√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬ ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»» (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ  ”Ћ№“»¬»–”≈ћџ’ ∆»¬ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ  ¬Ќ  - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј, ‘ј–ћј÷≈¬“»„≈— јя  ќћѕќ«»÷»я
ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬ ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»» (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ  ”Ћ№“»¬»–”≈ћџ’ ∆»¬ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ  ¬Ќ  - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј, ‘ј–ћј÷≈¬“»„≈— јя  ќћѕќ«»÷»я

ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬ ћЋ≈ ќѕ»“јёў»’, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, »Ќ√»Ѕ»–”ёў»… ¬џ«џ¬ј≈ћ”ё  ќЋЋј√≈Ќќћ ј√–≈√ј÷»ё “–ќћЅќ÷»“ќ¬, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќџ… ѕ–ќ“≈»Ќ, ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»» (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ  ”Ћ№“»¬»–”≈ћџ’ ∆»¬ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ  ¬Ќ  - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ѕ–ќ“≈»Ќј, ‘ј–ћј÷≈¬“»„≈— јя  ќћѕќ«»÷»я

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии, генной инженерии. ¬ыделен природный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих из слюны Friatoma и установлена его N-концева€ аминокислотна€ последовательность. ѕолучен рекомбинантным путем протеин с активностью, аналогичной природному протеину. ”становлена его аминокислотна€ последовательность. “акже определена нуклеотидна€ последовательность фрагмента ƒЌ , кодирующего рекомбинантный протеин. —конструированы векторы экспрессии рћ–SV /—MV - ингитор - I (DSM 7223) и рћ–SV/—ћV - ингибитор-II, содержащие фрагменты ƒЌ , кодирующие рекомбинантный протеин. —пособ получени€ рекомбинантного протеина осуществл€ют культивированием штаммов культивируемых животных клеток ¬Ќ , трансформированных упом€нутыми векторами экспрессии, способными продуцировать рекомбинантный протеин. ƒалее провод€т его выделение и очистку гель-фильтрацией на "Superose 12" и в системе электрофорез - хроматографи€. ‘армацевтическа€ композици€, ингибирующа€ индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов содержит природный или рекомбинантный протеин в качестве активного вещества в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. ѕротеины могут быть использованы в качестве лекарства дл€ ингибировани€ вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека или лечени€ раковых болезней с метастатическими опухолевыми клетками. 9 с. и 6 з.п.ф-лы, 29 ил., 3 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2128705
 ласс(ы) патента: C12N15/12, C12P21/02, C07K14/81, A61K38/10, C12N5/10, A61K38/16, A61K38/17
Ќомер за€вки: 94045930/13
ƒата подачи за€вки: 04.09.1992
ƒата публикации: 10.04.1999
«а€витель(и): Ўеринг ј√ (DE)
јвтор(ы):  ристиане Ќеске-ёнгблут (DE); Ѕернхард ’эндлер (FR); …ерн  рэтцшмар (DE); ¬ольф-ƒитер Ўлойнинг (DE); јлехандро јлагон (MX); Ћуриваль ƒомингос ѕоссани (MX); ƒелиа јнатолиа  евас-јгирре (MX)
ѕатентообладатель(и): Ўеринг ј√ (DE)
ќписание изобретени€:  оллаген представл€ет собой наиболее эффективный из известных индукторов агрегации тромбоцитов человека. “ак, например, после повреждени€ стенок сосудов и экспонировани€ их коллагену тромбоциты быстро прилипают к этому месту и активируютс€ /Baumgaptner/ 1977/, Thromb, Haemostas. 37, 1 - 16, Hauriger /1987/ Human Pathol. 18.111-122/.
“аким образом, вызываема€ коллагеном агрегаци€ тромбоцитов у человека представл€ет фактор риска дл€ пациентов, подвергающихс€ процедурам, вли€ющим на кровеносные сосуды, например, пластическим операци€м на сосудах или сепсису, дл€ пациентов с инфарктом миокарда и дл€ выздоравливающих после инфаркта миокарда, и др.
»нгибиторы вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов включают синтетические олигопептиды, соответствующие коллагеновой последовательности, протеины змеиного €да и халин, протеин медицинских пи€вок. —интетические олигопептиды, ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов за счет того, что св€зывают тромбоциты. »х недостатком €вл€етс€ то, что они оказывают вли€ние на агрегацию тромбоцитов только в относительно высоких дозах /около 70 мкг пептида/ мл обеспечивают 65% ингибировани€/. —м. Bevers et al. /1985/ "ѕолученный из октапептида коллаген ингибирует прокаагул€нтную активность тромбоцитов, вызванную совместным действием коллагена и тромбина "Thrombosis Research, 37, 365 - 370, Karniguian et al. - 1983/ "¬ли€ние полученного из октапептида коллагена на различные стадии взаимодействи€ тромбоцит/коллаген", Thrombosis Research, 32: 593-604 и Caen et al. /1981/ "ќлигопептиды со специфическими ингибирующими свойствами вызываемых коллагеном агрегаций, способ их получени€ и содержащие их фармацевтические композиции" EPA 0040149. »нгибиторный механизм протеина змеиного €да до сих пор не известен. —м. Smith et al. "»дентификаци€ 50 кƒ протеинов змеиного €да, которые специфически ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагену". Thrombosis and Haemostasis /1991, 65, 678/ труды XIII  онгресса ћеждународного общества по проблемам тромбозов и гемостаза, июнь 30 - июль 6, 1991, јмстердам/. ’алин реагирует с коллагеном, но не реагирует с тромбоцитами. “аким образом, он не специфичен дл€ взаимодействи€ тромбоцит-коллаген, но он взаимодействует с коллагеном также и в отсутствии тромбоцитов. —м. Munro et al /1991/ "’аллин - ингибитор адгезии тромбоцитов, полученный из слюны медицинских пи€вок", Blood Coagulation and Tebrinolysis 2, 179 - 184.
¬ опубликованной ≈вропейской патентной за€вке EP 0480651 "ћегск and Co., Inc. , опубликованной 15 апрел€ 1992/, раскрыт протеин с молекул€рным весом около 16 кƒ и его способность ингибировать вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека, причем протеин этот получен из слюнных желез пи€вок Haemaenteria officinalis.
Ќеобходимы другие ингибиторы такой агрегации, обладающие другими или усовершенствованными характеристиками.
¬ насто€щем изобретении предложен природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, и который выдел€ют, или который можно выделить из слюнных желез насекомых, сосущих кровь у млекопитающих.
Ѕолее предпочтительны тромбоциты приматов, и наиболее предпочтительны тромбоциты человека. „увствительны также и тромбоциты других видов, например, лошадей, овец, рогатого скота, свиней, собак и кошек.
—интетические протеины можно получить по способам J.M. Steward and J.D. Young, 1984 /, “вердофазный синтез пептидов Piеrce Chem. Company, Fockford III и Methoden der Organischen Chemie /Houben/ Weyl/. vol. 15, N 1 и 2, E. Wunsch /ed./, Thieme Verlag Stuttgart 1974.
ѕредпочтительны протеины насто€щего изобретени€, которые выдел€ют из слюны подсемейства /пат. Faminia /Tratomae и, наиболее предпочтительно, Triatoma pallidipennis.
Ќасто€щее изобретение включает природный выделенный, синтетически полученный или рекомбинантный протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и который имеет следующую ѕ-терминальную аминокислотную последовательность:

¬ другом варианте изобретени€ представлен протеин, который ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, и причем протеин этот имеет следующую аминокислотную последовательность: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательность Id N 1; bb/ последовательность Id N 2 или cc/ последовательность Id N 3, или b/ аллельные модификации или мутации последовательностей в любой из последовательностей Id N 1 - 3, причем эти модификации или мутации не оказывают существенного вли€ни€ на активность протеина, или c/ протеин по любой из последовательностей Id N 1 - 3 или их модификаци€м или мутаци€м, указанным в пункте b/, содержащий посттрансл€ционные модификации, которые не оказывают существенного вли€ни€ на активность зрелого протеина.
Ќаиболее предпочтительным из указанных протеинов €вл€етс€ рекомбинантный протеин.
Ќасто€щее изобретение включает протеин, который не гликозилирован.
—ледующим вариантом изобретени€ €вл€ютс€ кƒЌ  или ƒЌ  a/ кодирующие протеин, со следующей аминокислотной последовательностью: a/ последовательность, представленную в aa/ последовательности Id N 1, bb/ последовательности Id N 2 или cc/ последовательности Id N 3, или b/ кодирующие протеин, который имеет последовательность аминокислот, согласно любой из последовательностей N 1 - 3, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, котора€ не оказывает существенного вли€ни€ на активность зрелого протеина, кодируемого соответствующей кƒЌ  или ƒЌ  последовательностью.
ѕротеин насто€щего изобретени€ включает зрелый протеин и протеин, который содержит сигнальную последовательность, предшествующую N-терминальной последовательности зрелого протеина. —игнальные последовательности представлены на фиг. 13a и 13b, и им соответствует отрицательна€ нумераци€. ќна начинаетс€ с ћет. Lys. Val.IIe.IIe и оканчиваетс€ His. Ala, Phe. Ala. Ёта сигнальна€ последовательность отвечает за проникновение через мембрану после биосинтеза протеина. —екретируемый протеин представл€ет собой зрелый протеин, начинающийс€ с Glu.Cys.Glu.Leu... Ёта сигнальна€ последовательность отщепл€етс€ до секретировани€.
Ќасто€щее изобретение, предпочтительно, содержит кƒЌ  или ƒЌ  со следующей нуклеотидной последовательностью:
a/ нуклеотидна€ последовательность, представленна€ в
aa/ последовательность I d N 4, bb/ последовательность I d N 5, или cc/ последовательность I d N 6, или b/ последовательность нуклеотидов по любой из последовательностей N 4 - 6, с, по крайней мере, одной аллельной модификацией или мутацией, которые существенно не вли€ют на активность зрелого протеина, который кодируетс€ соответствующей нуклеотидной последовательностью.
—ледующую часть изобретени€ составл€ет вектор, содержащий кƒЌ  или ƒЌ , указанные ранее, который, кроме того, содержит подход€щий сигнальный пептид, подход€щий промотор и, при необходимости, подход€щий энхансер. ¬екторы подробно описаны в примерах, а также в ≈вропейской патентной за€вке EP 0480651; 0463632 и 0173177.
—ледующий вариант изобретени€ составл€ет клетки эукариотных или прокариотных хоз€ев, трансформированные указанным ранее вектором.
Ќаиболее предпочтительными клетками-хоз€евами €вл€ютс€ клетки почек детенышей хом€ков. “ак как законные требовани€ делают депонирование таких клеток невозможным, плазмидную экспрессирующую конструкцию, содержащую ƒЌ  последовательность Id N 1 депонировали 2 сент€бр€ 1992 г при регистрационным номерам DSM...
ƒополнительно насто€щее изобретение включает способ получени€ протеина, отличающийс€ тем, что включает культивирование клетки хоз€ина, трансформированной вектором, содержащим ген, кодирующий протеин, и выделение и очистку протеина.  онкретные варианты описаны в примерах изобретени€, а общие способы можно вы€снить из указанных в описании работ и особенно из примеров изобретени€.
ѕромышленным применением протеинов насто€щего изобретени€ €вл€етс€ использование этих протеинов в фармацевтических композици€х, содержащих протеин насто€щего изобретени€ вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. ѕодробности можно найти в разделе ѕрименение описани€.
јллельные модификации, указанные ранее, включают изменени€ в последовательности нуклеотидов или аминокислот, изменени€ в генотипе или фенотипе. ѕо крайней мере, один нуклеотид или аминокислота могут быть замещены, исключены или вставлены.
Ѕольшинство делеций, вставок и замещенний не должны приводить к радикальным изменени€м характеристик протеина насто€щего изобретени€. “ак как трудно предсказать точное действие замещений, делеций или вставок заранее, сравнение функций зрелого протеина с характеристическими функци€ми протеина насто€щего изобретени€ может про€снить, имеет ли измененный протеин сравнимую активность.
