Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќ¬≈–’Ќќ—“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ ћ≈–ќ«ќ»“ќ¬, »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ (¬ј–»јЌ“џ) » —ѕќ—ќЅ ≈√ќ ѕќЋ”„≈Ќ»я, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  » —ѕќ—ќЅ ≈≈ ѕќЋ”„≈Ќ»я, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ¬»–”—ј ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ» –ќќ–√јЌ»«ћј, ¬ј ÷»Ќј ѕ–ќ“»¬  ќ ÷»ƒ»ќ«ј ѕ“»÷џ - ѕатент –‘ 2130072
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќ¬≈–’Ќќ—“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ ћ≈–ќ«ќ»“ќ¬, »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ (¬ј–»јЌ“џ) » —ѕќ—ќЅ ≈√ќ ѕќЋ”„≈Ќ»я, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  » —ѕќ—ќЅ ≈≈ ѕќЋ”„≈Ќ»я, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ¬»–”—ј ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ» –ќќ–√јЌ»«ћј, ¬ј ÷»Ќј ѕ–ќ“»¬  ќ ÷»ƒ»ќ«ј ѕ“»÷џ
‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќ¬≈–’Ќќ—“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ ћ≈–ќ«ќ»“ќ¬, »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ (¬ј–»јЌ“џ) » —ѕќ—ќЅ ≈√ќ ѕќЋ”„≈Ќ»я, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  » —ѕќ—ќЅ ≈≈ ѕќЋ”„≈Ќ»я, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ¬»–”—ј ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ» –ќќ–√јЌ»«ћј, ¬ј ÷»Ќј ѕ–ќ“»¬  ќ ÷»ƒ»ќ«ј ѕ“»÷џ

‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ ,  ќƒ»–”ёў»… »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќ¬≈–’Ќќ—“Ќџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ ћ≈–ќ«ќ»“ќ¬, »ћћ”Ќќ√≈ЌЌџ… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ (¬ј–»јЌ“џ) » —ѕќ—ќЅ ≈√ќ ѕќЋ”„≈Ќ»я, –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  » —ѕќ—ќЅ ≈≈ ѕќЋ”„≈Ќ»я, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я –≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќќ√ќ ¬»–”—ј ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ» –ќќ–√јЌ»«ћј, ¬ј ÷»Ќј ѕ–ќ“»¬  ќ ÷»ƒ»ќ«ј ѕ“»÷џ

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано дл€ защиты живых организмов от кокцидиоза. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы 33 кƒа. ѕри экспрессии этого фрагмента в клетках микроорганизмов образуетс€ указанный иммуногенный полипептид. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий полипептид, встраивают в подход€щий вектор. ¬ектором трансформируют клетки микроорганизмов. ¬ыдел€ют целевую рекомбинантную ƒЌ  из клеток, в которых произошла экспресси€ полипептида. ÷елевой полипептид выдел€ют из культурной среды. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий данный полипептид, клонируют в подход€щем векторе. ¬страивают в плазмиду дл€ рекомбинации, содержащую ген “  вируса вакцины. “рансформируют культивируемые клетки полученной плазмидой рекомбинации температурочувствительным вирусом вакцины и вирусом вакцины дикого типа. ¬ыращивают трансформированные клетки при повышенной температуре. ¬ыдел€ют “ -негативный вирус вакцины. «аражают им культивируемые клетки. ќтбирают целевой рекомбинантный вирус вакцины по наличию гена мерозоитов. ¬акцина содержит рекомбинантный вирус вакцины, содержащий фрагмент ƒЌ  или иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов и физиологически приемлемый носитель. »зобретение позвол€ет получить важные вакцинные антигены, которые играют существенную роль в защите домашней птицы от кокцидиоза. 9 с.п. ф-лы, 1 табл. 15 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2130072
 ласс(ы) патента: C12N15/30, C07K14/455, A61K39/012
Ќомер за€вки: 5052667/13
ƒата подачи за€вки: 08.07.1992
ƒата публикации: 10.05.1999
«а€витель(и): ‘.’оффманн-Ћ€ –ош ј√ (CH)
јвтор(ы): ћэри-’елен Ѕингер (US); Ћуис ѕазамонтес (CH)
ѕатентообладатель(и): ‘.’оффманн-Ћ€ –ош ј√ (CH)
ќписание изобретени€: «а€вленное техническое решение относитс€ к новому антигену паразитических простейших рода Eimeria. Ётот антиген может быть различным образом использован дл€ защиты домашней птицы от кокцидиоза.
 окцидиоз - это заболевание домашней птицы, которое вызываетс€ паразитическими простейшими рода Eimeria. ќно встречаетс€ в больших хоз€йствах, интенсивно занимающихс€ разведением домашней птицы. ≈жегодно дл€ химиотерапии заболевани€ только в одних —Ўј используетс€ более 100 млн.долл. –азвитие устойчивости к известным антикокцидиальным препаратам требует посто€нной разработки новых лекарств, в то врем€ как стоимость этих работ становитс€ очень дорогой и, кроме того, возникает необходимость в уменьшении содержани€ остатков лекарственных препаратов в животной пище.
ѕротективный иммунитет к естественной кокцидиальной инфекции хорошо изучен. ѕоказано, что контролируемое ежедневное введение в течение нескольких недель небольшого количества жизнеспособных ооцист вызывает развитие полного иммунитета к инфекции, вызванной нормальной вирулентной дозой возбудител€ /Rose et al., Parasitology 73 : 25, 1976; Rose et al., Parasitology 88 : 199, 1984/. —оздание приобретенной устойчивости к инфекции делает возможным разработку вакцины дл€ развити€ иммунитета у молодых цыпл€т, при этом отпадает необходимость в химических кокцидиостатиках. ƒействительно этот подход был применен фирмой Sterwin Labaratories, Opelika, AL, разработавшей препарат  окцивакTM.
»ме€ в виду создание вакцины против кокцидиоза, Murray et al., за€вка на ≈вропейский ѕатент N 167443, приготовили экстракты из спорозоитов или спорулированных ооцист Eimeria tenella, которые содержали по крайней мере 15 полипептидов, многие из которых были ассоциированы с поверхностными белками спорозоитов. »нъекци€ этих экстрактов цыпл€там уменьшала повреждени€ слепой кишки при последующем оральном введении вирулентных спорулированных ооцист E.tenella.
¬след за этим Schenkel et al., ѕатент —Ўј N 4650676, получили моноклональные антитела к мерозоитам E.tenella. — помощью этих антител Schenkel et al. идентифицировали определенное количество антигенов, к которым были направлены эти антитела. ѕредварительна€ инкубаци€ спорозоитов E.tenella с полученными антителами при дальнейшем введении таких спорозоитов в слепую кишку цыпл€т уменьшала количество повреждений по сравнению с контролем, когда дл€ инъекции использовались необработанные спорозоиты.
— помощью технологии рекомбинантных ƒЌ  Newman et al. /«а€вка на ≈вропейский ѕатент N 164176/ клонировали ген, кодирующий антиген мол. массы 25 кƒа, который обнаруживаетс€ у спорозоитов E.tenella. —ыворотка цыпл€т, неоднократно иммунизированных убитыми спорозоитами E.tenella, преципитировали этот антиген в мембранных препаратах спорозоитов и иодированных препаратах спороцист. «атем Jenkins /Nucleic Acids Res, 16 : 9863, 1988/ описал кƒЌ , кодирующую участок поверхностного белка /мол. масса 250 кƒа/ мерозоитов Eimeria acervulina. Ёкспрессию продукта, кодируемого этой кƒЌ , определ€ли с помощью антисыворотки и E.acervulina.
—овершенствование технологии рекомбинантных ƒЌ  позволило разработать другой подход к проблеме, а именно создание субъединичной вакцины. ѕримеры таких вакцин приведены в за€вках на ≈вропейский патент N 324648, 337589 и 344808.
