активности АЛС фермента в присутствии тиакарбурона; фермент экстрагируется из растений, гетерозиготных для газов устойчивости,
фиг. 9 - график активности фермента действия АЛС, экстрагированного из листьев потомства мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для аллеля устойчивости и в присутствии имазетапира (PURSUIT);
фиг. 10 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для аллеля устойчивости и в присутствии имазахина (SCEPTER),
фиг. 11 - график активности АЛС, экстрагированной из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии имазапира (ARSENAL),
фиг. 12 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии хлорсульфурона (GLEAN),
фиг. 13 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии хлормурона (CLASSIC),
фиг. 14 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии тиакарбурона (HAPMONY).
фиг. 15 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии триазолопиримидина,
фиг. 16 - график активности фермента активности АЛС, экстрагированного из листьев мутантов 1 и 2, которые гомозиготны для устойчивого аллеля и в присутствии феноксипиримидина,
фиг. 17 - кривая реакция на дозу для гербицида имазетапир (PURSUIT),
фиг. 18 - кривая реакция на дозу для гербидица имазахин (SCEPTER),
фиг. 19 - кривая реакции на дозу для гербицида хлоримурон (CLASSBC),
фиг. 20 - кривая реакция на дозу для гербицида хлорсульфурон (GLEAN),
фиг. 21 - кривая реакции на дозу для гербицида триазолопиримидин,
фиг. 22 - кривая реакция на дозу для гербицида феноксипиримидин, и,
фиг. 23 - кривая реакция на дозу для гербицида имазетапир (PURSUIT) для мутантов 1 и 2 в гетерозиготной и гомозиготной формах.
1. Получение M1 семени
Был приготовлен основной раствор этилметансульфоната (ЭМС) с содержанием одного миллилитра ЭМС в 100 мл легкого парафинового масла. Основной раствор выдерживается в охлажденном состоянии.
Свежие пыльцевые зерна с пыльниками собирались с 20 метелок полевой кукурузы, инбредная линия UE95. Пыльцевые зерна отделялись от пыльников с использованием мешка Glassine/ (Товарный знак).
Около 3 мг пыльцы добавлялись к 45 мл ЭМС основного раствора в 60 мл-вой бутылке. Смесь пыльца /раствор ЭМС энергично встряхивалась в течение 30 с, затем встряхивалась четыре или пять раз каждые 3 мин в течение 40 мин, чтобы не дать осесть зернам пыльцы. Обработанные пыльцевые зерна наносились кисточкой на шелк лишенного метелок инбредного женского родителя (закодированного UE95).
Растения выращивались до зрелости и собирались семена М1.
2. Экранирование.
М1 семена были отобраны, 100 семян на тарелку, помещены в WCB растительную среду (низкоорганическое вещество, 45% глины, 55% гравия), и на них распылялся с использованием направленного распылителя и с оттоком - раствор имазетапира (PURSUIT) с концентрацией, рассчитанной эквиваленту 250 г/га активного ингредиента. Семена покрывались WCB в 0.5 дюйма и выращивались в теплице при 25oC.
Выбранная концентрация применения была такова, что всхожесть была близка к 100%, но в последующем влияние сказалось на всех восприимчивых растениях. Однако после 2 недель первоначальный эффект гербицида стал очевиден: тонкие листья и высота, составляющая только около 20% высоты контрольных растений. Спустя 3-4 недели почти все восприимчивые растения полностью погибли. Не подверженные распылению UE95 растения росли параллельно с каждым просевом в качестве контроля, поскольку уже было известно, что обычные и М1 саженцы UE95 почти неразличимы при всхожести и выращивании до зрелости без распыления.
3. Отбор и выращивание.
После экранирования было отобрано всего 10 растений (представляющих 0,01% от общего числа), демонстрирующих толерантность к обычно летальным дозам гербицида. Мутант N 4 оказался чувствительным фенотипом и был выведен из программы. Из остальных 9 большинство были морфологически схожими с необработанными контрольными растениями после отбора, но 4 были затронуты действием, были короче и демонстрировали другие гербицидные последствия. Образцы семян этих 9 растений с обратным скрещиванием с родителем UE95 (Мутанты 1-10, с исключая N 4) были депонированы в National Collection of Industrial and Marine Bacteria (см. табл. 1).