√енетический код €вл€етс€ вырожденным; то есть большинство аминокислот кодируетс€ более чем одним кодоном из трех нуклеотидов. —оответственно, аллельные варианты в нуклеотидной последовательности могут измен€ть или не измен€ть аминокислотную последовательность. ѕоэтому аллельные вариации происход€т первоначально на уровне ƒЌ  и могут также существовать как вторичные на уровне аминокислотной последовательности.
ƒЌ  последовательность, кодирующа€ протеин насто€щего изобретени€, может быть модифицирована обычными способами дл€ получени€ вариаций в конечном протеине изобретени€, который сохран€ет практически ту же активность, что и протеин изобретени€. јктивность определ€ют по способу примера 1. “аким образом, одну или более из аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.. . вплоть до 15 аминокислот, можно добавить, заменить или удалить, практически не вли€€ на активность протеина насто€щего изобретени€. «амещени€ обычно провод€т в соответствии с таблицей 1, если нужно слегка изменить аминокислотную последовательность протеина насто€щего изобретени€.
—ущественные изменени€ в функци€х или иммунологической идентичности можно осуществить, выбира€ замещени€, которые менее консервативны, нежели приведенные в таблице 1, то есть, выбира€ остатки, которые значительнее отличаютс€ по своему действию на /a/ структуру полипептидной основной цепи в области таких изменений, как, например, плоска€ или спиральна€ конформа или гидрофобность молекулы, или /c/ объем боковых цепей.
“аблица 1.
ќбычные замены аминокислот в протеине
»сходные остатки - ѕримеры замен
Ala - Gly, Ser
Arg - Lys
Asn - Gln, His
Asp - Glu
Cys - Ser
Gln - Asn
Glu - Asp
Gly - Ala, Pro
His - Asn, Gln
lle - Leu, Val
Leu - lle, Val
Lys - Arg, Gln, Glu
Met - Leu, Tyr, lle
Phe - Met, Leu, Tyr
Ser - Thr
Thr - Ser
Trp - Tyr
Tyr - Trp, Phe
Val - lle, Leu
ћутации определ€ют по гомологии между двум€ сравниваемыми протеинами. Ёкспрессионна€ гомологи€ включает сходство аминокислот и разрывов в последовательност€х дл€ обоих сравниваемых последовательностей. —ходство аминокислот определ€ют, например, по таблице 1.
ѕредпочтительно, чтобы протеин имел аминокислотную последовательность с гомологией, по крайней мере, на 60%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, на 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере на 95% гомологии одной из последовательностей Id N 1-3.
 ак указано ранее, насто€щее изобретение включает варианты ƒЌ . Ёти последовательности гибридизуютс€ в жестких услови€х с ƒЌ  последовательностью, определенной в одной из последовательностей Id 4 - 6. ѕоследовательно, чтобы кƒЌ  и ƒЌ  имели нуклеотидную последовательность с гомологией, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% соответствующей последовательности, представленной в одной из последовательностей Id N 4 - 6. √омологию можно определить с помощью гибридизации, как указано у R.Knippers, Moleculare Genetic. 1982, 3ed., Georg Thееme Verlag Stuttgart, New York.
ѕод "пост-трансл€ционными вариантами", упом€нутыми ранее, подразумевают вариации во врем€ или после трансл€ции, такие как гликозилирование, образование дисульфидных мостиков и химические модификации аминокислот.
√ликозилирование €вл€етс€ одной из основных биосинтетических функций эндоплазматического ретикулума и/или комплекса √ольджи. ѕоследовательность и разветвление олигосахаридов, которые образуютс€ в ретикулуме, могут быть изменены в комплексе √ольджи, лизосомах или плазматической мембране. ќлигосахариды могут быть N-св€занными олигосахаридами /аспарагиновые св€зи/ или O-св€занными олигосахаридами /сериновые, треониновые или гидроксилизиновые св€зи/. √ликозилирование зависит от типа продуцирующих клеток и видов, из которых эти клетки получены. —тепень и тип гликозилировани€ могут зависеть от соединений, как описано в ≈вропейской патентной за€вке EP 0222313. »зменени€ в гликозилировании могут изменить функции протеина.
ќбычно зрелый протеин насто€щего изобретени€ гликозилирован.
ѕротеины часто образуют ковалентные межцепные св€зи. Ёти дисульфидные св€зи образуютс€ между SH-группами цистеинов в протеине с уложенной цепью или при укладке цепи протеина во врем€ трансл€ции. Ёти св€зи стабилизируют трехмерную структуру протеина. “акие дисульфидные св€зи редко образуютс€ в молекулах протеина, которые еще наход€тс€ в цитозоле клетки, так как высока€ внутриклеточна€ концентраци€ - SH восстанавливающего агента глутатиона разрушает большинство таких св€зей.
ѕоскольку протеины наход€тс€ вне цитоплазмы и секретируютс€ или наход€тс€ на поверхности клеток, они часто образуют дополнительные ковалентные внутрицепные св€зи.
 роме того, аминокислоты могут быть изменены способом, описанным в –—“ за€вке WO 91/10684. ƒругие изменени€ боковых цепей аминокислот также возможны.
ѕредпочтительно, чтобы гомологичность составл€ла, по крайней мере, 90%, более предпочтительно, по крайней мере, 95%, гораздо более предпочтительно, по крайней мере, 98%, и наиболее предпочтительно, чтобы изменени€ касались одной или двух аминокислот.
ѕротеин изобретени€ имеет степень чистоты, по крайней мере 40%: предпочтительно, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере 80%; и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90%. —тепень чистоты определ€ют по количеству протеина насто€щего изобретени€ по отношению к полному количеству протеина. »спользу€ очистку на двух стади€х, вначале гель-фильтрацией на —ефарозе /см. пример 2/, и затем с помощью HPEC /см. пример 15/, получают протеин насто€щего изобретени€, помимо которого никаких других протеинов не детектируетс€ способами примера 15.
ƒалее, насто€щее изобретени€ включает св€зывающие молекулы, отдельные цепи протеинов, антитела или их фрагменты, распознающие специфически домены на зрелом протеине изобретени€.
»спользу€ очищенный протеин изобретени€ /см. например, последовательности Id N 1 - 3/ продуцируют моноклональные антитела хорошо известным способом Koehler and Milstein, который, в частности, включает обычную иммунизацию мышей очищенным протеином изобретени€ в качестве иммуногена.
Ћучшим вариантом насто€щего изобретени€ €вл€етс€ протеин, указанный как последовательность Id N 1, экспрессированный в трансфецированных клетках почки детеныша хом€ка.
 роме того, изобретение включает способ очистки протеина насто€щего изобретени€, включающий /a/ стадию гель-фильтрации на "Superose 12" /см. пример 2/, и /b/ стадию обработки в высокоэффективной системе электрофорез-хроматографи€ /—м. пример 15/.
ѕрименение соединений.
ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют фармакологическую активность и поэтому могут быть использованы в качестве лекарств. »х можно использовать в фармацевтических композици€х, содержащих протеин насто€щего изобретени€ вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.  роме того, насто€щее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически активный протеин насто€щего изобретени€, и его фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемые носители.
¬ частности, протеин насто€щего изобретени€ демонстрирует ингибирование индуцированных коллагеном агрегаций, тромбоцитов и ингибирование адгезии опухолевых клеток, предпочтительно, клеток метастазов опухолей к коллагену.
Ћекарства против агрегации тромбоцитов
ѕротеины насто€щего изобретени€ демонтируют ингибирование агрегации тромбоцитов. “естова€ система описана в примере 1. ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют значительное ингибирование агрегации тромбоцитов в концентрации 0,5 - 50 мкг протеинов слюны в 0,5 мл или 0,5 - 250 мкг протеина в 0,7 мл очищенного протеина /только очистка по способу примера 2/.
“естирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает величину » 50 50 нмолей/л протеина с высокой степенью очистки по способу примеров 2 и 15. ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют ингибирование агрегации тромбоцитов в концентраци€х от 5 нмолей/л до около 1000 нмолей/л
–езультаты, полученные дл€ in vitro тестовых систем, указывают на то, что протеины насто€щего изобретени€ можно использовать в качестве лекарств, или можно использовать дл€ медицинского применени€. –езультаты тестов можно перенести из системы in vitro в системы in vitro, так как это прин€то в этой области знаний. R.J.Shebuski et al. /1990/ Thombosis and Haemostasis, 64:576 - 581
ѕротеины насто€щего изобретени€ ввод€т внутрибрюшинными инъекци€ми, ежедневно или 2 - 3 раза в день. ≈сли вводить животным ежедневно до достижени€ концентрации в крови 100 нмолей/л, у них происходит снижение агрегации тромбоцитов. ¬ этих услови€х не наблюдаетс€ серьезных побочных €влений.
ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют такое ингибирование агрегации тромбоцитов у мышей при ежедневных дозах до достижени€ концентрации в крови от около 10 до 1000 нмолей/л.
ѕоэтому протеины насто€щего изобретени€ можно использовать дл€ лечени€ атеросклероза или тромботических поражений, или дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда. ƒругими словами: протеины насто€щего изобретени€ можно использовать в качестве противоатеросклеротических и противотромботических агентов дл€ млекопитающих, включа€ человека, например, дл€ лечени€ атеросклеторических/тромботических поражений, например, св€занных с разрушением атеросклеротических бл€шек или св€занных с нарушением или удалением эндотели€, например, в результате сепсиса или трансплантации, или дл€ лечени€ нестабильной стенокардии. ≈го можно также использовать дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда фибринолизом или антиопластикой /PTCA/. ≈сли дл€ лечени€ инфаркта миокарда используют фибринолитическую терапию /стрептокиназой, т-–ј или другими плазминогенными активаторами/, тогда протеины насто€щего изобретени€ можно использовать в качестве вспомогательных агентов дл€ предотвращени€ повторной окклюзии кровеносных сосудов. Ћечение инфаркта миокарда катетер-баллоном /–“—ј/ также приводит к поражению стенок кровеносных сосудов, что может привести к образованию новых тромбов. Ёто можно предотвратить, ввод€ протеины изобретени€ во врем€ или после процедуры. Ёти протеины нельз€ использовать только при коронарной ангиопластике, но можно использовать в других вариантах ангиопластики.
Ќасто€щее изобретение обеспечивает:
a/ применение протеина насто€щего изобретени€ дл€ приготовлени€ лекарств дл€ лечени€ атеросклероза или тромбоза, или дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда; /эти протеины год€тс€ дл€ лекарств, принимаемых в цел€х профилактики/.
b/ способ лечени€ атеросклероза или тромбоза, или дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда, который включает введение эффективно подавл€ющего заболевание количества протеина насто€щего изобретени€ пациенту, нуждающемус€ в таком лечении;
c/ фармацевтическую композицию дл€ лечени€ атеросклероза или тромбоза, или дл€ предохранени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда, котора€ включает протеин насто€щего изобретени€ и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
—оответствующие таким показани€м дозы, естественно, завис€т от, например, используемого соединени€ насто€щего изобретени€ хоз€ина, способа введени€ и природы и степени подлежащего лечению заболевани€. ќднако, вообще, показано, на животных, что удовлетворительные результаты достигаютс€ при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 10 до 1000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 30 до 300 нмолей/л.
ѕротеины насто€щего изобретени€ можно вводить любым обычным способом, в частности, энтерально, орально, например, в виде таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в виде растворов или суспензий дл€ инъекций.
ѕредпочтительным протеином €вл€етс€ протеин с последовательностью Id N 1.
Ќасто€щее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединени€ насто€щего изобретени€ вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. “акие композиции соединени€ можно получить обычными способами. —м. Remingtonis Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pemsylwana /1980/.
Ћекарства против метастатических опухолевых клеток.
ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену. “естова€ система представлена на фиг. 14. ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют существенно ингибирование адгезии метастатических опухолевых клеток к коллагену в концентраци€х от 1 до 100 мкг протеина слюны в 0,5 мл или 1 - 500 мкг протеина в 0,5 мл очищенного протеина /очищенного только по способу примера 2/.