Ќасто€щее изобретение относитс€ к иммуногенным полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO:1) (см в конце описани€). и которые могут быть использованы дл€ генерации иммунного ответа на антигены Eimeria, например у цыпл€т. ќписываемый здесь белок - предшественник поверхностного антигена мерозоитов Eimeria имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности (1) (SEQ ID NO : 1).
ѕредпочтительным полипептидом согласно насто€щему изобретению €вл€етс€ иммуногенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO : 1), но утративший на N-конце аминокислотную последовательность, соответствующую сигнальному пептиду. »зобретение, кроме того, охватывает функционально эквивалентный полипептид аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 1, в которой определенные аминокислотные участки заменены на другие, делетированы или вставлены, причем без существенного изменени€ иммуногенных свойств первоначального пептида.
ƒалее, данное изобретение охватывает ƒЌ , кодирующую целиком или часть белка - предшественника поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, например ƒЌ  нуклеотидной последовательности (A) (SEQ ID NO : 2) (см. в конце описани€) или ƒЌ , соответствующую част€м этой нуклеотидной последовательности, например ƒЌ  нуклеотидной последовательности (B). ѕоследовательность B аналогична (A) (SEQ ID NO : 2), но не имеет нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид.  одон ATG предпочтительно добавл€етс€ к началу молекулы ƒЌ , вход€щей в состав более крупной молекулы, имеющей аминокислотную последовательность (A) (DEQ ID NO : 2). Ёту операцию осуществл€ют хорошо известными методами.  роме того, данное изобретение включает рекомбинантные векторы, содержащие указанные ƒЌ  и обеспечивающие их экспрессию в совместимых организмах - хоз€евах, и микроорганизмы, несущие такие векторы.
ƒалее, изобретение относитс€ к способу получени€ указанных выше полипептидов, который предусматривает:
а/ культивирование микроорганизма, содержащего рекомбинантный вектор, несущий ƒЌ  нуклеотидной последовательности, котора€ кодирует указанный полипептид, например ƒЌ  нуклеотидной последовательности (A) (SEQ ID NO : 2) или ее фрагмент, например нуклеотидную последовательность (B), в услови€х, обеспечивающих экспрессию этой ƒЌ  или ее фрагмента и
б/ выделение рекомбинантного полипептида из культуры.
 роме того, изобретение охватывает вакцину дл€ защиты от кокцидиоза /например, человека или животных/, содержащую эффективное количество одного или более полипептидов, описанных выше, и физиологически подход€щий носитель. ѕредпочтительно вакцина используетс€ дл€ защиты домашней птицы /например, цыпл€т и индюшат/. ¬ других случа€х это могут быть домашние животные, такие как кролики или овцы.
»зобретение включает и вакцины дл€ защиты против кокцидиоза, которые содержат рекомбинантный вирус. ¬ состав вируса входит последовательность ƒЌ , кодирующа€ указанный выше полипептид, и вирус способен обеспечить экспрессию этой последовательности.  роме того, в состав вакцины входит подход€щий физиологический носитель.
ƒалее, изобретение относитс€ к способу защиты от кокцидиоза, заключающемус€ в том, что эффективным количеством вакцины иммунизируют соответствующий организм, который чувствителен к кокцидиозу, например цыпл€т.
ѕолипептиды Eimeria, которые €вл€ютс€ предметом насто€щего изобретени€, - это важные вакцинные антигены, поскольку они идентифицированы с помощью антител, содержащихс€ в сыворотке животных, иммунизированных против кокцидиоза и вследствие этого ставших иммунными. ѕоэтому, наиболее веро€тно, что данные полипептиды сыграют существенную роль в защите домашней птицы от кокцидиоза.
»зобретение может быть пон€то более быстро с помощью рисунков, которые описаны ниже.
Ќа фиг. 1 показана нуклеотидна€ последовательность молекулы к ƒЌ  /1,2 кв/, котора€ кодирует белок - предшественник Eimeria распознаваемый с помощью специфических антител из иммунной сыворотки кроликов или цыпл€т.  ак видно из фиг. 1, нуклеотидна€ последовательность указанного белка начинаетс€ с кодона ATG /A соответствует 68 нуклеотиду/ и заканчиваетс€ стоп - кодоном TAA /T соответствует 1013 нуклеотиду/, кодиру€ 315 аминокислот.  роме того, на фиг. 1 показана аминокислотна€ последовательность белка - предшественника Eimeria, котора€ была предсказана на основе данной нуклеотидной последовательности. ƒл€ обозначени€ нуклеотидов и аминокислот используютс€ стандартные буквенные коды, которые можно расшифровать с помощью обычного биохимического учебника; например см. Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Punlishers, Inc., New York, pp. 96, 798.
Ќа фиг. 2 приведены результаты электрофоретического разделени€ различных белков мерозоитов Eimeria в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натри€ /SDS/. Ќа фиг. 2A показаны результаты иммуноблоттинга, т.е. взаимодействи€ препарата тотальных белков мерозоитов с контролем /а/ или специфическими антителами /б/. —трелкой отмечена полоса, содержаща€ белок мол. массы около 23 кƒа. ‘иг. 2 B - это авторадиограмма, показывающа€ иммунопреципитацию поверхностных белков мерозоитов, меченных 125J, с контролем /a/ и специфическими антителами /b/. Ќа фиг. 2 C показано разделение полной смеси белков, образовавшихс€ в результате трансл€ции in vitro poly /A/ –Ќ  мерозоитов /c/, а также: результаты иммунопреципитации этих продуктов с антителами, отобранными с помощью клона 5-7 фага л€мбда /b/; антителами, выделенными с помощью другого фагового клона, который продуцирует белки, взаимодействие с сывороткой к мерозоитам /a/; и с контрольными антителами, выделенными из сыворотки к мерозоитам с помощью нерекомбинантных фагов /d/. ѕолосы про€вл€ли путем флуорографии. ѕоложение маркеров мол. массы, /котора€ выражена в килодальтонах, кƒа/, отмечено на рисунках справа.
Ќа фиг. 3 показаны результаты —аузерн - блоттинга геномной ƒЌ  спорулированных ооцист Eimeria tenella, котора€ была расщеплена рестриктазами Pvu II /лини€ 1/, Hinc II /лини€ 2/, Pst I /лини€ 3/, Sph I /лини€ 4/ или Sac I /лини€ 5/, с EcoR I - ‘рагментом клона 5-7 в качестве пробы. ѕоложени€ стандартных ƒЌ , имеющих известные размеры в кв. показаны справа.
Ќа фиг. 4 приведено схематическое изображение плазмиды pDS56/RBSII /без указани€ масштаба/. «десь и далее на фиг. 6, 8 и 10 символы B, E, H, P, D, X, и Xb обозначают сайты расщеплени€ дл€ рестриктаз BamH I, EcoR I, Hid III, Pst I, Sal I, Xho I и Xba I соответственно. обозначает регулируемый элемент промотор/опиратор N 250PS N 250P29; обозначает сайты св€зывани€ рибосом RBS II, RBSI (-1) или RBS II (-2); __→ обозначает кодирующие участки, наход€щиес€ под контролем этих сайтов св€зывани€ рибосом; обозначает терминаторы to или T1, как показано; обозначен участок, необходимый дл€ репликации плазмиды в E. coli /repl/; обозначены кодирующие области дл€ хлорамфениколацетилтрансферазы /cat/ и β- лактамазы /bla/.
Ќа фиг. 5 приведена полна€ нуклеотидна€ последовательность плазмиды pDS56/RBSII. Ќа этой последовательности отмечены сайты расщеплени€, распознаваемые соответствующими рестриктазами, перечисленными в описании к фиг. 4. јминокислотна€ последовательность представл€ет собой открытую рамку считывани€, наход€щуюс€ под контролем сайта св€зывани€ рибосом RBSII.
Ќа фиг. 6 схематически изображена плазмида pDS56/RBSII (-1) (без указани€ масштаба).