4. Изучение ПДФР.
Чтобы подтвердить, что родственные растения действительно были генотипа UE95 по происхождению, а не природно более устойчивыми нечистыми инбредами или гибридом, на ДНК, экстрагированной из ткани листьев всех 10 растений, был проведен фингерпринтный анализ, полиморфизм длины фрагмента рестрикции (ПДФР).
Приблизительно 1-5 г ткани листа удалялось с каждого растения (в возрасте от 4 недель до зрелого). ДНК экстрагировались и ПДФР анализ проводился с использованием диагностических проб одной копии.
Анализ ПДФР подтверждал, что выбранные растения представляют генотип UE95.
5. Исследование расщепления.
Устойчивые растения использовались во взаимных обратных скрещиваниях с гомозиготным гербицидовосприимчивым UE95. Частота устойчивого потомства в M1BC1 или M1BC2 генерациях была найдена обработкой имазетапиром и просчетом выживших культур. Результаты показаны в табл. 2, вместе с рассчитанной величиной X2 (для соотношения 1:1).
Как видно из цифр, указанных в табл. 2, соотношение чувствительных к устойчивым растениям в потомстве обратного скрещивания не отличается существенно от 1:1 до всех мутантов, за исключением номеров 3 и 7, причем устойчивость контролируется одним доминантным геном.
6. Генерация F1 семени из устойчивых растений.
Все 10 растений, идентифицированных на экране, использовались в реципрокном родственном скрещивании с UE95 растениями для получения семян (обозначенных M1BC1), т.е. устойчивые растения использовались как и мужской и женский доноры.
7. Повторное экранирование семени потомства.
Из каждой полученной колонии просевался небольшой образец семян на сопротивление имазетапиру (PURSUIT) с использованием тех же условий, которые описаны выше для первоначального экранирования.
Устойчивые и чувствительные фенотипы расщеплялись в потомстве каждого устойчивого растения.
8. Получение дальнейших генераций.
На фиг. 1 M1BC1 растения самоопылялись и давали генерацию M1BC11, которая вновь самоопылялась и давала M1BC1S2. Из этой генерации стало возможным идентифицировать по факту, что устойчивый признак не является расщепляющим, - линии, которые гомозиготны для признака. Эти гомозиготные линии, полученные от Мутанта N 1, можно использовать для получения F1 гибридов, которые обладают устойчивостью к имидазолиновым гербицидам, или для дальнейшей селекционной работы.
9. Анализы ферментов
Семена генерации M1BC1 M1BC2 9 мутантов до появления всходов подвергались распылению гербицидом имазетапир (PUBSUIT) (Товарный знак) с концентрацией 250 г/га и выращивались в камере роста (16-часовой день, 27oC, 8-часовая ночь, 17oC). Растения собирались после 11 дней.
4 грамма листового материала собирались из листьев выше первого листа на стволе и измельчались пестиком в ступке в 20 мл раствора, содержащего 40 мМ Трицина (Товарный знак), 10 мМ EDTA, 5 мМ соли пировиноградной кислоты, 80 мМ флавин аденин динуклеотида (ФАД), 1 мМ дитиотрейтола (ДТТ). pH 8, плюс 0,8 г Polyclar AT. Гомогенат пропускался через 4 слоя муслина и центрифугирования при 30000 г в течение 20 мин.
Верхний слой доводился до 65% насыщения сульфатом аммония, оставался для осаждения в течение 30 мин и затем центрифугировался при 30000 г в течение 20 мин. Гранула вновь суспендировалась в 2,5 мл 40 мМ трицина, 10 мМ EDTA, 5 мМ соли пировиноградной кислоты, 80 мМ ФАД, (об/об) глицерола, 1 мМ ДТТ, pH 8 и обессоливалась в 3,5 мл 40 мМ Трицина, 10 мМ EDTA, 25% глицероле, 1 мМ ДТТ, pH 8.