“естирование наиболее предпочтительного протеина, протеина с последовательностью Id N 1, дает значение » 50 100 нмоль/л протеина с высокой степенью очистки по способам примеров 2 и 15. ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют ингибирование адгезии опухолевых клеток к коллагену при концентраци€х от 10 до 2000 нмоль/л.
–езультаты, полученные в тестовой системе in vitro, показывают, что протеины насто€щего изобретени€ можно использовать в качестве лекарств или дл€ медицинского лечени€. “естовые результаты, полученные in vitro, можно перенести в систему так, как это прин€то в этой области медицины. Chan et al. /1990/ Science 2:1600 - 1602.
ѕротеины насто€щего изобретени€ можно вводить во врем€ или после хирургической операции первичных опухолей дл€ предотвращени€ образовани€ метастазов за счет отделившихс€ опухолевых клеток, которые могут попасть в поток крови во врем€ операции. “акие антиметастатические эффекты можно исследовать на "экспериментальных" и "спонтанных" животных модел€х, как описано Chan et al., Science 2:1600 - 1602. ѕротеины изобретени€ ввод€т внутрибрюшинными инъекци€ми ежедневно или 2-3 раза в неделю. ≈сли животным ввод€т ежедневно дозу до достижени€ концентрации в крови 200 нмоль/л, у них про€вл€етс€ пониженна€ адгези€ метастатических опухолевых клеток, по данным определени€ количества центров осевших метастатических клеток. ¬ таких услови€х не наблюдаетс€ серьезных побочных эффектов.
ѕротеины насто€щего изобретени€ демонстрируют такую ингибирующую адгезию эффективность по ингибированию метастатических опухолевых клеток к коллагену у мышей при дневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, концентраций от 60 до 600 нмоль/л.
ѕоэтому протеины насто€щего изобретени€ пригодны дл€ лечени€ рака, предпочтительно, рака с метастатическими опухолевыми клетками, и наиболее предпочтительно, рака с большим количеством метастатических опухолевых клеток.
Ќасто€щее изобретение обеспечивает
a/ применение протеина насто€щего изобретени€ дл€ получени€ лекарства дл€ лечени€ рака с метастатическими опухолевыми клетками. /“акие протеины пригодны дл€ профилактических лекарств, вводимых, например, до хирургического удалени€ опухолей/.
b/ способ лечени€ рака с метастатическими опухолевыми клетками, который включает протеин насто€щего изобретени€ и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
ѕри таких показани€х соответствующие дозы будут, естественно, зависеть, например, от используемых соединений изобретени€, пациента, способа введени€ и природы и степени заболевани€, подлежащего лечению. ќднако вообще, удовлетворительных результатов в опытах на животных удаетс€ достичь при ежедневных дозах, обеспечивающих достижение концентрации в крови от 20 до 2000 нмоль/л, предпочтительно, при ежедневных дозах от 60 до 600 нмоль/л.
ѕротеины насто€щего изобретени€ можно вводить любым удобным способом, в частности, энтерально, орально, например, в форме таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в форме растворов или суспензий дл€ инъекций.
ѕредпочтительным соединением €вл€етс€ протеин с последовательностью ID N 1.
Ќасто€щее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение изобретени€ вместе с, по крайней мере, одним фармацевтическим носителем или разбавителем. “акие композиции можно приготовить обычными способами. —м. Pemington Pharmaceutical Science, 15 ed, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania /1980/.
 раткое содержание изобретени€
¬ насто€щем изобретении предложен ингибитор вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека. Ќовый специфический ингибитор представл€ет собой природный протеин /то есть не олигопептид/, который также ингибирует взаимодействие опухолевых клеток с коллагеном. “акой ингибитор присутствует в слюне кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis. —м. пример 1.
“аким образом, насто€щее изобретение относитс€ к очищенному и выделенному протеину, который ингибирует индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. Ётот протеин можно выделить из Triatoma pallidipenis. ќно также относитс€ к фармацевтическим композици€м, содержащим протеин, и к способам применени€ последнего дл€ лечени€ тромботических поражений, или дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфарктов миокарда, а также дл€ лечени€, нар€ду с другими, развити€ метастазов.
“аким образом, насто€щее изобретение обеспечивает ценное фармакологически активное вещество, например новый протеин, который специфически ингибирует вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, с высокой степенью специфической активности; новый протеин, который специфически противодействует взаимодействию тромбоцит-коллаген, не вызыва€ высвобождени€ внутритромбоцитных составл€ющих, например ј“√, который обладает нежелательным побочным эффектом сам по себе; новый протеин дл€ фармацевтического использовани€ при лечении атеросклероза и тромбоза или дл€ предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда; новый протеин, который противодействует взаимодействию опухолева€ клетка-коллаген и который можно использовать, например, дл€ предотвращени€ метастазов опухолевых клеток.
»сследовани€ характеристик и свойств ингибитора привели к следующим результатам:
1/ »нгибитор не €вл€етс€ антагонистом рецепторов фибриногена, так как эксперименты с возрастающими концентраци€ми фибриногена не вы€вили какого-либо вли€ни€ на ингибирующую активность. —м. ѕример 3.
2/ ќн не €вл€етс€ антагонистом тромбоксана, так как предотвращает вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, предварительно обработанных аспирином, а не агрегацию, вызванную U 46619 /имитатор тромбоксана/. —м. пример 4.
3/ ѕо-видимому, он не €вл€етс€ ингибитором направлени€ трансдукции сигнала, осуществл€емого за счет протеинкиназы C, так как агрегаци€, индуцируема€ форболестера /форбол-12-миристал-13-ацетат/ не ингибируетс€. —м. пример 4.
4/ ќн ингибирует реакцию высвобождени€ обработанных коллагеном тромбоцитов. —м. пример 5.
5/ ќн не ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызываемую тромбином или јƒ–. —м. пример 6.
6/ »нгибитор не реагирует с коллагеном. ’от€ предварительное инкубирование ингибитора с коллагеном и не приводит к повышению ингибирующей активности, пролонгированное инкубирование тромбоцитов с ингибитором приводит к более высокой потенции ингибиторов. —м. пример 7.
7/ »нгибирование агрегации тромбоцитов становитс€ обратимым при добавлении больших количеств коллагена. —м. пример 7.
8/ »нгибиторы протеазы не обладают заметным вли€нием на активность. ѕример 8.
9/ »нгибирующа€ активность возрастает в присутствии ионов Mg2+. —м. пример 9.
10/ »нгибитор предотвращает адгезию тромбоцитов к коллагеновой матрице зависимым от дозы способом. —м. пример 10.
Ёти результаты дают возможность предположить, что этот ингибитор €вл€етс€ антагонистом коллагенового рецептора с высокой специфической активностью, например, » 50 = 2,5 мкг/мл сборной фракции "Superose", описываемой далее /на основании частично очищенного ингибитора/, и » 50=50 нмоль/л дл€ высокой степени очистки протеина /очищенного на последовательных стади€х, описанных в примерах 2 и 15/.
11/ »нгибитор инкубировали с трипсином, св€занным на сефарозной матрице. »нгибитор полностью тер€л активность за счет протеолитического расщеплени€. —м. пример 11, в котором показано, что ингибитор €вл€етс€ протеином.
12/ »нгибитор не расщепл€етс€ коллагеназой. —м. пример 12.
13/ ѕо данным гель-фильтрационной хроматографии в присутствии 150 мћ NaCl ингибитор имеет молекул€рный вес 20 мƒа±5 кƒ, то есть, около 20 кƒ. —м. пример 13. «начение дл€ негликолизированного протеина /см. последовательность Id N 1/, рассчитанное дл€ кƒЌ  последовательности, составл€ет 18923 ƒальтон.
14/ »нгибитор предотвращает адгезию высоко метастатических опухолевых клеток /MT Zn 3/ к коллагену зависимым от дозы образом /—м. пример 14/.
»нгибитор насто€щего изобретени€ не св€зываетс€ с /или не реагирует с/ коллагеном, не св€зываетс€ с тромбоцитами и не вызывает флоккул€ции коллагена.
»нгибитор коллаген насто€щего изобретени€ можно обычным способом выделить из слюны кровососущих насекомых Triatoma pallidipennis, например, как описано в примерах. ќбычные способы сбора слюны вполне применимы дл€ получени€ исходного материала слюны. Ќасекомые Triatoma pallidipennis преимущественно распространены, и поэтому легко доступны, в центральной и северной јмерике. ќни известны как вектор дл€ Trypanosoma Cryi.
¬ другом аспекте насто€щего изобретени€ предложена ƒЌ  последовательность, векторы, содержащие эту последовательность клетки, содержащие эти векторы, способы рекомбинантного получени€ протеинов и антител к протеинам насто€щего изобретени€. “акже предложены выделенные и/или рекомбинантные ƒЌ  последовательности /например, геномна€ или кƒЌ /, кодирующие протеин /например, природный/, которые ингибируют вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. ≈ще в одном аспекте, насто€щее изобретение обеспечивает рекомбинантно полученные протеины изобретени€, например, имеющие раскрытые в изобретении последовательности.
ѕод термином "выделенный" подразумевают, что ингибитор насто€щего изобретени€ или другой агент присутствует в форме, выделенной из /очищенной от/ компонентов, с которыми он природно объединен, или с которым он получен рекомбинантно или синтетически.
¬ообще включены все степени такого выделени€ или очистки. ѕредпочтительны такие степени выделени€ или очистки, после которых ингибитор может быть использован дл€ фармацевтических целей. “ак, например, такие степени выделени€ /например, активности или чистоты/ можно получить в результате таких хроматографических методик, которые описаны в примерах. ƒальнейшей очистки, например, до гомогенности, можно удобно достичь, использу€ обычные методики, например, раскрытые в следующих литературных источниках:
Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed.
Murray P. DEUTSCHER, Academic Press 1999;
Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E.L.V. Harris и S.ANGEl, IRL-Press 1990; Prorin Purification, Principles and Practice, Robert SCOPES, Springer-Verlag 1982; и Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.
—тепень чистоты можно определить любым из р€да известных способов, например, SDS - электрофорезом на полиакриламидном геле, аналитической ¬∆’ и т. д. ќчищенный ингибитор можно использовать дл€ определени€ аминокислотной последовательности протеина по способу полностью хорошо известному специалистам. Hewick, R.m. et al. /1981/, J. Biol. Chem 256. 7990-7997.
ѕротеины насто€щего изобретени€ включают не только протеины, выделенные из приведенных в примере видов насекомых, но также из любых других организмов, которые могут содержать такой ингибитор.  роме того, ингибитор насто€щего изобретени€ включает ингибиторы родственной структуры, например, ингибитор, вызываемой коллагеном агрегации тромбоцитов, выделенный из другого организма, который имеет практически аналогичную аминокислотную последовательность.
“ак как этот протеин выделен из жал€щих насекомых, и его природное предназначение состоит в том, чтобы предотвратить закупорку кровью раны, образующейс€ после укуса, на достаточно длительный промежуток времени, чтобы насекомое могло отсосать кровь, совершенно очевидно, что другие подобные ингибиторы агрегации тромбоцитов под действием коллагена, можно обнаружить в слюне других кровососущих организмов, особенно насекомых, например, у других Reduviit bugs с конусными носами подсемейства. Triatominaе, таких как Triatoma infestans, T, dimidiata, T.maculata, Rhodmius prolixus, Panstrongylus megistus and P.infestans.
ѕротеины насто€щего изобретени€ включают мономерные одноцепочечные молекулы, то есть такие, которые ковалентно или нековалентно не св€заны с другими полипептидными цеп€ми. Ќасто€щее изобретение охватывает также другие формы молекул протеина, например, димеры или другие олигомеры, третичные структуры, образованные с другими полипептидами, фрагментами протеина и т.д. ¬ключены как гликозилированные, так и негликозилированные формы, причем обе формы можно получить обычными способами экспрессией из, например, млекопитающих /гликозилированных/ или бактериальных клеток /негликозилированных/, соответственно.