Ќа фиг. 7 приведена полна€ нуклеотидна€ последовательность плазмиды pDS56/RBSII (-1). Ќа этой последовательности отмечены сайты расщеплени€, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 6. јминокислотна€ последовательность представл€ет собой открытую рамку считывани€, наход€щуюс€ под контролем сайта св€зывани€ рибосом RBSII (-1).
Ќа фиг. 8 схематически изображена плазмида pDS56/RBSII (-2) /без указани€ масштаба/.
Ќа фиг. 9 приведена полна€ нуклеотидна€ последовательность плазмида pDS56/RBSII (-2). Ќа последовательности отмечены сайты расщеплени€, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 8. јминокислотна€ последовательность представл€ет с обой открытую рамку считывани€, наход€щуюс€ под контролем сайта св€зывани€ рибосом RBSII (-2).
Ќа фиг. 10 схематически изображена плазмида pDMI /без указани€ масштаба/. —имволы и обозначени€ точно такие же, как на фиг. 4, только обозначает области, кодирующие Lac -репрессор /lac I/ и неомицинфосфотрансферазу /neo/.
Ќа фиг. 11 /11a, b и c/ показана полна€ нуклеотидна€ последовательность плазмиды pDMI. 1. Ќа этой последовательности отмечены сайты расщеплени€, распознаваемые рестриктазами, приведенными на фиг. 10. ѕоказанна€ нуклеотидна€ последовательность включает открытые рамки считывани€, кодирующие неомицинфосфотрансферазу (от Met до Phe) и lac-репрессор /от Met до Gln/. ѕожалуйста, обратите внимание на обратную ориентацию этого гена.
Ќа фиг. 12 схематически изображена плазмида pV C8 - TK - 7.5K. Ќа этой схеме и на фиг. 13 и 15 аббревиатура “  обозначает ген тимидинкиназы в вирусе вакцины; 7,5  обозначает промотор 7,5   вируса вакцины, lac Z содержит регул€торные последовательности и кодируемую информацию дл€ части N-концевого участка гена β- галактозидазы; ori обозначает область, необходимую дл€ репликации ƒЌ  в клетках E. coli, и AmpR обозначат ген β- лактамазы.
Ќа фиг. 13 схематически изображена рекомбинантна€ плазмида pR3.
Ќа фиг. 14 показаны полна€ нуклеотидна€ последовательность рекомбинантной плазмиды pR3. ѕриведенна€ нуклеотидна€ последовательность представл€ет собой открытую рамку считывани€, наход€щуюс€ под контролем промотора 7.5   вируса вакцины.
Ќа фиг. 15 схематически изображена плазмида pR4. ML обозначает лидерную последовательность мал€рийного антигена.
¬се процитированные работы полностью приведены в списке литературы.
»спользуемые в описании термины имеют следующее значение.
"ѕоверхностный антиген Eimeria - это белок с мол. массой около 23 кƒа/ по данным электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем SDS, SDS-PAGE/, который обнаруживаетс€ у Eimeria tenella на стадии мерозоитов. Ётот белок образует in vivo в результате посттрансл€ционного процессинга продукта, который кодируетс€ последовательностью кƒЌ , приведенной на фиг. 1.
"Ѕелок - предшественник" - это протеин с мол. массой около 33 кƒа /по данным SDS - PAGE/. ѕолагают, что in vivo в результате протеолитического расщеплени€ этого белка образуетс€ поверхностный антиген Eimeria. Ќуклеотидна€ последовательность кƒЌ , колирующей белок - предшественник, и предсказанна€ на ее основе аминокислотна€ последовательность, приведены на фиг. 1.
"»ммуногенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность (1) и способные индуцировать иммунный ответ против паразитических простейших рода Eimeria" - это полипептиды, обеспечивающие B - и/или T-клеточный протективный иммунитет по отношению к Eimeria, мерозоиты которых содержат описанный выше поверхностный антиген, соответствующий последовательност€м иммуногенных полипептидов. »ммуногенные полипептиды могут быть самим по себе поверхностным антигеном зрелых мерозоитов Eimeria, свободным от других белков Eimeria, или фрагментами данного поверхностного антигена, способными специфическим св€зыватьс€ с антителами, которые обнаруживаютс€ в сыворотке животных, инфицированных паразитическими Eimeria. Ёти полипептиды соответствуют эпитопам описанного выше поверхностного антигена Eimeria, которые распознаютс€ T- и B-клетками. ѕолипептиды, которые охватывает насто€щее изобретение, кроме того, могут быть и функциональными эквивалентами данного поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, и иметь аминокислотную последовательность, полученную на основе последовательности, приведенной на фиг. 1, путем замены определенных аминокислот, причем такого рода замены не оказывают значительного вли€ни€ на иммунологическую активность /другими словами, существенно не измен€ют иммунореактивность и/или структуру антигенных детерминант/.
ѕримером фрагмента иммуногенного полипептида может служит полипептид, который имеет аминокислотную последовательность (1) /SEQ ID NO:1/ за исключением того, что эта последовательность утратила первые 20 - 100 аминокислотных остатков, представл€ющих собой последовательность сигнального пептида. ƒругой пример - это иммуногенный полипептид, который по данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS имеет мол. массу около 23 кƒа.   предпочтительным фрагментам относ€тс€ следующие:
SNNQQTSV (2)(SEQ ID NO:3)
CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3)(SEQ ID NO:4)
PNV (4)(SEQ ID NO:5)
RNKQIF (5)(SEQ ID NO:6)
NPWTGQEE (6)(SEQ ID NO:7)
RQSEE (7)(SEQ ID NO:8)
TRQTLE (8)(SEQ ID NO:9)
QDGKTAKEEVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9)(SEQ ID NO:10)
TDEDG (10)(SEQ ID NO:11)
TGPHG (11)(SEQ ID NO:12)
ASQGK (12)(SEQ ID NO:13)
DDGKGNLVDGQGRK (13)(SEQ ID NO:14) and
TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(SEQ ID NO:15).
‘рагменты, охватываемые данным изобретением, как и иммуногенный полипептид последовательности (1) (SEQ ID NO:1), способны индуцировать иммунный ответ различных организмов против кокцидиоза. ѕредпочтительно с этой целью используетс€ домашн€€ птица, например цыпл€та. »звестно, что в белках могут происходить аминокислотные замены, которые не оказывают существенного вли€ни€ на биологические и иммунологические свойства данных белков. Ёто €вление, например, описано Neurath et al. в книге "Ѕелки", Academic Press, New York /197/, в частности на стр. 14, где приведен фиг. 6. Ќаиболее частые замены аминокислот наблюдаютс€ в случа€х Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly /причем в обоих направлени€х, т. е. например Ala замещаетс€ на Ser и наоборот/. ѕоскольку генетический код €вл€етс€ вырожденным, могут существовать различные потенциально возможные нуклеотидные последовательности /функциональные эквиваленты/, которые способны кодировтаь аминокислотную последовательность (1) (SEQ ID NO:1).  роме того, следует понимать, что за€вл€емые здесь нуклеотидные последовательности молекул ƒЌ  и их фрагментов, встроенные в векторы, могут включать нуклеотиды, которые не €вл€ютс€ частью действительно структурных генов, так же как и то, что рекомбинантные векторы, содержащие такие последовательности или фрагменты, способны направл€ть продукцию за€вленных полипептидов в соответствующем организме - хоз€ине.
ѕоследовательности ƒЌ , кодирующие пролипептиды, которые представл€ют собой функциональные эквиваленты поверхностного антигена мерозоитов Eimeria, могут быть получены без особых затруднений с помощью подход€щих синтетических олигонуклеотидов путем сайт-специфического мутагенеза, направл€емого затравкой, как это сделано на примере за€вленной кƒЌ . ƒанный метод описан Morinaga et al. /Biotechnology, 2 : 636, 1984/.