Для каждого анализа использовалось 100 мкл ферментного экстракта. Окончательные концентрации реагента были следующие: 120 мМ Трицина, 50 мМ соли пировиноградной кислоты, 10 мМ MgCl2, 66 мМ ФАД, 93 мМ тиамин пирофосфата (ТПФ), pH 8, в присутствии или отсутствии нужного гербицида объемом 750 мл. Инкубация проводилась при 37oC 30 мин. Реакция останавливались 250 мл 1,84 М серной кислоты, и декарбоксилирование ацетолактата проводилось при 37oC 75 мин, или при 60oC 30 минут. На заготовки для анализа до ферментного экстракта наносилась серная кислота. К образцам и заготовкам добавлялось 650 мл α- нафтола в 2,73 М NaOH/0,16% (об/об) креатине с последующей инкубацией при 37oC 30 мин. После центрифугирования оптическая плотность всплывающей жидкости была 540 пм.
Описанная процедура анализа проводилась на ферменте АЛС, экстрагированном из каждого из 9 мутантов для следующих гербицидов: имазетапир (PURSUIT), имазапир (ARSEhAL), имазахин (SCEPTER), хлорсульфурон (GLEAN), хлоримурон (CLASSIC), тиакарбурон (HARMONY).
Графики активности фермента даны на фиг. 3 - 8. Кроме того, гомозиготные линии мутантов 1 и 2, которые выбирались из генерации M1BC1S2, также испытывались по отношению к той же группе гербицидов и представителям тиазолопиримидинов и феноксипиримидинов. Результаты даны на фиг. 9-16. Химические структуры этих гербицидов показаны на фиг. 2 чертежей.
10. Оценка торможения
Из данных анализа фермента можно получить, как меру степени торможения, фактор ID50% для каждого мутанта и для каждого гербицида. Этот фактор указывает концентрацию гербицида, которая дает 50% торможение активности АЛС по сравнению с контролем дикорастущих. Это позволяет также получить степень возрастания устойчивости. Расчеты приведены в табл. 3.
Подобные расчеты были сделаны для гомозиготных мутантов 1 и 2, результаты приведены в табл. 4.
11. Испытание устойчивости скрещенных семян
Семенами, используемыми в этом экране, были популяции смешанных толерантных и чувствительных семян с разделением 1:1, полученных из каждого из гетерозиготных толерантных мутантов, скрещенных с гомозиготным чувствительным UE95. Все из толерантного потомства были гетерозиготными на толерантность. Испытывался каждый мутант из указанных выше, за исключением мутанта 4. Контрольными были семена самоопыляющегося UE95, которые опылялись в том же году как толерантные линии.
1 л компоста помещался на каждый поддон с семенами размером 19 · 11 · 5 см глубиной и уплотнялся. На поверхности компоста в каждом поддоне делались 2 бороздки 1 см глубиной и в каждую бороздку сажались 6 семян (всего 12 семян на поддон). На некоторые поддоны высаживалось 24 семени, в этом случае делались 3 бороздки по 8 семян в каждой.
В каждом тесте каждый поддон содержал либо семена одного мутанта, либо контроль UE95 для каждой примененной концентрации гербицида и для необработанного контроля.
Испытывались 5 различных видов гербицидов-ингибиторов АЛС на мутантах плюс в качестве сравнения имазетапир (PURSUIT). Применялись 4 дозы каждого, приблизительно 0,1х, 0,5х, 1х и 4х - полевые концентрации для каждого гербицида. Для мутантов 3-10 концентрации те же, но по отношению к мутантам 1 и 2 применялись более высокие концентрации хлоримурона (CLASSIC) и более низкие концентрации хлорсульфурона (GLEAN).
Использовались следующие гербициды со следующими полевыми концентрациями, г/га:
Хлоримурон (CLASSIC) - 8-13
Хлорсульфурон (GLEAN) - 4-26
Имазахин (SCEPTER) - 100-150
Триазолопиримидин - 10-30
Феноксипиримидин - 100-200
Имазетапир (PURSUIT) - 70-140
Концентрации применений, используемые в экранировании, были следующие:
хлоримурон (CLASSIC) 4, 20, 40, 160 г/га (мутанты 1 и 2), и 8, 40, 80, 320 г/га (мутанты 3-10),
хлорсульфурон (GLEAN) 5, 25, 50, 200 г/га (мутанты 1 и 2), и 1, 5, 10, 40 г/га (мутанты 3-10),
имазахин (SCEPTER) 30, 150, 300, 1200 г/га,
тиазолопиримидин 5, 25, 50, 200 г/га,
феноксипиримидин 10, 50, 100, 400 г/га, и
имазетапир (PURSUIT) 30, 150, 300, 1200 г/га.