јминокислотную последовательность ингибитора насто€щего изобретени€ можно использовать дл€ определени€ последовательности подход€щего ƒЌ  зонда, который можно использовать дл€ нахождени€ новых ингибиторов, например, в других видах. “акие зонды можно синтезировать обычным способом, например, использу€ автоматические ƒЌ  синтезаторы и скриниру€ геномную или к ƒЌ  библиотеки аналогично способам известным специалистам /см. международную публикацию WO 90/07861 от 26 июл€ 1990 г./
“ак, например, насто€щее изобретение относитс€ к ƒЌ  последовательности как раскрыто в фиг. 12a-c, 13 a и b и 22-24.  роме того, насто€щее изобретение относитс€ к ƒЌ  последовательности, кодирующей мутации, как указано ранее. ѕоследовательность дл€ -18 до +5 участка на фиг. 18, 21 и 24 получают из соответствующих полной длины кƒЌ  последовательностей ингибиторов 1 и 2.
ѕоэтому насто€щее изобретение включает также ƒЌ  последовательность /кодирующую/ как природную ƒЌ  последовательность /ген/ ингибитора, когда ее выдел€ют из природного окружени€, например, в растворе или на векторе, а также их мутанты, так и встречающуюс€ в природе, например, в других видах, в выделенной форме или синтетической, например, полученной сайт-направленным мутагенезом. —пособы скринировани€ генетических библиотек различных видов подход€щим зондом обычны дл€ специалистов. —пособы получени€ мутантов также рутинны и знакомы специалистам, также как и способы тестировани€ эффективности таких новых протеинов, например, как описано.
ѕодход€щие мутанты, либо синтетические, либо природные /в выделенной форме/ представл€ют собой такие, которые содержат, по крайней мере, часть, например, 5%, предпочтительно, по крайней мере, 50%, и более предпочтительно, по крайней мере, 90% биологической активности, например ингибитора индуцируемой коллагеном, агрегации тромбоцитов, природного, выделенного из T.pallidipennis ингибитора, как указано.
ѕодход€щие мутанты могут отличатьс€ от природных протеинов любой возможной модификацией, включа€ делеции, добавлени€ и/или замену одной или более из аминокислот, при условии, что сохран€етс€ при этом основна€ биологическа€ активность; предпочтительно, чтобы биологическа€ активность не была бы затронута. “акие мутанты €вл€ютс€ эквивалентами природных протеинов.
јналогично, эквиваленты ƒЌ  последовательностей, раскрытые здесь, включают аллельные варианты, последовательности, кодирующие эквивалентные мутанты, раскрытые здесь, и ƒЌ  последовательности, которые им гомологичны.
 роме того, насто€щее изобретение включает фрагменты тромболитического полипептида, например, с аналогичными функци€ми или выделенными подфункци€ми, например, выделенные эпитопы, активные сайты, фибрин и/или фиброген св€зывающие участки, и т.д. ѕредпочтительны одноцепочечные формы ингибитора.
Ќасто€щее изобретение относитс€ также к антителам и продуцирующим антитела клеточным лини€м, которые можно получить обычным способом, использу€ очищенные протеины насто€щего изобретени€, например, общеприн€тым способом Kohler and Milstein, который предусматривает обычную иммунизацию мышей протеином насто€щего изобретени€ в качестве иммуногена. Ќасто€щее изобретение относитс€ также к фрагментам указанных антител, например фрагментам, содержащим домены, которые св€зываютс€ с эпитопами ингибиторного протеина и с синтетическими св€зывающими доменами, например мимотопами, специфически распознающими доменами протеинов насто€щего изобретени€.
»нгибитор индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов человека /и других млекопитающих/ насто€щего изобретени€ можно использовать в качестве противоатеросклеротического и противотромботического агента дл€ млекопитающих, включа€ человека, например, дл€ лечени€ атеросклеротических/тромботических поражений, св€занных, например, с разрывом атеросклеротических бл€шек, образующихс€ в результате операций на сосудах /PTA/TPCA/ или св€занных с нарушением или удалением эндотели€, например, в результате сепсиса или трансплантаций. ≈го можно также использовать дл€ лечени€ нестабильной стенокардии и/или предотвращени€ повторной окклюзии после лечени€ инфаркта миокарда. ѕодробности такого применени€, например, интервалы доз, режимы введени€ /предпочтительно, орально или парэнтерально/ и т.д., можно определить обычным способом например, аналогично и/или при сопоставлении с другими противотромботическими агентами, такими как т-PA, стрептокиназа, или другие ингибиторы агрегации тромбоцитов.
»нгибитор насто€щего изобретени€ можно также использовать дл€ предотвращени€ метастазов опухолевых клеток за счет блокировани€ их прохождени€ через соединительные ткани. ќни применимы дл€ предотвращени€ метастазов всех инвазивных опухолей например меланомы. ƒальнейшее предлагаетс€ без намерени€ представить какую-либо теорию. ¬о врем€ образовани€ метастазов опухолевые клетки, должны проникнуть через основную мембрану и интерстициальный матрикс. ¬ обоих матриксах находитс€ множество типов коллагенов. –аспространение опухолевых клеток требует взаимодействи€ с этими протеинами. ƒоказательства роли рецептора коллагена /VLA 2/ в таком взаимодействии представлено, например, Chan et al. /1990, 2, 1600 - 1602/, который клонировал VLA 2 позитивные опухолевые клетки, которые образовали гораздо более метастатические опухолевые колонии (Kramer and Marks /J. Bid. Chem. 1989, 264, 4684-4688), были способны блокировать присоединение клеток меланомы человек к коллагену за счет антитела к VLA 2. —м также PA US 73234708-A" ћоноклональные антитела против тромбоцитов, которые ингибируют реакцию тромбоцитов с коллагеном и используют дл€ определени€ и лечени€ рака" US Dept. Helthah and Human Services. »нгибитор насто€щего изобретени€, будучи антагонистом рецептора коллагена, предотвращает взаимодействие опухолевых клеток с окружающей матрицей и, таким образом, ингибирует образование метастазов.
≈го можно также использовать в качестве стандарта дл€ определени€ эффективности новых ингибиторов, которые можно создать, например, модифициру€ структуру насто€щего ингибитора стандартным мутагенезом, направленным мутагенезом, например, делецией и/или вставками последовательностей и т.п. »нгибитор насто€щего изобретени€ можно также использовать в качестве противотромботического агента в процедурах скрининга, в которых определ€ют эффективность различных соединений в качестве противотромботических, или в качестве стандарта дл€ определени€ эффективности соединений, которые блокируют эффекты таких индуцируемых коллагеном агрегаций тромбоцитов, например, у пациентов, страдающих недостаточной свертываемостью крови.
Ѕез дальнейших описаний, считаетс€, что специалист, использу€ вышесказанное, может в полной степени использовать насто€щее изобретение. ѕоэтому представленные далее предпочтительные варианты следует рассматривать исключительно как иллюстративные и никоим образом не лимитирующие насто€щее изобретение.
ƒругие цели, особенности и соответствующие преимущества насто€щего изобретени€ более полно раскрыты и станут более пон€тными при рассмотрении вкупе с прилагаемыми рисунками, в которых:
‘иг. 1 представл€ет зависимость от дозы ингибировани€ агрегации тромбоцитов человека слюной Triatoma;
‘иг. 2 представл€ет зависимость от дозы ингибировани€ агрегации тромбоцитов человека "Superose"-пулом слюны Triatoma;
‘иг. 3 представл€ет картину гель-фильтрации на "Superose 12".
‘иг. 4 представл€ет зависимость ингибировани€ агрегации от концентрации фибриногена;
‘иг. 5 представл€ет предотвращение индуцируемой колагеном агрегации тромбоцитов, предварительно обработанных аспирином;
‘иг. 6 демонстрирует отсутствие реакции ингибитора с коллагеном;
‘иг. 7 представл€ет протеолитическое переваривание ингибитора;
‘иг. 8 представл€ет стабильность ингибитора под действием коллагеназы;
‘иг. 9 представл€ет определение молекул€рного веса ингибитора;
‘иг. 10 представл€ет очистку ингибитора до гомогенности;
‘иг. 11 представл€ет размеры PCR продуктов;
‘иг. 12a представл€ет ƒЌ  последовательность субклонированного PCR продукта типа 1 и установленную последовательность аминокислот;
‘иг. 12b представл€ет ƒЌ  последовательность субклонированного PCR продукта типа 2 и установленную аминокислотную последовательность.
‘иг. 12c представл€ет ƒЌ  последовательность субклонированного PCR продукта типа 3 и установленную аминокислотную последовательность;
‘иг. 13a представл€ет полную ƒЌ  последовательность клонированной кƒЌ  ингибитора 1 и соответствующую аминокислотную последовательность;
‘иг. 13b представл€ет полную ƒЌ  последовательность клонированной кƒЌ  ингибитора 2 и соответствующую аминокислотную последовательность;
‘иг. 14 представл€ет экспрессию плазмиды, содержащей ƒЌ , кодирующей ингибитор;
‘иг. 15 представл€ет молекул€рный вес зрелого рекомбинантного протеина, определенный антителами, специфически распознающими зрелый протеин;
‘иг. 16 представл€ет последовательность зрелого протеина ингибитора-1;
‘иг. 17 представл€ет последовательность зрелого протеина ингибитора-2;
‘иг. 18 представл€ет последовательность зрелого протеина ингибитора-3;
‘иг. 19 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-1;
‘иг. 20 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-2;
‘иг. 21 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности зрелого протеина ингибитора-3;
‘иг. 22 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности препротеина ингибитора-1;
‘иг. 23 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности препротеина ингибитора-2;
‘иг. 24 представл€ет ƒЌ  кодирующей последовательности препротеина ингибитора-3;
‘иг. 25 представл€ет схему получени€ кƒЌ  насто€щего изобретени€ и
‘иг. 26 представл€ет N-терминальные аминокислоты протеина изобретени€ в последовательности Id N 10.
—писок идентифицированных последовательностей:
—писок последовательностей:
ѕоследовательность 1: последовательность зрелого протеина ингибитора - 1.
ѕоследовательность 2: последовательность зрелого протеина ингибитора - 2.
ѕоследовательность 3: последовательность зрелого протеина ингибитора - 3.
ѕоследовательность 4: ƒЌ  кодирующа€ последовательность зрелого протеина ингибитора - 1.
ѕоследовательность 5: ƒЌ  кодирующа€ последовательность зрелого протеина ингибитора - 2.
ѕоследовательность 6: ƒЌ  кодирующа€ последовательность зрелого протеина ингибитора - 3.
ѕоследовательность 7: ƒЌ  кодирующа€ последовательность препротеина ингибитора - 1.
ѕоследовательность 8: ƒЌ  кодирующа€ последовательность препротеина ингибитора - 2.
ѕоследовательность 9: ƒЌ  кодирующа€ последовательность препротеина ингибитора - 3, и
ѕоследовательность 10: “-терминнальные аминокислоты зрелого протеина.
¬ предшествующих и последующих примерах все температуры даны без поправок в o÷ельси€ и, если нет других указаний, все части и проценты указаны по весу. ¬се полные раскрыти€ всех за€вок, патентов и публикаций, цитированные ранее и далее, включены сюда по ссылке.
ѕример 1. јктивность протеина насто€щего изобретени€.
јгрегаци€ тромбоцитов человека в присутствии коллагена ингибируетс€, если добавл€ют слюну Triatoma pallidipennis или очищенный протеин. —тепень ингибировани€ коррелирует с концентрацией слюны протеина.
Ќасекомых стимулируют на выделение слюны на силиконизированные стекл€нные пластины с механической стимул€цией. ¬ыделившийс€ материал собирают, отсасыва€ силиконизированными пастеровскими пипетками. 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с различными количествами слюны /1,25 - 20 мкг протеина в 20 мкл/ или с различными количествами "Superose"-пула /0,5 - 10 мкг протеина в 200 мкл/ из примера 2 при 37oC в агрегометре. —пуст€ 1 минуту, добавл€ют 1 мкг коллагена и контролируют возрастание пропускани€ света /агрегаци€/. —м. фиг. 1 и 2.
ѕример 2. ќчистка протеина.