‘рагменты или части поверхностного белкового антигена мерозоитов Eimeria или кодирующие их последовательности ƒЌ  могут быть получены путем энзиматического расщеплени€ более крупных молекул с помощью рестрикционных эндонуклеаз в случае ƒЌ  и протеиназ в случае белков. ќднако охватываемые насто€щим изобретением фрагменты, не ограничиваютс€ продуктами, которые получены в результате какого-либо энзиматического расщеплени€, но и включают в себ€ субпоследовательности, концевые участки которых не соответствуют каким-либо точкам энзиматического расщеплени€. “акие фрагменты могут, например, быть получены путем химического синтеза с помощью описанной здесь последовательности. ƒЌ  - фрагменты могут быть получены и в результате синтеза неполностью комплементарных ƒЌ  /кƒЌ / на основе изолированных матричных –Ќ  /м–Ќ /.  роме того, фрагменты белка могут быть получены и в результате экспрессии соответствующих фрагментов ƒЌ , кодирующих эти белки. “акие белковые фрагменты могут использоватьс€ согласно насто€щему изобретению, если содержат достаточное число аминокислотных остатков, чтобы образовать антигенную детерминанту и/или обеспечить иммунореактивность. ¬ целом, дл€ этого нужно по крайней мере около 7-8 аминокислотных остатков.  ак объ€снено ниже, может возникнуть необходимость в соединении таких фрагментов с молекулой иммуногенного носител€ дл€ придани€ им иммунологической реактивности.
ѕод иммунологической реактивностью понимают как способность генерировать образование антител B-клетками /гуморальный иммунитет/, так и способность активировать T-клетки /клеточный иммунитет/. «а€вленные полипептиды содержат B-клеточные и T-клеточные антигенные детерминанты /эпитопы/. √уморальный иммунитет может быть продемонстрирован путем индукции образовани€ антител B-клетками in vivo или in vitro. ќ клеточно-опосредованном иммунитете можно судить по активации T-клеток, например, увеличению синтеза T-клеточных белков или стимул€ции B-клеток активированными T-клетками. ћетоды исследовани€ обоих типов иммунитета хорошо известны.
ѕолипептиды, представл€емые к защите в пределах материалов данной за€вки, могут быть получены известными способами, например, с помощью технологии рекомбинантных ƒЌ , путем химического синтеза или выделены из тотальных препаратов белков Eimeria. ѕри этом полипептид последовательности 1 /SEQ ID NO: 1/ и соответствующие фрагменты в значительной степени свободны от других белков, образуемых паразитическими простейшими рода Eimeria.
ƒЌ , необходима€ дл€ получени€ за€вл€емых белков, может быть химически синтезирована с помощью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 /кроме того, информаци€ об этом приведена и на рисунках/. “акой метод химического синтеза может быть выбран из большого числа широкоизвестных методов, и например, представл€ет собой синтез ƒЌ  на твердой подложке из фосфорамидита /Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185, 1981/.
јльтернативный путь - это синтез кƒЌ  на м–Ќ  Eimeria. ћатричную –Ќ  можно изолировать из мерозоитов Eimeria обычными методами. «атем образцы м–Ќ  могут быть использованы дл€ образовани€ двухцепочечной кƒЌ , как описано в кн. Maniatis et al. /Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spting Harbor, NY/. ƒалее кƒЌ  можно встроить в подход€щий клонирующий вектор, который затем используют дл€ трансформации соответствующего организма - хоз€ина /например E. coli/, чтобы получить библиотеку кƒЌ .
ѕосле этого провод€т скрининг библиотеки кƒЌ , использу€ за€вл€емый клонированный ген или его фрагменты в качестве пробы. “акой ген или фрагменты с этой целью могут быть помечены, например путем ник-трансл€ции с помощью ƒЌ  - полимеразы 1 в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидов, один из которых содержит 32P в α- положении /Maniatis et al., см. предыдущую ссылку, стр. 109/.  роме того, пробы могут быть получены путем олигонуклеотидного синтеза на основе известной последовательности кƒЌ  поверхностного антигена Eimeria.
Ќесмотр€ на то, что дл€ выделени€ м–Ќ  в приведенных ниже примерах использовались простейшие Eimeria tenella, клонированные гены простейших этого вида могут быть использованы в качестве проб дл€ выделени€ генов других видов Eimeria из-за гомологии последовательностей ƒЌ  различных видов Eimeria.
ƒЌ  Eimeria, которые выделены и идентифицированы согласно насто€щему изобретению, встраивают в соответствующий вектор экспрессии, содержащий элементы, необходимые дл€ транскрипции и трансл€ции встроенных генных последовательностей. ѕолезные клонирующие векторы могут содержать фрагменты хромосомальных, нехромосомальных и синтетических последовательностей ƒЌ , например широко известные бактериальные плазмиды, вирусные ƒЌ  /например фаговые ƒЌ /, комбинированные ƒЌ  плазмид и вирусов или фагов /например плазмиды, которые модифицированы дл€ использовани€ фаговой ƒЌ  или других последовательностей контрол€ экспрессии/, а также плазмиды дрожжей. —пецифические клонирующие векторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваютс€, pEV - vrf-плазмидами /pEV-vrf1, - 2 и 3, которые описаны Growl et al. , Gene 38 : 31, 1985/; SV 40; аденовирусами; векторами дрожжей; векторами л€мбда - gt - WES-л€мбда B; Charon 4A и 28, л€мбда - gt-2; векторами на основе M 13, например pVC8, 9, 18 и 19, pBR313, 322 и 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUB110; pMB9; colE1; pSC101; pML21; RSF2124; pCR1 или RP4; векторами на основе вирусов куриной оспы, вирусов вакцины или других видов герпесвирусов.
¬страивание генов Eimeria в клонирующий вектор легко осуществл€етс€, когда гены и соответствующий клонирующий вектор разрезаютс€ одним и тем же /одними и теми же/ фрагментом /ферментами/ таким образом, что образуютс€ комплементарные концы ƒЌ . ≈сли это не может произойти, то необходимо модифицировать концы таким образом, чтобы образовались тупые концы ƒЌ  /путем переваривани€ одноцепочечной ƒЌ /. Ётого же результата достигают, надстраива€ одноцепочечные концы с помощью подход€щей ƒЌ  - полимеразы. ƒалее осуществл€ют лигирование тупых концов с помощью фермента T4 ƒЌ -лигазы. јльтернативно, любой нужный участок ƒЌ  можно получить, св€зыва€ нуклеотидные последовательности /линкеры/ с концами ƒЌ . “акие линкеры могут содержать специфические олигонуклеотидные последовательности, которые содержат сайты рестрикции. –асщепленный вектор и гены или фрагменты генов Eimeria могут быть модифицированы и в результате присоединени€ гомополимерных "хвостов", как описано Morrow /Methods in Enzymology, 68 : 3, 1979/.
ћногие из клонирующих векторов, которые могут быть использованы в данном изобретении, содержат один или более маркеров, служащих дл€ отбора нужных трансформантов, например гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину в pBR322, ген устойчивости к ампициллину и ген β- галактозидазы в pUC8 ген устойчивости к ампициллину в pEV-vrf плазмидах. —елекци€ клеток - хоз€ев, трансформированных такими векторами, существенно облегчаетс€ в том случае, если клетки лишены активности, котора€ обеспечиваетс€ вектором.