Триазолопиримидин и феноксипиримидин применялись в виде стимулирующего смачивающего агента, известного как IF 5969 и разбавленного водой до окончательной концентрации 10% IF 5969. Остальные соединения разбавлялись только водой.
Распылительная струя и параметры были описаны под "Экранированием". После распыления семена покрывались 0,5 л компоста, почва уплотнялась (покрытие 2,5 см) и выращивались при условиях, описанных под "Экранированием" выше.
После 4 недель роста растения оценивались визуально. Каждое растение прикладывалось к шкале от 0 до 5 и высота измерялась от поверхности почвы до наивысшего кончика листа. Данные по шкале были следующими: 0 - 0 до 10% повреждения (отсутствие эффекта или небольшой гербицидный эффект); 1 - 11-25% повреждения; 2 - 26-50% повреждения; 3 - 51-85% повреждения; 4 - 81-95% повреждения; 5 - 96-100% повреждения (полная гибель растения).
При проведении этих оценок игнорировались растения с чувствительным фенотипом (приблизительно 50% растений).
Растения размером 0,1 или 2 регистрировались и высаживались в большие горшки и выращивались до зрелости. Результаты приводятся на фиг. 17-22. На фиг. 23 показаны сравнительные результаты, полученные между гетерозиготными и гомозиготными растениями.
12. Интерпретация результатов.
Данные, полученные для гетерозигот с помощью анализов фермента и кривых дозировок на живых растениях, не коррелируются точным образом. Для специалистов данной области это не будет неожиданным. Однако существует общая корреляция в том смысле, что общий уровень сопротивления, показанный в анализах фермента, имеет тенденцию к отражению в тепличных данных. Конечно, критерий в решении, что составляет полезный мутант, меняется в зависимости от гербицида или спектра гербицидов и дозировки в применении гербицида, и относительно большие расхождения в спектре устойчивости у скрещенных растений, которые демонстрируют мутанты этого изобретения, можно рассматривать как преимущество, а не как нежелательную вариацию, позволяющее выбор мутанта в обстоятельствах для предназначенного использования. Например, хотя определенный мутант может демонстрировать относительно низкую устойчивость по сравнению с другими против определенного гербицида, это может быть особенно полезным для получения растений, которые могут выносить только небольшие количества гербицида, например, быть устойчивыми к эффекту "выноса".
Имея это в виду, представляется возможным разделить на категории мутанты на основе анализов фермента и тепличных испытаний на "сильную", "среднюю", "слабую" и "нулевую" группы устойчивости для каждого гербицида. Эта классификация суммирована в табл. 5.
13. Селекция растений.
Мутированные линии настоящего изобретения можно использовать вместе с различными вторыми родительскими линиями для получения гербицидостойких гибридов.
Материал из гомозиготных линий можно вводить в селекционную программу с дальнейшим ауткроссингом, самоскрещиванием, визуальный селекцией и отбором гербицида для получения ряда новых гербицидотолерантных гибридных семян.
Гербицидоустойчивый признак можно перенести на новые линии с помощью обычной селекционной практики или описанного подхода селекции мутаций с использованием селекции устойчивости к гербициду. В этом способе специалисты могут использовать также технологию биохимического и молекулярного экранирования. Для изоляции и передачи устойчивого гена приемлемо использование техники геноинженерии.
Целью селекционной программы может быть просто перенос устойчивости к гербициду или более сложное текущее усовершенствование агрономической программы.
Формула изобретения: 1. Способ получения мутантной Zea mays, обладающей устойчивостью к обычно летальной концентрации выбранного гербицида, включающий стадии воздействия на изолированную пыльцу Zea mays химическим мутагеном, извлечения мутантной пыльцы, опыления ею женских растений и сбора семян из зрелых растений, отличающийся тем, что семена выращивают в условиях селективного давления выбранного гербицида или другого гербицида, обладающего таким же видом воздействия, как выбранный гербицид, и отбирают растения и их потомство, которые устойчивы к примененному давлению отбора и у которых концентрация гербицида, используемого для давления отбора, недостаточна для ингибирования прорастания, но достаточна для ингибирования роста чувствительных растений.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что химическим мутагеном является этилметансульфонат.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гербицидом, используемым для селективного давления, является ингибитор ацетолактат синтазы.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что гербицидом является имазетапир.