¬ажной стадией очистки протеина €вл€етс€ использование гель-фильтрации на "Superose 12". 2 мл /5 мг протеина/ слюны обрабатывают на хроматографической колонке "Superose 12" HR 16/50 /Pharmacia/ в 10 мћ T /HCl, pH 7,4; 0,0001% "Pluronic F68". «атем ингибиторы элюируют 10 мћ Tris /HCl, pH 7,4; 0,0001% "Pluronic F68", 200 мћ NaCl. —м. фиг. 3. ѕул ингибитора содержит 25 мкг/мл протеина. 5 мкг протеина демонстрируют 70% ингибировани€ агрегации. јгрегаци€ тромбоцитов без ингибитора определ€етс€ как 100% агрегации и 0% ингибировани€. ќстальные данные, соответственно, рассчитываютс€.
ѕример 3. »нгибирование не зависит от фибриногена.
јктивность ингибитора, представленного протеином насто€щего изобретени€, не зависит от концентрации добавл€емого фибриногена, 500 мкг отфильтрованных на геле тромбоцитов объедин€ют с фибриногеном и 50 мкг слюны. ѕосле инкубировани€ в течение 1 мин при 37oC добавл€ют 1 мкг коллагена и определ€ют агрегацию. ѕолученные значени€ представлены пр€моугольниками 2 и 4 /со слюной/ и не демонстрируют заметной разницы, тогда как значени€, представленные пр€моугольниками 1 и 3 /без слюны/, коррелируют с концентрацией фибриногена. —м. фиг. 4. “ест дл€ определени€ механизма агрегации тромбоцитов, индуцированной протеинами изобретени€ (пример 4).
ƒл€ изучени€ механизма действи€ протеина насто€щего изобретени€ некоторые стандартные соединени€ добавл€ют к тестовой системе, в которой в другом варианте присутствует или протеин изобретени€, или буфер. јктивность протеина изобретени€ заметно не измен€етс€ при добавлении аспирина /пр€моугольник 4/. ¬ли€ние соединений U46619 и PMA не мен€етс€ под действием протеина изобретени€. ѕоэтому протеин изобретени€ не €вл€етс€ антагонистом тромбоксана и, веро€тно, не €вл€етс€ ингибитором протеинкиназы C.
ѕр€моугольники 1 и 2: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с протеином насто€щего изобретени€ /пр€моугольник 2/ /200 мкл пула "Superose"/ или с буфером /пр€моугольник 1/ соответственно при 37oC в течение 1 минуты. «атем добавл€ют 1 мкг коллагена и агрегацию контролируют агригометром.
ѕр€моугольники 3 и 4: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с 1 мћ аспирина в течение 20 минут при комнатной температуре. ѕосле этого добавл€ют протеин изобретени€ /пр€моугольник 4/ или буфер /пр€моугольник 3/. ѕосле инкубировани€ в течение 1 минуты при 37oC добавл€ют 1 мкг коллагена, и определ€ют агрегацию.
ѕр€моугольники 5 и 6: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с протеином изобретени€ /пр€моугольник 6/ или с буфером /пр€моугольник 5/, соответственно, в течение 1 минуты при 37oC. «атем добавл€ют U46619 /1 мкћ/ и определ€ют агрегацию.
ѕр€моугольники 7 и 8: 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с протеином изобретени€ /пр€моугольник 8/ или с буфером /7/, соответственно, при 37oC в агрегометре. —пуст€ 1 минуту добавл€ют 10 нг PMA /форбол-12-миристат-13-ацетат/ и определ€ют агрегацию.
ѕолученные результаты представлены на фиг. 5.
–еакци€ высвобождени€ тромбоцитов /A“P измерени€/ /пример 5/. ≈сли присутствуют тромбоциты и коллаген, протеин изобретени€ может ингибировать активацию тромбоцитов. ATP используют в качестве индикатора активации. 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы инкубируют с 200 мкл протеина изобретени€ /—уперозный или H2O соответственно при 37oC в течение 1 мин. «атем добавл€ют 1 мкг коллагена. јгрегацию контролируют в течение 10 минут. ѕосле этого 200 мкл суспензии объедин€ют с 250 мкл Hepes буфера pH 7,4, 100 мћ люциферина и 5 мкг/мл люциферазы. «атем измер€ют люминесценцию.
ѕолное содержание ј“– тромбоцитов определ€ют после лизиса тромбоцитов "Nomdet P40".
ѕример 6. »нгибирование агрегации тромбоцитов, вызванной различными веществами.
ѕротеин изобретени€ специфичен дл€ индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов. 500 мкл отфильтрованных тромбоцитов /300000 тромбоцитов/мкл/ инкубируют с протеином изобретени€ в течение 1 мин при 37oC. «атем индуцируют агрегацию коллагеном /2 мкг/мл/, тромбином /0,06 U/мл/ или ADP /1 · 10-5 ћ/ соответственно, и измер€ют агрегацию.
ѕример 7. »нгибирование индуцируемой коллагеном агрегации.
ѕротеин насто€щего изобретени€ не реагирует с коллагеном. »нгибирование индуцируемой коллагеном агрегации тромбоцитов в присутствии протеина можно нейтрализовать избытком дополнительно добавленного коллагена. »ндуцируемую коллагеном агрегацию /2 мкг/мл/ дл€ 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы определ€ют следующими модификаци€ми:
1: контроль, без ингибитора;
2: протеин изобретени€ /100 мкг слюны/ 10 минут предварительно инкубируют с тромбоцитами человека перед добавлением коллагена;
3: ингибитор /100 мкг слюны/ 10 минут предварительно инкубируют с коллагеном перед добавлением обогащенной тромбоцитами плазмы.
4, 5, 6: после измерени€ агрегации, 2, 5 и 10 мкг коллагена, соответственно, добавл€ют к пробе N 2, и снова измер€ют агрегацию. —м. фиг. 6.
ѕример 8. ¬ли€ние ингибитора протеазы на ингибирующую активность.
ѕротеин изобретени€ не €вл€етс€ протеазой. »нгибиторы протеазы /2 мћ PMSF, 2 мћ леупептина, 2 мћ апротенина/ или буферов инкубируют с течение 15 минут с "—уперозным" - пулом /200 мкл/. ќбогащенную тромбоцитами плазму добавл€ют, и агрегацию стимулируют коллагеном /2 мкг/мл/
»нгибитор зависит от присутстви€ Mg2+ (пример 9).
 атионы Mg2+ повышают ингибирование агрегации тромбоцитов за счет протеина изобретени€.  атион Ca2+ не оказывает существенного вли€ни€ на ингибирование агрегации тромбоцитов, 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы объедин€ют с 2 мћ Mg2+ или Ca2+ и 40 мкг слюны или буфера. ѕосле инкубировани€ в течение 1 минут при 37oC 1 мкг коллагена добавл€ют и измер€ют агрегацию.
ƒобавки - ћаксимальна€ агрегаци€, %
--- - 77
—люна - 33
2 мћ Mg2+ - 75
—люна + 2 мћ Mg2+ - 19
2 мћ Ca2+ - 63
—люна + 2 мћ Ca2+ - 39
ѕример 10. »нкубирование тромбоцитов с протеином изобретени€ демонстрирует снижение адгезии к коллагену.
≈сли тромбоциты инкубируют с протеином изобретени€, они частично тер€ют свою способность св€зывать коллаген. ѕластины с 96 €чейками покрывают коллагеном /тип 1 при 40oC в течение ночи/. 1 · 107 тромбоцитов в €чейке инкубируют с различными количествами ингибитора, и 2 мћ Mg2+ в течение 20 мин при 37oC при перемешивании. »х промывают PBS и прилипшие тромбоциты фиксируют 2,5% глутаральдегида в течение 2 ч при 37oC. «атем тромбоциты удал€ют из €чеек и считают под микроскопом.
ѕротеин* - „исло прилипших тромбоцитов на мм2
--- - 13500
10 мкл - 12000
50 мкл - 6500
* ѕротеин = "Superose" - пул, концентрированный до 0,5 мг протеина/мл
ѕример 11. »нкубирование ингибитора с трипсин-—ефарозой.
ѕротеин изобретени€ переваривают трипсином, св€занным с —ефарозой. ѕереваривание протеина изобретени€ приводит к полной потере активности протеина изобретени€. 200 мкг слюны объедин€ют с трипсином, св€занным с —ефарозой или с буфером, или соответственно, с —ефарозой и трипсин-—ефарозой, объединенной с буфером. ¬се порции содержат 150 мћ NaCl дл€ предотвращени€ неспецифической адсорбции на матрице. ѕосле инкубировани€ в течение ночи при комнатной температуре при перемешивании образцы центрифугируют и надосадочную жидкость добавл€ют к среде анализа на агрегацию /500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы, 1 мкг коллагена/. ѕротеолитическое переваривание контролируют на SDS-полиакриламидном геле. —м. фиг. 7.
ѕример 12. »нкубирование ингибитора с коллагеназа-—ефарозой.
ѕротеин изобретени€ не расщепл€етс€ коллагеназой.  оллагеназу /Clostridium Ristolyticum/ св€зывают с —ефарозой и используют в следующих порци€х:
1. 100 мкл коллагеназа-—ефарозы + 60 мкл протеина изобретени€ + 140 мкл H2O + 10 мкл буфера.
2. 100 мкл 150 мћ NaCl, 50 мћ Tris /HCl pH 7,4 + 60 мкл протеина изобретени€ + 140 мкл H2O + 10 мкл буфера.
3. 100 мкл коллагеназа-—ефарозы + 200 мкл H2O + 10 мкл буфера. ¬ качестве контрол€ бычью сыворотку соедин€ют с —ефарозой и используют в следующих порци€х:
4. 100 мкл BSA-—ефарозы + 60 мкл протеина изобретени€ + 140 мкл H2O + 10 мкл буфера.
5. 100 мкл BSA-—ефарозы + 200 мкл H2O + 10 мкл буфера.
протеин: "Superose" пул
буфер: 140 мћ Tris /HCl, pH 7,4, 100 мћ CaCl2.
ѕорции центрифугируют и 200 мкл каждой из надосадочных жидкостей инкубируют с 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 1 мин при 37oC. «атем 1 мкг коллагена добавл€ют и определ€ют агрегацию. јктивность коллагеназа-—ефарозы контролируют, инкубиру€ с коллагеном, и провод€т электрофорез на SDS-полиакриламидном геле. —м. фиг. 8.
ѕример 13. ћолекул€рную массу определ€ют дл€ ингибитора с помощью гель-фильтрации.
ќчищенный протеин изобретени€ имеет молекул€рный вес 20000 ± 5000 ƒальтон; определено на колонке Superose 12. "Superose"-пул из 2 мл слюны /см. пример 2/ обрабатывают хроматографически на "Superose 12" HR 16/50 колонке в Tris /HCl pH 7,4, 150 мћ NaCl, 0,0001% "P1 " F68. јльбумин бычьей сыворотки /Mb 67 кƒа/, химитрипсиноген /Mb 25 кƒа/, рибонуклеазу /Mb 14 кƒа/ используют в качестве маркеров молекул€рного веса. —м. фиг. 9. јдгези€ опухолевых клеток к коллагену снижаетс€ в присутствии протеина изобретени€ (пример 14).
ѕротеин изобретени€ ингибирует адгезию опухолевых клеток к коллагеновой матрице. ѕоэтому миграцию опухолевых клеток можно предотвратить частично или полностью от оседани€ в органах или кровеносных сосудах, если протеин насто€щего изобретени€ находитс€ в крови или плазме пациента.  летки MT Zn 3 /опухолевые клетки молочной железы крыс/ мет€т 51Cr. ячейки пластины покрывают коллагеном /тип III/ при 4oC в течение ночи. ¬начале 2 · 104 меченых клеток в 500 мкл DMEM F12 среды, 20 мћ Heр, 1 мћ бикарбоната, 1% BSA инкубируют с 0, 2, 5 или 10 мкл протеина изобретени€ /"Superose" пул, 0,5 мг протеина /мл/ соответственно в течение 10 мин при 37oC. «атем эту суспензию перенос€т на покрытые коллагеном €чейки и инкубируют в течение 12 часов при 37oC. ѕосле этого €чейки промывают, а прилипшие клетки удал€ют 1 ћ NaOH. ќпредел€ют радиоактивность прилипших клеток.