—ледует понимать, что нуклеотидные последовательности генов Eimeria, которые встраиваютс€ в селективные сайты клонирующего вектора, могут включать нуклеотиды, не €вл€ющиес€ частью действительно структурных генов. — другой стороны, гены могут содержать только какую-нибудь одну часть полного гена дикого типа. ¬се, что требуетс€ в данном случае, это, чтобы фрагменты генов после введени€ в клонирующий вектор были способны направл€ть синтез в соответствующем организме - хоз€ине полипептида или белка, имеющего по крайней мере одну иммунореактивную и/или антигенную детерминанту поверхностного антигена Eimeria. “ак, рекомбинантные векторы, содержащие ƒЌ  с нуклеотидной последовательностью, котора€ кодирует белок, за€вл€емый в насто€щем изобретении, могут быть получены следующим образом:
а/ ƒЌ  нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный белок, встраивают в вектор;
б/ данный вектор реплицируют в микроорганизмах и
в/ изолируют рекомбинантный вектор из микроорганизмов
—елекцию соответствующих клеток - хоз€ев осуществл€ют различными, хорошо известными методами, например основанными на совместимости клеток и выдел€емого вектора, токсичности белков, кодируемых гибридной плазмидой, легкости определени€ нужного белка, характеристиках экспрессии, безопасности клеток - хоз€ев и их стоимости. Ќеобходимо учитывать соотношение этих факторов и следует понимать, что не все клетки - хоз€ева одинаково эффективны дл€ экспрессии определенной рекомбинантной молекулы ƒЌ .
ѕодход€щие клетки - хоз€ева, которые могут быть использованы в насто€щем изобретении, включают клетки растений, млекопитающих, дрожжей или бактерий, но не ограничены ими. —реди бактерий могут быть использованы Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus sterothermophilus и Actinomyces. ¬ частности, можно применить штамм MC 1061 E. coli, описанный Casadabanetal. /J. Mol. Biol, 138 : 179, 1980/ или любой другой штамм E. coli K 12, содержащий плазмиду pRK248clta. ѕлазмида pRK248clts дл€ использовани€ в других штаммах E. coli K 12 описана Bernhard et al. /Meth. of Enzymol, 68 : 482, 1979/ и, кроме того, может быть получена из јмериканской коллекции типовых культур под каталожным номером ј“—— 33766. Ўтамм MC 1061 E. coli можно приобрести коммерческим путем, например в лаборатории CLONTECH Inc., Palo Alto, —ј, —Ўј, а также в јмериканской коллекции типовых культур под каталожным номером ј“—— 53338. ѕлазмиды pDMI.1, pDS56/RBSII, - 1 или - 2 дл€ использовани€ в E. coli штамма M 15 описаны ниже.
ѕеренос рекомбинантного клонирующего вектора в клетки - хоз€ева осуществл€ют различными методами. ¬ зависимости от выбранной системы вектор/клетка-хоз€ин такой перенос может произойти в результате трансформации, трансдукции, трансфекции, или электропорации. «атем модифицированные клетки - хоз€ева культивируют и белковый продукт экспрессии выдел€ют из культуры.
“рансформированные клоны, в которых образуетс€ белок - предшественник поверхностного антигена Eimeria, идентифицируют путем скрининга при использовании сыворотки животных, иммунизированных препаратами спорозоитов или мерозоитов E. tenella, фиксированных глутаральдегидом. ¬ примерах, описанных ниже, дл€ отбора и характеристики генных продуктов используют кроличью сыворотку к мерозоитам E. tenella. ѕараллельно дл€ независимо кƒЌ  белка - предшественника поверхностного антигена мерозоитов примен€ют иммунологический скрининг с иммунной сывороткой цыпл€т.
—пецифичность антисывороток, используемых дл€ иммунологического скрининга или иммунопреципитации, можно увеличить с помощью модифицированного метода селекции антител, описанного Hall et al. /Nature 311 : 379, 1984/. —огласно данному методу, который более подробно раскрыт ниже, антитела, специфичные к белкам Eimeria, полученным при отборе соответствующих клонов, адсорбируют на фильтрах.
¬ы€вление клонов, продуцирующих антигены Eimeria, можно осуществить каким-либо хорошо известным стандартным методом, например иммунопреципитацией, твердофазным иммуноферментным анализом /ELISA/ и радиоиммунологическим методом, которые описаны в литературе /см. например Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, под редакцией Kennet et al., Plenum Press, New York, pp. 376 - 384, 1980
–екомбинантные векторы, содержащие ƒЌ , которые кодируют вариантные полипептиды поверхностного антигена Eimeria, за€вленного в объеме данного изобретени€, могут быть получены с помощью хорошо известных методов, например путем сайт - специфического мутагенеза.
Ѕольшие количества рекомбинантных полипептидов Eimeria, охватываемых насто€щим изобретением, могут быть получены при культивировании трансформированных микроорганизмов в ферментационном бульоне, содержащем необходимые питательные вещества, и подборе условий, обеспечивающих экспрессию рекомбинантной ƒЌ . ѕолучаемые с помощью E. coli рекомбинантные полипептиды Eimeria обычно содержатс€ в цитоплазме бактериальных клеток или в бактериальных тельцах включени€. “аким образом, дл€ высвобождени€ белков необходимо разрушить внешнюю оболочку бактерий. Ёто достигаетс€ при ультразвуковой обработке клеток или при механической гомогенизации, например с помощью пресса ‘ренча или гомогенизатора √олена /см. Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476 - 556, 1971/.
–азрушение клеток можно осуществить химическими или энзиматическими методами. “ак, дл€ интеграции мембран часто необходимы двухвалентные катионы, поэтому обработка клеток соответствующими хелатирующими агентами, например Ёƒ“ј или Ё√ƒј, в достаточной степени обеспечивает их разрушение и высвобождение внутриклеточных белков. — этой же целью могут быть использованы ферменты, например лизоцим, который гидролизует пептидогликаны клеточной стенки.
 роме того, примен€ют метод осмотического шока. ¬начале клетки помещают в гипертонический раствор, где они тер€ют воду и сморщиваютс€. ѕоследующий перенос клеток в гипотонический "шоковый" раствор вызывает быстрый приток воды в клетки и выброс из них нужных белков.
¬ысвобожденные из клеток белки Eimeria могут быть сконцентрированы преципитацией сол€ми, например сульфатом аммони€, ультрафильтрацией и другими хорошо известными методами. ƒальнейшую очистку провод€т с помощью традиционных способов очистки белков, которые включают гель-фильтрацию, ион-обменную хроматографию, препаративный диск - гель - электрофорез или электрофорез на бумаге /мембране/, изоэлектрофокусирование, фракционирование в органических растворител€х при низкой температуре или встречное распределение, но не ограничиваютс€ ими.  роме того, белки очищают путем иммуноаффинной хроматографии.
—пециальные методы очистки белков Eimeria, полученных в различных организмах, известны /см. например, Newman et al., за€вка на ≈вропейский патент N 164176/.
«а€вленные в соответствии с насто€щим изобретением белки и их фрагменты могут быть синтезированы каким-либо подход€щим химическим методом, например ограниченным синтезом на твердой фазе, частичным синтезом на твердой фазе, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. “вердофазный синтез, описанный Merrifield /J.Am. Chem, 85 : 2149, 1963/ предпочтителен.
“вердофазный синтез основан на использовании аминокислот, у которых защищены терминальные α- аминогруппы. “рифункциональные аминокислоты, имеющие подвижные боковые группы, тоже защищают соответствующим образом, чтобы предотвратить химическую реакцию в нежелательном участке в процессе сборки пептида. «ащитные α- аминогруппы селективно удал€ют, чтобы могла идти дальнейша€ реакци€ на соответствующих концевых участках аминокислот. ”слови€ удалени€ таких защитных групп подбирают таким образом, чтобы боковые цепи остались защищенными.
»звестны многочисленные α- аминозащитные группы, которые используютс€ при одноступенчатом синтезе пептидов. ќни включают ацилзащитные группы /например формил, трифторацетил, ацетил/, ароматические уретановые группы [например бензилоксикарбонил /Cbz/ и замещенный бензилоксикарбонил], алифатические уретановые защитные группы [например t-бутилоксикарбонил /¬oc/, изопропилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил] и алкильные защитные группы /например, бензил, трифенилметил/. ѕредпочтительно использование Boc. «ащитные группы боковых цепей, в частности дл€ тирозина /Tyr/, включают тетрагидропиранил, трет-бутил, тритил, бензил, Cbz, 4-Br-Cbz и 2,6-дихлорбензил. ƒл€ защиты боковых цепей тирозина предпочтительно используетс€ 2,6-дихлорбензил. «ащитные группы боковых цепей, в частности дл€ аспарагина /Asp/ включают бензил, 2,6-дихлорбензил, метил, этил и циклогексил. ѕредпочтительно использовать циклогексил. «ащитные группы боковых цепей триптофана /Thr/ и серина /Ser/ включают ацетил, бензоил, тритил, тетрагидропиранил, бензил, 2,6-дихлорбензил и Cbz. ƒл€ защиты аминогрупп боковых цепей Thr и Ser предпочтительно использование бензила. «ащитные группы боковых цепей аргинина /Arg/ включают нитрогруппы, Tos, Cbz, адамантилоксикарбонил или Boc. ѕредпочтительно использовать Tos. јминогруппы боковых цепей лизина защищают с помощью Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos или Boc. ѕредпочтительно использовать 2-Cl-Cbz. ¬ыбор защитных групп боковых цепей основан на следующем. Ёти защитные группы в процессе синтеза пептида остаютс€ интактными и не расщепл€ютс€ при удалении защитных групп концевых участков аминокислот. «ащитные группы боковых цепей должны быть удалены после завершени€ синтеза всего пептида при подборе таких условий, которые не нарушают его целостности.
ќбычно твердофазный синтез провод€т, начина€ с карбоксильных остатков аминокислот, присоедин€€ аминокислоты с защищенными α- аминогруппами /защищенными боковыми цеп€ми/ к подход€щей твердой подложке. ѕри соединении с хлорметилированной или гидрометилированной смолой образуетс€ эфирный мостик и образовавшийс€ пептид имеет свободную карбоксильную группу на C-концевом участке. ¬ противоположность этому, при использовании бензилгидроаминной или n-метилбензгидриламинной смолы образуетс€ амидна€ св€зь и полученный пептид имеет карбоксиамидную группу на C-концевом участке. —молы коммерчески доступны и их приготовление описано в кн. "Solid Phase Peptide Synthesis" /2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984/.
C-концева€ аминокислота, Arg, боковые цепи которой защищены Tos и α- аминогруппа защищена Boc, присоедин€етс€ к бензгидриламинной смоле с помощью различных активирующих агентов, например дициклогексилкарбодиимида /DCC/, N, N'-диизопропилкарбодиимида и карбонилдиимидазола. ѕосле соединени€ с подложкой из смолы защитна€ α- аминогруппа удал€етс€ с помощью трифторуксусной кислоты /TPA/ или HCl в диоксане при температуре от 0 до 25oC. ѕосле введени€ метионина к TPA добавл€ют диметилсульфид, чтобы предотвратить возможную S-алкил€цию. ѕосле удалени€ защитной α- аминогруппы, оставшиес€ защищенные аминокислоты одноступенчато, в определенном пор€дке взаимодействуют между собой с образованием нужной пептидной последовательности.
ƒл€ соединени€ аминокислот могут использоватьс€ различные активирующие агенты, например DCC, N,N'-диизопропилкарбодиимид, бензотриазол-1-ил-окси-трис/диметиламино/-фосфониум гексафторофосфат /BOP/ и DCC-гидроксибензотриазол /HOBt/.  ажда€ защищенна€ аминокислота беретс€ в избытке />2,5 эквивалентов/ и их соединение обычно происходит в DMF, CH2Cl2 или смеси этих компонентов. ѕолноту прохождени€ реакции соединени€ контролируют на каждой стадии с помощью нингидриновой реакции, как описано Kaiser et al. /Anal. Biochem., 334:595, 1970/. ¬ тех случа€х, когда вы€вл€етс€ неполное прохождение реакции, ее повтор€ют. —оединение аминокислот можно проводить автоматически на специальном синтезаторе, например Vega 250, Applied Biosystems или на каком-либо другом доступном оборудовании. ѕосле окончани€ полной сборки пептида, комплекс пептид-смола обрабатывают TPA/дитиоэтаном /дл€ удалени€ защитных α- аминогрупп/ и затем расщепл€ют с помощью химических реагентов, например жидкой HF, в течение 1-2 ч при 0oC. ¬ результате пептид отдел€етс€ от смолы и удал€ютс€ защитные группы боковых цепей.
÷иклизаци€ боковых цепей на твердой подложке требует ортогональной защиты, котора€ обеспечивает селективное расщепление функциональных боковых цепей кислых аминокислот /например Asp/ и щелочных аминокислот /например Lys/. 9-фторенилметил /OFm/ может быть использован дл€ защиты боковых цепей Asp и 9-фторенилметоксикарбонил /Fmoc/ - дл€ защиты боковых цепей Lys. ¬ этих случа€х боковые защитные группы комплекса Boc - защищенный - пептид - смола селективно удал€ютс€ с помощью пиперидина в DMF. ÷иклизаци€ происходит на твердой подложке при использовании различных активирующих агентов, включа€ DCC, DCC/HOBt или BOP. ƒл€ расщеплени€ комплекса циклизованный пептид - смола используют HF, как описано выше.
ќчистку и скрининг синтетических белков осуществл€ют как описано выше дл€ белков, полученных в результате генетической рекомбинации.
Ѕелки Eimeria могут быть выделены путем экстрагировани€ мембранной фракции клеток. “аким образом получают тотальные препараты белков дикого типа. Ќеобходимые моноклональные антитела можно получить как описано Kohler and Milstein /Nature, 256:495, 1975/, использу€ в качестве антигена синтетические или природные белки Eimeria. ƒанные методы могут быть применены дл€ очистки поверхностного антигена Eimeria мол. массы 23 кƒа, который €вл€етс€ объектом данного изобретени€.
ќдин или более за€вленных белков могут быть использованы как составные компоненты вакцин в сочетании с физиологически подход€щим носителем, например 0,01 - 0,1 ћ фосфатным буфером, имеющим нейтральный pH, или физиологическим раствором.
”силенный иммунитет к кокцидиозу может быть генерирован одним из двух путей. ¬о-первых, к вакцине добавл€ют адъювант или иммуностимул€тор. ¬о-вторых, за€вленные белки могут быть использованы дл€ иммунизации в форме комплекса больших размером; это может быть как соединение белков с помощью перекрестных св€зей, так и их конъюгаци€ с подход€щим носителем.
¬озможные адъюванты дл€ вакцинации включают јдъювант 65 /содержащий арахисовое масло, моноолеат маннида и моностеарата алюмини€/; минеральные гели, например гидроксид алюмини€, фосфат алюмини€ и алюминиевые квасцы; сурфактанты, например гексадецикламин, октадецикламин, лизолецитин, диметилдиоктадециламмониум бромид, N,N-диоктадецил-N,N'-бис/2-гидроксиметил/пропанодиамин, метоксигексадецилглицерин и различные многоатомные спирты; полианионы, например пиран, дестрансульфат, поли IC, полиакриловую кислоту и карбопол; пептиды, например мурамилдипептид, диметилглицин и туфтсин, а также масл€ные эмульсии, но не ограничиваютс€ ими. Ѕелки могут быть использованы и после включени€ в липосомы или другие микроносители.
¬ключение белков в липосомы означает, что высвобождение вакцины может происходить в течение продолжительного промежутка времени. — этой целью используют осмотический насос јльца.
»ммуногенность за€вленных полипептидов, особенно более мелких фрагментов, может быть усилена за счет перекрестного св€зывани€ или соединени€ с иммуногенным носителем /макромолекулой, котора€ сама по себе вызывает иммунный ответ при введении в организм хоз€ина, и с которой данные белки или их фрагменты могут быть ковалентно св€заны/. ѕерекрестное св€зывание или конъюгаци€ с носителем может быть необходима, поскольку небольшие белковые молекулы иногда функционируют как гаптены /молекулы, которые способны св€зыватьс€ с антителами, но не могут вызвать иммунный ответ, т.е. они не иммуногенны/.  онъюгаци€ таких фрагментов с иммуногенным носителем придает им иммуногенность; это €вление обычно называют "эффектом носител€".