 оличество добавленного ингибитора, мкл - ѕрисоединение клеток /срм/
0 - 2215
2 - 2071
5 - 1608
10 - 1081
ѕример 15. ќчистка ингибитора до гомогенности.
ѕротеин изобретени€ выдел€ют по способу примера 2, очищают до гомогенности, использу€ систему высокоэффективного электрофореза-хроматографии.
„астично очищенный ингибитор ввод€т в систему высокоэффективного электрофореза-хроматографии /HPEC/ из Applied Biosystems, Inc./ Foster City, CA/. Ёлектрофорез провод€т на 7,5% полиакриламидном геле в буферной системе Tris /глицин в соответствии с инструкци€ми изготовител€. ќбразец буфера, содержащий SDS, но не восстанавливающий агент /например, ƒ““/ и аликвоты не нагревают до введени€ на гель. ѕротеин последовательно элюируют из гел€, детектируют, измер€€ абсорбцию при 230 нм, и фракционируют. ‘ракции, обладающие ингибирующей активностью, анализируют с помощью SDS-полиакриламидного гель-электрофореза /12,5% SDS-полиакриламидный гель, окрашенный Coomassie Biolliant Blue/. —м. фиг. 10.
ѕример 16. јнализ аминокислот.
ќбразцы протеинов выпаривают досуха и гидролизуют 6н. HCl, содержащей 2% фенола, в течение 24, 48 и 72 ч. —одержание цистеина определ€ют как цистеиновую кислоту после окислени€ пермуравьиной кислоты /Moore, J. Biol. Chem. 238, 235 - 27 /1963//. —одержание триптофана определ€ют после гидролиза в 4 н. N-метансульфокислоте в течение 24 часов /Simpson et al., J. Biol. Chem. 251, 1936 - 1940 /1976//. «атем образцы анализируют на аминокислотном анализаторе. ѕолучены следующие результаты /данные приведены в % от полного количества аминокислот/: Gly = 8,3, Ala = 1,6, Ser = 8,9, Thr = 10,7, Val = 8,7, Leu = 6,6, Ile = 2,5, Pro = 4,5, Cys = 3,0, Met = 1,0, His = 2,3, Tyr = 4,3, Asp = 6,2, Glu = 7,2, Lys = 11,0, Arg = 1,8, Asn = 5,7, Gln = 2,3, Phe = 2,5 и Trp = 1,1.
ѕример 17. ќпределение аминокислотных последовательностей
ѕротеин секвенируют на автоматическом аминокислотном секвенаторе Applied Biosystems, Inc. /IBI/ /Foster City, CA/ в соответствии с инструкцией изготовител€. ѕоследовательность аминокислот 1- 20 /с N-конца/ представл€ет:

ѕример 18. PCR-амплификаци€, субклонирование и ƒЌ  секвенирование основных фрагментов трех форм ингибиторной кƒЌ  из кƒЌ  слюнных желез Friatoma pallidipennis.
„асть 1. ѕолучение –Ќ  слюнных желез Friatoma pallidipennis и синтез первой нити кƒЌ .
Ќачина€ с полной очищенной –Ќ  из слюнных желез, последовательности –Ќ  транскрибируют обратной транскриптазой до получени€ первой нити кƒЌ . ƒл€ синтеза первой нити кƒЌ  используют специальный олигонуклеотид в качестве затравки. ѕолную –Ќ  выдел€ют из слюнных желез Friatoma pallidipennis способом, который включает растворение ткани в гуанидин-тиоцианате с последующим ультрацентрифугированием лизата в градиенте хлорида цези€ /Sambrook, J, Fritsсh, E.T. Maniatis, T.: Molecular Cloning гл. 18 - 22, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989/. 10 мкг полной –Ќ  слюнных желез, полученной таким образом, используют дл€ синтеза первой нити комплементарной ƒЌ  /кƒЌ /. ƒл€ этой цели используют обратную транскриптазу вируса мышиной лейкемии Moloney, соответствующий реакционный буфер деоксинуклеотиды и блок II –Ќазы, коммерчески доступной от "Ist Strand Synthesis kit" /—тратагене  лонинг —истем, La Yolla,  алифорни€, —Ўј/ в соответствии с указани€ми изготовител€. ќлигодеоксинуклеотид, включенный в стадию отжига реакции примировани€ первой нити кƒЌ  синтеза, не €вл€етс€ нуклеотидом, включенным в "Ist Strand Synthesis kit", но €вл€етс€ линкер-праймером /1,4 мкг/, вз€тым из коммерчески доступного набора "ZAP-CDNATM Synthesis kit" / —тратагене  лонинг —истемз/. ≈го последовательность представлена далее /а Xh ol последовательность, распознающа€ реатрикционную эндонуклеазу, подчеркнута: см. также фиг. 25/.

„асть 2. PCR амплификаци€ фрагментов кƒЌ  ингибитора из кƒЌ  первой нити слюнных желез.
»сход€ из аминокислотной последовательности, котора€ определена расщеплением по Ёдману очищенного протеина насто€щего изобретени€, разрабатывают и синтезируют три олигодеоксинуклеотида и один линкерный олигодеоксинуклеотид. Ќа основании выбранных фрагментов аминокислотной последовательности, определенной дл€ N-конца очищенного ингибитора /пример 17/, три дегенеративных олигодеоксинуклеотида разрабатывают и синтезируют дл€ амплификации основной части кƒЌ  ингибитора. »х последовательности следующие/"1" обозначает дезоксиинозин, две буквы в скобках, разделенные штрихом, указывают положение, куда встраивают два различных дезоксинуклеотида, причем соответствующа€ аминокислотна€ последовательность указываетс€ трехбуквенным кодом под дезоксинуклеотидной последовательностью, последовательность, распознающа€ Sphl рестрикционную эндонуклеазу, подчеркнута/:



Ёти олигодеоксинуклеотиды соответствуют частично перекрывающимс€ част€м найденной в результате расщеплени€ по Ёдману аминокислотной последовательности. ќлигодеоксинуклеотид N 3 содержит олигодеоксинуклеотид N 1 в начале, а олигодеоксинуклеотид N 2 в конце.
ƒополнительный олигонуклеотид получают с последовательностью, полученной из линкер-праймера, использованного дл€ затравки синтеза первой нити кƒЌ  /см. часть 1/:
ќлигонуклеотид N 4

ѕосле синтеза на ƒЌ  синтезаторе Applied Biosystems PCR-MateTM 391 четыре деоксиолигонуклеотида очищают гель- фильтрацией на коммерчески доступных NaP-5 колонках /Pharmacia Biosystems/ и используют в качестве праймеров в трех отдельных полимеразных цепных реакци€х PCR, патент —Ўј 4800159/ как описано далее. –еагенты получают из коммерческого набора "Cepe-ApmTM DNA Amplification kit "c AmplitagTM рекомбинантной Tag ƒЌ  полимеразой от Perkin-Elmer Cetus /Norfalk, ст. —Ўј/, используют в соответствии с указани€ми изготовителей. 5% /2,5 мкл/ от полного количества первой нити кƒЌ , синтезированной из полной –Ќ  слюнных желез Friatoma /см. часть 1/, служит матрицей в каждой из трех реакций. ќлигодеоксинуклеотидные праймеры объедин€ют следующим образом: олигодеоксинуклеотид N 1 и N 4 в PCR реакции N 1, олигодеоксинуклеотиды N 2 и N 4 в PCR реакции N 2, олигодеоксинуклеотиды N 3 и N 4 в PCP реакции N 3. “ри PCR реакции инкубируют в Perkin-Elmer Cetus Thermal DNA Cycler, использу€ следующие программы реакций с 38 циклами, включающими стадии реакций N 1 - 3:
* начальна€ стади€: 3 мин при 94oC
* программа реакции:
* стади€ реакции N 1 : 1 мин 30 с при 94oC;
* стади€ реакции N 2 : 2 мин при 40oC;
* стади€ реакции N 3 : 3 мин при 72oC;
/ѕоследовательность стадии реакций N 1 - 3 повтор€ют 38 раз/
* ‘инальна€ стади€: 10 мин при 72oC
5% /5 мкл полного реакционного объема раздел€ют электрофорезом на 1,5% агарозном геле, использу€ в качестве стандарта размеров лестничную ƒЌ  из 123 пар оснований /Gibco-BPL Life Technоlogies, Jaithersburg, MD —Ўј/. ѕосле окрашивани€ гел€ этидиумбромидом, полосы однонитевой ƒЌ  наход€т в каждой из трех PCR реакций, причем их кажущиес€ размеры в соответствии со стандартной по размерам ƒЌ  составл€ют приблизительно 530 - 560 пар оснований /фиг. 11 слева направо; лестница из 123 пар оснований, PCR реакции N 1, 2 и 3/.
„асть 3. —убклонирование и секвенирование фрагментов кƒЌ  ингибитора.
ƒЌ -фрагмент, содержащийс€ в оставшемс€ объеме PCP реакции N 1 /см. часть 2/, выдел€ют после электрофореза на 1,5% агарозном геле и способе, включающем св€зывание и элюирование ƒЌ  из NA-45 ƒ≈ј≈ мембран /Schleicher and Schuell D-3354 Dassel √ермани€/ с последующей экстракцией н-бутанолом и осаждением этанолом /Sambrook, J.Fritsch, E.F., Maniatis, T." Molecular Cloning, гл. 6: 24-27, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989/.  онцы выделенных ƒЌ  фрагментов подготавливают дл€ лигировани€ к вектору двойным перевариванием рестрикционными энзимами Sph 1 и Xhol /Boehringer Mannheim GmbH. ƒ-6800 Mannheim √ермани€/, а затем дважды экстрагируют смесью фенол/хлороформ /1: 1/ и затем дважды хлороформом. 3 мкг дЌ  плазмидного вектора pGEMR-5 zf/ /Promega Madison, W 1, —Ўј/ линеаризируют за счет двойного переваривани€, использу€ рестрикционные энзимы Sphl и SalI/ Boehringer Mannheim GmbH/, и затем раздел€ют и выдел€ют из 1,5% агарозного гел€, как было указано ранее. ќбъедин€ют 50% расщепленного и экстрагированного амплифицированного ƒЌ  фрагмента и 20% переваренной и очищенной на геле векторной ƒЌ , осаждают этанолом и лигируют, использу€ реагенты и протокол коммерческого набора "DNA Ligation Kit /—тратагене  лонинг —истем/. ѕолную реакцию лигировани€ используют дл€ трансформации коммерчески доступных "Epicurian ColiR XLI-Blue Supercompetent Cells /—тратагене  лонинг —истемз/ в соответствии с инструкцией изготовителей. –еакцию полной трансформации ведут на B агаровых пластинах, содержащих ампициллин /100 мкг/мл/ 20 колоний клеток E. соli, устойчивых к ампицилину, наход€т после инкубировани€ и выращивают в LB бульоне, содержащем ампициллин /100 мкг/мл/, и их плазмидные ƒЌ  выдел€ют с помощью процедуры щелочного лисиса "минипреп" Sambrook Fritseb, E.F., Maniates T.: Molecular Cloning, Chapter I, 25-28, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989/.
ѕосле двойного переваривани€ плазмидной ƒЌ  из 20 клонов рестрикционными эндонуклеазами Sph I и Sac I /Boehringer Mannheim GmbH/ и электрофореза на 1,5% агарозном геле, оказываетс€, что 13 из них содержат ƒЌ  вставку размера приблизительно 580 bp /"позитивные клоны"/. ƒЌ  секвенирование производ€т на экстрагированных смесью фенол/хлороформ плазмидных ƒЌ  5 из этих положительных клонов, использу€ коммерческий набор "SeguenaseR Version 2,0 DNA Seguencing kit" /ёнайтед —тейт Ѕиокемикал  орпорейшн,  ливленд. ќгайо, —Ўј/ после примировани€ как T7, так и SP6 праймерами /Promega/. ѕолные последовательности вставок различных плазмид определ€ют следующим способом. ќтдельную считывающую рамку можно идентифицировать в каждой из п€ти последовательностей вставок. “ри типа последовательностей вставок найдены относительно аминокислотных последовательностей, полученных из открытой считывающей рамки, причем три из секвенированных плазмидных клонов принадлежат к типу N 1; по одному дл€ каждого из типов N 2 и 3 из полученных аминокислотных последовательностей. ѕолные последовательности ƒЌ  вставок из каждых представл€ющих три типа плазмид N 1 - 3 изображены на фиг. 12 вместе с аминокислотными последовательност€ми, транслированными из открытой считывающей рамки. ѕоследовательность первых 15 аминокислот, полученна€ из каждого типа плазмидных вставок, идентична последовательности определенной дл€ положени€ аминокислот 6-20 N-конца ингибитора, выделенного из слюны Triatoma /ѕример 17/.