ѕодход€щие носители включают, например белки и природные или синтетические полимерные вещества, такие как полипептиды, полисахариды, липополисахариды и др. ’орошим носителем €вл€етс€ гликозид, называемый Quil A, который описан Morein et al. /Nature 308:457, 1984/. ќсобенно предпочтительно использование белковых носителей, которые включают сывороточные белки млекопитающих, например гаммаглобулин человека или быка, сывороточный альбумин человека, кролика или быка, метилированные или другие производные этих белков, а также гемоцианин моллюска фиссуреллы, но не ограничиваютс€ ими.  роме того, могут быть использованы и другие известные белковые носители. ѕредпочтительно, но не об€зательно, чтобы белковый носитель был чужеродным по отношению к организму-хоз€ину, который иммунизируют дл€ получени€ антител к белкам Eimeria.
 овалентное св€зывание с белком - носителем осуществл€ют каким-либо хорошо известным методом, правильный выбор которого зависит от природы используемого носител€.  огда иммуногенный носитель представл€ет собой белок, белковые фрагменты, за€вленные в данном изобретении, могут быть присоединены к нему, например с помощью водного раствора карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид или глутаральдегид.
—шивающие агенты, подобные указанным выше, могут быть использованы дл€ перекрестного св€зывани€ белков и их фрагментов между собой без применени€ носител€. “акие перекрестно-св€занные белки или их фрагменты обладают повышенной иммуногенностью.
¬ведение эффективного количества предложенной за€вителем вакцины может защитить организм от кокцидиоза, например вызываемого E.tenella или другими видами Eimeria. ћоноклональные антитела к антигенам E.tenella in vitro перекрестно реагируют с антигенами E.acervulina и E.maxima. ѕредпочтительно дл€ иммунизации использовать домашнюю птицу, например цыпл€т, однако насто€щее изобретение охватывает и другие живые организмы. ¬ соответствии с изобретением может быть использовано любое эффективное количество вакцины, которое определ€ют традиционным экспериментальным путем с помощью описанных ниже методов. ƒл€ вакцинации в качестве эффективной дозы предпочтительно использовать 5-50 мкг препарата за€вленных пептидов или их фрагментов на 1 кг веса иммунизируемого организма-хоз€ина, особенно дозу 25-50 мкг/кг. ѕервоначальную иммунизацию предпочтительно провод€т через одну или несколько недель после бустерной инъекции. ћожно использовать несколько бустерных инъекций. ¬ основном, такие инъекции осуществл€ют в дозах 5-50 мкг/кг, предпочтительно 20-50 мкг/кг. ќбычные методы иммунизации включают подкожный, внутрикожный, внутримышечный, оральный, анальный или метод in ovo, т.е. непосредственную иммунизацию эмбрионов. ѕосле одной или нескольких бустерных вакцинаций может развитьс€ слаба€ кокцидиозна€ инфекци€, котора€ усиливает защитные реакции организма.
ѕрезентаци€ за€вленных антигенов кокцидий иммунной системе живых организмов, например цыпл€т, может осуществл€тьс€, кроме того, путем клонировани€ генов соответствующих антигенных белков в бактери€х /например E. coli иди Salmonella/ или в вирусах /например поксвирусах или герпесвирусах/ и последующего введени€ живой векторной системы или при необходимости ее инактивированной формы в живой организм в результате орального приема, инъекций или каким-либо другим известным способом. Carbit et al. /в кн. Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, с. 68-71, 1987/ описали использование E. coli, а Clements /Pathol. Immunopathol. Res. 6:137, 1987/ - использование Salmonella. Moss et al. /Ann.Rev.Immunol., 5:305, 1987/ посв€тили свой обзор использованию векторных систем на основе рекомбинантных поксвирусов.
¬ирус вакцины - представитель семейства поксвирусов - может быть использован дл€ введени€ кокцидиальных антигенов в живые организмы и клеточные культуры. — этой же целью согласно насто€щему изобретению может примен€тьс€ и другой вирус, относ€щийс€ к поксвирусам, а именно вирус оспы кур. ќднако было показано, что дл€ аналитических исследований более подходит вирус вакцины, поскольку он размножаетс€ быстрее, чем вирус оспы кур и круг его хоз€ев не ограничен клетками кур. Ѕольшие количества гетерологичной ƒЌ  могут быть встроены в геном вируса вакцины без ингибировани€ его инфекционности и процессов созревани€ /Smith et al., Gene 25: 21, 1983/. ћногочисленные гетерологичные гены, встроенные в вирус, экспрессируютс€ в инфицированных организмах и вызывают образование антител /Perkus et al., Science 229:981, 1985/.
ћетодика получени€ рекомбинантного вируса вакцины может быть откорректирована в точном соответствии с особенност€ми герпесвирусов и вируса оспы кур. –екомбинантный вирус, содержащий ƒЌ  нуклеотидной последовательности, кодирующей за€вленный белок, может быть получен в результате:
а/ встраивани€ ƒЌ  нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный белок, в геном вируса без ингибировани€ его инфекционности и процессов созревани€;
б/ амплификации указанного рекомбинантного вируса в клеточной культуре; и
в/ выделени€ рекомбинатного вируса из культуры и его очистки.
»спользование рекомбинантных вирусов как носителей вакцины против кокцидиоза имеет особые преимущества, поскольку у вакцинированных цыпл€т развиваетс€ иммунитет как к антигенам кокцидий, так и к вирусному носителю /т.е. такие вакцины €вл€ютс€ бивалентными/. ѕолезные свойства данных вакцин могут быть увеличены в еще большей степени за счет встраивани€ дополнительных генов в вирусный носитель. Ќапример, в вирус вакцины вместе с генами антигенных белков кокцидий могут быть встроены участки генома вируса болезни Ќьюкастла, и в результате при использовании одной вакцины возникает иммунитет и к болезни Ќьюкастла, и к кокцидиозу и к вирусу оспы кур.
¬ведение живых векторных вакцин, охватываемых изобретением, можно осуществить любым известным методом, например методом "укола", который широко используетс€ дл€ вакцинации домашней птицы против вируса оспы кур. ѕри этом перепонку крыла прокалывают острой иглой, которую предварительно обмакивают в вакцине. Ќа кончике иглы находитс€ небольшое ушко /как у игл швейных машин/, в котором задерживаетс€ капл€ вакцины. јльтернативный подход заключаетс€ в том, что живые вакцины инъецируют подкожно или внутрикожно в область перепонки крыла или в какой-либо другой участок тела.
 роме того, живые рекомбинантные векторные вакцины могут быть добавлены в питьевую воду или распылены в воздухе, например вокруг цыпл€т, которые должны быть вакцинированы. ќни могут быть введены с пищей, предпочтительно после защитного инкапсулировани€ /Balancou et al., Nature 322:373, 1986/ или инъецированы непосредственно в €йцеклетки /иммунизаци€ in ovo/. Ѕолее поздний метод предусматривает введение вирусных вакцин пр€мо в эмбрионы, в частности эмбрионы кур /Sharma, Avian Dis 25:1155, 1985/.
«а исключением специально оговоренных случаев, приведенные ниже процентные соотношени€ твердых веществ в составе твердых смесей, жидких веществ в жидких смес€х и твердых веществ в жидких смес€х приведены соответственно в единицах масса на массу, объем на объем и масса на объем. Ѕолее того, за исключением особых случаев, необ€зательно использовать именно те реагенты и оборудование, которые указаны ниже. ”мелый исследователь может выбрать другие аналогичные реагенты и оборудование из числа известных.
ѕример 1.
¬ыделение мерозоитов.