ѕример 19. ѕоложение, выделение и клонирование гена, кодирующего ингибитор агрегации тромбоцитов
√еномную библиотеку, содержащую клонирование рестрикционные фрагменты из рестрикционных эндонуклеазных переваров T.pallidipennis ƒЌ , скринируют зондами на репликативных фильтрах в соответствии со стандартными способами.  лоны, которые гибридизуютс€ с зондами, отбирают. «атем ƒЌ  вставку из этих клонов субклонируют в соответствии со стандартными способами до тех пор, пока не выдел€ют минимального размера ƒЌ , которые св€зываютс€ с этими зондами.
Ёти фрагменты секвенируют, а затем перенос€т в подход€щий эукариотный вектор экспрессии, встраива€ кодирующий участок в вектор экспрессии за счет включени€ кодирующего участка в вектор экспрессии, содержащий все элементы, необходимые дл€ экспрессии, например, промотерную последовательность, терминаторную последовательность и источник репликации, причем все они операбельно св€заны с PAI геном /PAI = ингибитор агрегации тромбоцитов/, а также маркер селекции дл€ выделени€ полученного таким образом вектора экспрессии. ¬ектор экспрессии трансформируют затем в эукариотного хоз€ина, дл€ которого он сконструирован, и выдел€ют продукт EAI экспрессии.
ѕример 20. —еквенирование гена, кодирующего ингибитор агрегации тромбоцитов /PAI/
—еквенирование однонитевых и двунитевых ƒЌ  провод€т, использу€ способ терминации дидеоксинуклеотидных цепей по способу Sanger et al., Proс. Natl. Aсad. Sci. —Ўј /1977//, 74, 5463 - 5467.
—кринирование геномных библиотек и клонов мутантов на предмет новых последовательностей, родственных последовательности T. pallidipennis /ѕример 21/.  ак и ранее, зонды, полученные из аминокислотных последовательностей ингибитора, выделенного из T. pallidipennis, используют дл€ скринировани€ других геномных библиотек на предмет последовательностей, родственных с рассматриваемыми ингибиторами. јналогично, библиотеки мутантных ингибиторов, полученные в результате обычного мутагенеза векторов, содержащих ген дл€ T. pallidipennis ингибитора, полученных описанным ранее способом. NNMG и сайт-направленным мутагенезом скринируют по их активности.
ѕример 22. ¬ыделение, характеризаци€ и секвенирование полных кƒЌ  клонов дл€ двух протеинов изобретени€, как изоформ.
a/ ќбщий подход.
Ѕиблиотеку кƒЌ , полученную из полиј/+/–Ќ , экстрагированных из T.pallidipennis скринируют двум€ зондами примера 18 на репликативном фильтре стандартными способами. ѕоложительные клоны очищают раздельным культивированием и повтором гибридизации бл€шек на фильтре. кƒЌ  самых длинных кƒЌ  клонов секвенируют дидеоксинуклеотидным способом —ангера.
b/ ѕодробное описание анализов.
„асть 1.  онструирование библиотеки кƒЌ  из –Ќ  слюнных желез Triatoma pallidipennis.
ѕримерно 500 мкг полных –Ќ , выделенных из слюнных желез Triatoma pallidipennis? как указано ранее /ѕример 18, часть 1/, используют дл€ выделени€ полиј+м–Ќ  с помощью двойной афинной хроматографии на олиго/d T/-целлюлозе/. ƒл€ этой цели используют набор "mRNA Purification Ket"/Pharmacia Biosystems. GmbH, W - 7800 ‘райбург, √ермани€ /дл€ двух последовательных циклов обогащени€, как указано в инструкции изготовлени€. ќкончательный выход после второй стадии очистки составл€ет 13 мкг полиј+м–Ќ . 5 мкг этого препарата используют дл€ конструировани€ кƒЌ  библиотеки в "Lambda ZAP® II" векторе бактериофага с реагентами и процедурами коммерческого набора "ZAP-cDNATM - Gigapack® II Gold Cloning Kit" /—тратагене  лонинг —истемз/. 33% окончательного выхода первой фракции кƒЌ  после фракционировани€ по размерам лигируют 2 мкг векторной ƒЌ  бактериофага. ѕосле упаковки полной реакции лигировани€ в 7 отдельных аликвот получают неамплифицированную кƒЌ  библиотеку с 20·106 независимыми рекомбинантными фагами.
„асть 2. ¬ыделение клонов кƒЌ  ингибитора из кƒЌ  библиотеки слюнных желез Triatoma pallidipennis.
¬сего 5·105 рекомбинантных фагов из кƒЌ  библиотеки, описанной ранее /1/, скринируют с помощью ƒЌ -ƒЌ  гибридизации двойных бл€шек на найлоновых мембранах Biogene® A /Pall Biosupport, East Hills, NY, —Ўј/. √ибридизацию ведут в растворе, содержащем 5хSSC, 5 x раствор Denhardt, 0,2% SDS и 100 мкг/мл ƒЌ  спермы лосос€ денатурированной, экстрагированной фенолом и обработанной ультразвуком /—игма  емикал  омпани, —ан Ћуи, ћќ, —Ўј/ с радиомеченными ƒЌ  зондами, полученными как указано ранее. ¬ставки ƒЌ  плазмидного клона типа N 1 из примера 18 выдел€ют после двойного переваривани€, использу€ рестрикционные эндонуклеазы SphI и SacI, как указано ранее. ѕриблизительно 25 нг выделенных вставок ƒЌ  радиомет€т, использу€ набор "Prime-ITTM Random Primer Labeling Kit" /—тратагене  лонинг —истемз/ в присутствии /α32 P/ d CTP /3000  юри/ммоль; Amersham Buchler, W-3300 √ермани€/. ћеченый фрагмент ƒЌ  выдел€ют из остального радиоактивного вещества хроматографически на колонке N APTM-5'' /‘армациа Ѕиосистемз/. “емпература на фильтре гибридизации и у промывок 50oC, последн€€ стади€ промывки проходит в 2·SSC 0,2% SDS. ѕосле авторадиографии при -70oC в течение 48 ч обнаруживают более 300 бл€шек, которые дают сигналы на обоих фильтрах. Ѕактериофаги с 80 участков вокруг таких положительных сигналов элюируют с исходно-перекрывающихс€ пластин и повторно культивируют отдельно при плотности, котора€ позвол€ет осуществить очистку отдельных фаговых клонов. ѕроцедуру гибридизации бл€шек, описанную ранее, повтор€ют, использу€ тот же зонд ƒЌ , и с пластин выдел€ют 76 независимых фаговых клонов, дающих положительные сигналы.
„асть 3. ’арактеризаци€ и секвенирование клонов кƒЌ  ингибитора
‘аговые клоны отдельно подвергают ин виво иссеканию по способу, описанному в протоколе набора дл€ конструировани€ кƒЌ  библиотеки —тратагене, описанной ранее. "ћинипреп" плазмидную ƒЌ  из 76 различных плазмидных клонов pAluescript SR, выделенную после ин виво иссечени€, расщепл€ют в двойном переваривании рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и XboI (Bochringer Maunheim), разделенными на 1,5% агарозном геле и окрашивают этидиумбромидом. Ќесколько вставок различных размеров вплоть до около 620 пар оснований получают в результате. ƒЌ  секвенирование “3 и “7 праймерами /—тратагене  лонинг —истемз/ провод€т как описано ранее на плазмидных ƒЌ  из 8 клонов, которые, как обнаружено, содержат самые большие ƒЌ  вставки из всех 76 исследованных независимых клонов. “аким образом были обнаружены кƒЌ  клоны, которые принадлежат к 2 классам в соответствии с аминокислотной последовательностью, транслированной из открытой считывающей рамки, причем один класс соответствует точно типу N 1 плазмидной вставки/ клонов, именуемых "ингибитор-1", описанных в примере 18/3/, и другой класс к типу N 2 плазмидных вставок /2 клона, именуемые "ингибитор-2"/. ƒалее эксперименты по ƒЌ  секвенированию провод€т дл€ подтверждени€ установленных к этому моменту последовательностей, использу€ дополнительные олигодеоксинуклеотидные основани€ известных последовательностей:
ќлигонуклеотид N 5:
5'-TATCACTCTGAACTCAAAGTG-3'.
ќлигонуклеотид N 6:
5'-TTACCGCCGTTTCCATTTGG-3'.
ќлигонуклеотид N 7;
5'-TTACTTCAAAGTTGCACC-3';
ќлигонуклеотид N 8:
5'-GCAACATGAAGGTGATCATTGCAGCAAC-3',
5'-концы большинства из самых длинных независимых клонов, как было обнаружено, были идентичны, причем 5'-нетранслированный участок из 5 пар оснований, дают возможность предположить, что кƒЌ  полных м–Ќ  транскриптов, включающих участки инициировани€ транскрипции, были клонированы. ѕолные ƒЌ  и полученные аминокислотные последовательности кƒЌ  клонов дл€ ингибитора 1- и инигибитора-2- изображены на фиг. 13. —айт расщеплени€ между сигнальным пептидом и зрелым протеином, полученный из N-терминальной аминокислотной последовательности, описан в примере 17.
ѕример 23. Ёкспресси€ и секретирование рекомбинантного ингибитора в стабильно трансфектированные клетки почек детеныша хом€ка /¬Ќ /.
a/ ќбщий подход.
«атем кодирующую последовательность из кƒЌ  клонов перенос€т в стабильный эукариотный вектор экспрессии, включа€ кодирующий участок в вектор экспрессии, содержащий все элементы, необходимые дл€ экспрессии, например, промоторную последовательность, терминаторную последовательность и источник репликации, причем все они операбельно св€заны с PAI геном, а также с маркером селекции дл€ выделени€ получаемого таким образом вектора экспрессии. «атем вектор экспрессии трансформируют в эукариотного хоз€ина, дл€ которого он сконструирован, а PAI продукт экспрессии выдел€ют.
b/  онкретное описание анализов.
„асть 1.  онструирование плазмид экспрессии дл€ ингибитора, использу€ pMPS V/CMV вектор.
ƒва олигодеоксинуклеотида синтезированы дл€ PCR амплификации кодирующих ингибитор последовательностей как из ингибитора-1, так и ингибитора-2 плазмидных кƒЌ  клонов. ќдин из них /N 9/ создают из кодирующей нити участка вокруг ATG кодона инициировани€, удлиненного 5'-концом, включа€ Hind III распознающую последовательность и оптимизированный "Kozak Site" /x/ Kozak, M: “очечные мутации определ€ют последовательность, ограничивающую AG кодон инициировани€, который модулирует трансл€цию эукариотными рибосомами. Cell. 44, 283-292, 1986/, тогда как другой /N 10/ получают из некодирующей нити участка вокруг TAA кодона терминации открытых считывающих рамок, удлиненных 5'-хвостом, включа€ Hind III - распознающую последовательность /распознающие последовательности рестрикционной эндонуклеазы Hind III подчеркнуты, оптимизованный "Kozak Site" или эффективной инициации трансл€ции указан звездочками, участки последовательностей, совместимые с одной или другой нитью исходных последовательностей кƒЌ  клонов, отмечены курсивом/


»спользу€ примерно 3 мкг каждой кƒЌ  клонированной плазмиды в качестве матрицы, провод€т две отдельные PCR амплификации в присутствии двух олигонуклеотидных праймеров N 9 и 10, как указано ранее /пример 18 часть 2/, однако с 18 вместо 38 циклами, включа€ N 1 - 3. јмплифицированные кодирующие последовательности ингибитора-1 и ингибитора-2, которые содержат оптимизированный сайт Kozак, но не содержат полного сигнала полиаденилировани€ /'... . AATAAA... -3'/, наход€щегос€ сразу после 3'-терминационного кодона, исходных кƒЌ  клонов, а затем выдел€ют и делают пригодным дл€ лигировани€ за счет переваривани€ рестрикционной эндонуклеазой Hind III/ Boehringer Mannheim/ и последующих стадий экстракции, как указано ранее /пример 18, часть 3/. 3 мкг плазмидной ƒЌ  вектора pMP SV/CMV - HE/ With, M., Schumacher. L., Hauser, H.:  онструирование новых векторов экспрессии дл€ клеток млекопитающих, использу€ немедленный ранний энхансер цитомегаловируса человека дл€ повышени€ экспрессии из гетерологических энхансеров/ промотеров. B Conradt, H./ Eo/ Protein Glycosylation: Cellular, Biotechnical and Analytical Aspects, t. 15, 49-52, VCH publishers Weinhein 1991; Kratzschmar, J., Haendler, B., Bringmann, P. , Dinter, H., Hess, H., Donner, P., Schleuning W-D.: —екреци€ с высоким уровнем четырех плазминогенных активаторов из обыкновенных вампиров Desmodus rotundus стабильно трансфектированными клетками почек детенышей хом€ков, Gene /1992/ 116, 281-284 линеаризуют за счет переваривани€ рестрикционной эндонуклеазой Hind III и выдел€ют описанным ранее способом. ¬ыделенные плазмидные ƒЌ  дефосфолируют, использу€ 1 единицу щелочной фосфатазы кишечника теленка/ Boehringer Mannheim/, экстрагиру€, а затем использу€ дл€ субклонировани€ кодирующих ингибитор фрагментов PCR по способу примера 18, часть 3.
ƒЌ  полученной pMPSV/CM - ингибитор -1 или -2 конструкции, содержащей Hind III вставки, переваривают рестрикционной эндонуклеазой EcoR1/Boehringer Mannheim/ и примерно в половине случаев, EoRI рестрикционный фрагмент около 580 пар оснований обнаруживают, что указывает на то, что в этих конструкци€х кодирующа€ ингибитор вставка находитс€ в правильной ориентации по отношению к промотору вируса ћиелопролиферативной саркомы вектора pMPSV/CMV. ѕолные кодирующие ингибиторы вставки таких pMPSV/CMV - ингибитор - и -2 конструкций затем секвенируют, использу€ олигодеоксинуклеотиды N 5 - 8, и два дополнительных праймера /олигодеоксинуклеотиды N 12 и 11/, получают из расположенных по кра€м вставки участков вектора экспрессии дл€ контрол€ за мутаци€ми, которые могли произойти во врем€ PCR амплификации:
ќлигонуклеотид N 11:
5'-ACCAGAAAGTTAACTGG-3',
ќлигонуклеотид N 12:
5'-CCTAGTTTGTGGTTGTCC-3'.
“аким образом получают две конструкции дл€ экспрессии ингибитора-1- и ингибитора-2- в клетки млекопитающих, кодирующие протеины, идентичные по своей аминокислотной последовательности протеинам, изображенным на фиг. 13. —хематическа€ карта конструкции приведена на фиг. 14/ "јмр": устойчивый к ампициллину маркер; "MPSV" промотер": промотер вируса миелопролиферативной саркомы, "SY" : SV40 интрон, включающий границу сплайсинга, "peby A region" : SV 40 участок полиаденилировани€, "CMV enhancer": энхансер цитомегаловируса, "ori" : pBR 322 источник репликации/.
„асть 2. “рансфекци€ и селекци€ BHK клеток.
ѕлазмидные ƒЌ  двух pMPSV/CMV - ингибитор-1 и -2 конструкций выдел€ют, использу€ колонки "Qiagen=lip 100"/ Qiagen Inc. Chatworth,  алифорни€, —Ўј/ јналогично, две плазмиды, которые содержит маркерные гены устойчивости, один дл€ гидромицин B киназы /pSR/ HMR272, сконструированный за счет субклонировани€ BamHI-Hind III фрагмента, содержащего HSVtk промотер, св€занный с геном гигромицин B киназы в Bluescript Sk, причем фрагмент этот вз€т из pPMP272 вектора, описанного: Bernard, H. U., Krammer. J., Rowekamp. W.G.  онструирование гена сли€ни€, который придает устойчивость против гигромицина B клеткам млекопитающих в культуре, Experimental Cell Research, 158, 237-243, 1985/, а другой дл€ пуромицин- N-ацетилтрансферазы/ pSV pacјp; DeLaLuna, S., Soria. J., Pulido, D., Ortin. J., Jimenez. A.: Ёффективна€ трансформаци€ клеток млекопитающих конструкци€ми, которые содержат маркер устойчивости к пуромицину, Gene 62, 121-126, 1988/, получают в результате. ѕриблизительно 20 мкг конструкции экспрессии ингибитора-1- или -2,6 мкг пуромицин-устойчивой плазмиды и 2 мкг гигромицин-устойчивой плазмиды используют дл€ трансфекции клеток почки детеныша хом€ка /BHK/ как описано у Kratzsсhmar. J. , Haеndler, B. , Bringmann,P., Dinter, H., Hess, H., Douner. P., Schleuning, W. -D. 1992. ¬ысокоэффективное секретирование четырех слюнных плазминогенных активаторов из вампиров Desmodus rotundus за счет стабильно-трансфектированных клеток почки детеныша хом€ка /Gene, 116 - 281-284/, использу€ "Lipofectin TM Reagent" /Gibco-BRL Life Technologies/. ѕроцедуру двойной селекции используют, использу€ DMEM /10% FCS/Gibco BRL Life Technologies/, содержащей 0,7 мг/мл гигромицина B/ Calbiochem Corporation, La Golla  алифорни€, —Ўј/ и 5 мкг/мл пуромицина /—игма  емикал  омпани/. —месь клеток BHK, обладающих двойной устойчивостью трансфектированных pMPSV/CMV - ингибитор-1 или -2, полученных после двух недель селекции, выращивают в несодержащей сыворотке OPTI-MEM /Gibco-BRL Life Technologies /как описано Kratschmar, J. , Haendler, B. , Bringmann, P., Dinter, H, Hess, H., Douner, P., Schleuning W-D. : ¬ысокоэффективное секретирование четырех слюнных плазминногенных активаторов из вампиров Desmodus rotundus за счет стабильно трансфектированных клеток почек детеныша хом€ка. Gene /1992/ 116, 281-284/.  ондиционную среду собирают спуст€ 24 ч, освобождают от клеточного дебриса центрифугированием при 2000 g и хран€т в замороженном виде.
„асть 3. ќпределение рекомбинантного ингибитора в надосадочных жидкост€х культуры клеток BHK.
јликвоты кондиционной среды тестируют по продуцированию ингибитора в ¬естерн-блоттинге /см. пример 24/. јнтиингибиторна€ антисыворотка реагирует специфически с 19 кƒј протеином, присутствующим в кондиционной среде из pMPSV/CMV- ингибитор-1 трансфектированных BHK клеток из pMPSV/CMV - ингибитор-2- трансфектированных BHK клеток. Ќе наблюдаетс€ реакци€ с контрольной средой из клеток, трансфектированных pMPSV/CMV конструкцией, содержащей ингибиторную вставку, или со свежей контрольной средой /см. фиг. 15/. Ёкстракты трансфектированных клеток дают лишь слабый сигнал, указывающий на то, что рекомбинатные протеины секретируютс€ в среду. ѕомимо иммунологического детектировани€ двух рекомбинантных ингибиторных форм, надосадочные жидкости трансфектированных BHK клеток также можно тестировать в функциональном анализе. »нгибирование индуцируемых коллагеном агрегации тромбоцитов можно измер€ть в агрегационном анализе по способу примера 1.
ѕример 24. ѕолучение антител.
ќколо 100 мкг ингибитора, очищенного по способам примеров 2 и 15, добавл€ют к 0,5 мл полного адъюванта фреунда, и полученную эмульсию ввод€т подкожно кролику. —пуст€ 2 недели ввод€т вторую инъекцию около 80 мкг очищенного ингибитора и 0,5 мл неполного адъюванта ‘рейнда. ѕосле инъекции отбирают несколько образцов сыворотки дл€ проверки продуцировани€ антител. »х анализируют ¬естерн-блоттингом. 20 нг очищенного ингибитора нанос€т на 12,5% SDS акриламидный гель, и провод€т электрофорез, блоттинг и детектирование стандартными способами, описанными Harlowe, D., Lane /1988/ јнтитела: лабораторное руководство, Cold Spring Harbour Laboratory /разбавление тестовой сыворотки 1: 500, козлина€ анти-кролик пероксидазный конъюгированный IgG в качестве второго антитела, детектирование ECL-набором от Amersham International, Amersham ¬еликобр. Ѕлоттинг показывает, что антисыворотка специфически реагирует с очищенным ингибитором.
‘ормула изобретени€: 1. ѕротеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, выделенный из слюны Triatoma pallidipennis, имеющий следующую N-концевую аминокислотную последовательность: Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Ile.
2. –екомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, негликозилирован, со следующей аминокислотной последовательностью:
где X - Pro или Gln;
Y - Gly, Z - Gly или Val.
3. ѕротеин по п.2, отличающийс€ тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой X - Pro, Y - Gly, Z - Gly.
4. ѕротеин по п.2, отличающийс€ тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 53 отсутствует, X - Pro, Y - Gly, Z - Val.
5. ѕротеин по п.2, отличающийс€ тем, что имеет аминокислотную последовательность, в которой X - Gln, Y - Gly, Z - Gly.
6. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, со следующей нуклеотидной последовательностью:
где X-CCG или CAG;
Y - GGT или GTT;
Z - ACA или ACG;
R - TCG или TCA.
7. ‘рагмент ƒЌ  по п.6, отличающийс€ тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой X - CCG, Y - GGT, Z - ACA, R - TCG.
8. ‘рагмент ƒЌ  по п.6, отличающийс€ тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой нуклеотиды в положении 148, 149, 150 отсутствуют, X - CCG, Y - GTT, Z - ACA, R - TCG.
9. ‘рагмент ƒЌ  по п.6, отличающийс€ тем, что имеет нуклеотидную последовательность, в которой X - CAG, Y - GGT, Z - ACG, R - TCA.
10. ¬ектор экспрессии pMPSV/CMV - ингибитор-I (DSM 7223), содержащий фрагмент ƒЌ  по п.7, область полиаденилировани€ (poly A), ген устойчивости к ампициллину, энхансер CMV, промотор mPSV, сайт сплайсинга (SJ), ori pBR 322.
11. ¬ектор экспрессии pMPSV/CMV - ингибитор-II, содержащий фрагмент ƒЌ  по п. 8, область полиаденилировани€ (poly A), ген устойчивости к ампициллину, энхансер CMV, промотор mPSV, сайт сплайсинга (SJ), ori pBR 322.
12. Ўтамм культивируемых животных клеток ¬Ќ  (pMPSV) CMV DSM 7223/ - ингибитор - I - продуцент рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих.
13. Ўтамм культивируемых животных клеток ¬Ќ  (pMPSV) CMV - ингибитор - II - продуцент рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих.
14. —пособ получени€ рекомбинантного протеина, ингибирующего вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, предусматривающий культивирование штамма-продуцента, выделение и очистку целевого продукта, отличающийс€ тем, что в качестве продуцента используют штамм по п. 12 или 13, а очистку осуществл€ют гельфильтрацией на "Superose 12" и в системе электрофорез-хроматографи€.
15. ‘армацевтическа€ композици€, ингибирующа€ индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, содержаща€ активное вещество и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающа€с€ тем, что в качестве активного вещества содержит полипептид по любому из пп.1 - 5 в эффективном количестве.