ћерозоиты E. tenella выдел€ют из слепой кишки 50 больных цыпл€т /3-недельного возраста, породы Hubbard Cross, полученных от службы птицеводства, French town, NJ, USA/ через 5 дней после введени€ спорулированных ооцит /50000 на одну особь/. ћогут быть использованы аналогичные цыпл€та из других источников. —лепую кишку удал€ют и промывают фосфатным буферным раствором /PBS/ 15 мин на магнитной мешалке. Ёпителиальный дебрис частично удал€ют низкоскоростным центрифугированием /50 g/ и непереваренные мерозоиты отдел€ют центрифугированием при 2000 g и 4oC в течение 10 мин. ќсадок ресуспендируют в лизирующем буфере /8.29 г/ NH4Cl, 0,372 г/л Na2 Ёƒ“ј, 1,0 г/л KHCO2, pH 7,6/ инкубируют на льду 30 мин. ћерозоиты собирают центрифугированием, отмывают в PBS, пропускают через колонку, содержащую 1,0 г найлонового волокна /Scryb Nylon Fiber, Fenwal Laboratories, Leerfield, II/ и собирают с помощью разделительной воронки. «атем мерозоиты центрифугируют, как описано выше, и замораживают при использовании сухого льда дл€ изол€ции –Ќ  или дальнейшей очистки на диэтиламиноэтилцеллюлозе /DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc. , Clifton, NJ, USA/ с целью постановки ¬естерн - блоттинга.
ƒл€ очистки на DEAE - целлюлозе примерно 1 · 109 мерозоитов нанос€т в PBS на 10-мл колонку и элюируют PBS. ћерозоиты собирают в первой 100-мл фракции, прошедшей через колонку и по существу свободной от эритроцитов и другого клеточного дебриса.
»ммунопреципитаци€ 125J -меченных поверхностных белков.
ѕоверхностные белки очищенных мерозоитов мет€т J125 с помощью иодогенного метода /IODOGENTM method, Pierce Chemical Co./ или при использовании IODOBEADSTM /Pierce Chemical Co./. ¬ последнем случае 4 IODOBEADSTM отмывают 3 раза в 0,2ћ фосфате натри€, pH 7,5 добавл€ют 1-3 м и 125J-Na и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. ¬ реакционный сосуд внос€т очищенные мерозоиты /3 · 108/ в 200 мл PBS, pH 7,0, и продолжают инкубацию еще в течение 15 мин. Ќа последних стади€х инкубировани€ добавл€ют фенилметансульфонилфторид / PMSF/ до конечной концентрации 5 мћ.
ћеченые мерозоиты выдел€ют из инкубационной смеси путем центрифугировани€ при 12000 g в течение 30 с и солюбилизируют в 1 мл смеси 2%-ного додецилсульфата натри€ /SDS/ и 1%-ного тритора X-100 в PBS, pH 7,0. Ќерастворимый материал удал€ют центрифугированием в течение 3 мин при 12000 g. –астворенные белки диализуют против 3 л PBS, pH 7,0, при 4oC, использу€ специальную отводную мембрану мол. массы 3,500 дл€ удалени€ любой остаточной радиоактивности/свободного125J/. ћеченные 125J белки/как правило включение метки составл€ет около 1,5 · 108 cpm на белок / до использовани€ хран€т при 4oC. –адиоактивность кислотонерастворимой фракции обычно составл€ет 95% от общей радиоактивности.
 роличью антисыворотку к фиксированным с помощью глутаральдегида мерозоитам получают следующим образом.
ѕримерно 1 · 1089 очищенных мерозоитов суспендируют в 1%-ном растворе глутаральдегида в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. ‘иксированные мерозоиты собирают центрифугированием при 2000 g в течение 5 мин, трижды отмывают в PBS и ресуспендируют в 1 мл PBS.  роликов породы "Ќовозеландские белые" множественно иммунизируют в кожу спины 0,5 мл раствора фиксированных мерозоитов, эмульгированных с 0,5 мл полного адьюванта ‘рейнда.  ролики получают две бустерные инъекции того же самого белка кокцидий в неполном адъюванте ‘рейнда с интервалом в две недели. „ерез две недели после последней бустерной инъекции у кроликов из ушной вены забирают кровь и получают сыворотку, содержащую антитела, в результате центрифугировани€ коагулированных образцов крови при 2500 g в течение 15 мин.
ќбразцы меченых белков дл€ иммунопреципитации /5 мл, 5 · 105cpm/ развод€т в 100 мл IP -буфера /0,25% NP - 40, 20 мћ Tris - HCl, pH, 7,5, 0,15 ћ NaCl/, предварительно очищают инкубированием на льду в течение 20 мин с 5 мг белка ј стафилококков /PansorbinTM, Calbiochem Corp., San Diego, CA/ и инкубируют в течение нескольких часов при 4oC с 5 - 10 мл сыворотки кролика, содержащей антитела к мерозоитам. јнтительные комплексы собирают в результате второй инкубации на льду с 5 мг белка ј стафилококков в течение 20 мин и центрифугировани€ в течение 15 с центрифуге "Ёппендорф". ќсадок 4 раза отмывают в IP - буфере и осажденные антителами мече ные белки элюируют из комплексов прогреванием при 100oC в течение 5 мин в буфере дл€ нанесени€ образцов, который используетс€ дл€ проведени€ электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS /65 мћ Tris, pH 6,8, 0,5%-ный SDS, 5%-ный β- меркаптоэтанол, 10%-ный глицерин, 0,1% -ный бромфеноловый синий/. Ёлектрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS/SDS-PAGE/ осуществл€ют как описано Laemmli/Nature 227:680, 1970/.
–езультаты, полученные при использовании кроличьей антисыворотки, подтверждают, использу€ иммунную сыворотку цыпл€т, полученную следующим образом.
÷ыпл€т иммунизируют в результате повторного инфицировани€ жизнеспособными спорулированными ооцистами E.tenella /100000 ооцист, три раза с 2-недельными интервалами/.  ровь собирают путем сердечной пункции и сыворотку, содержащую антитела, отдел€ют от коагулированного дебриса последующим центрифугированием при 2500 в течение 5 мин.
—равнительные исследовани€ заключаютс€ в том, что сыворотки кролика и цыпл€т, содержащие антитела к мерозоитам, используют дл€ иммунопреципитации меченных 125J поверхностных белков мерозоитов Eimeria и дл€ получени€ in vitro продуктов трансл€ции PHK мерозоитов, содержащей poly /A/. «атем преципитированные белки исследуют в SDS - PAGE и полученные результаты оценивают с помощью флуорографии при использовании стандартных реагентов по обычной методике.
Ёти исследовани€ показывают, что многие белки из обоих источников преципитируютс€ обеими сыворотками. “аким образом, кажда€ сыворотка может использоватьс€ дл€ вы€влени€ генетических рекомбинантов, экспрессирующих белки Eimeria. ƒл€ удобства первой дл€ описанного ниже скрининга используют сыворотку кролика, содержащую антитела к мерозитам. ќднако иммунную сыворотку цыпл€т используют дл€ параллельного скрининга библиотеки кƒЌ , как описано ниже. Ёто необходимо с целью идентификации белков, наиболее важных дл€ генерации иммунного ответа у инифицированных организмов, поскольку только у цыпл€т в сыворотке образуютс€ антитела в ответ на иммунонизацию живыми кокциди€ми. “олько у цыпл€т показана резистентность к таким организмам.
ƒл€ увеличени€ специфичности сыворотки кролика / содержащей антитела к мерозоитам/ по отношению к белкам Eimeria, сывороточные антитела выдел€ют, по-существу, как описано Hall et al/ /Nature, 311 : 379, 1984/. √овор€ кратко, антитела, специфичные к белку - предшественнику, экспрессированному с помощью рекомбинатного фагового клона /см. ниже/, выдел€ют из сыворотки кролика, взаимодействующей с антигенами мерозоитов, как описано ниже.
ѕоложительную культуру фага высевают на чашки с высокой плотностью и выращивают при 42oC в течение 3,5 ч. Ёкспрессию белка сли€ни€ индуцируют, накладыва€ на чашки нитроцеллюлозный фильтр, насыщенный 10 мћ изопропилтиогалактозидом /IPTG/, и инкубацию продолжают при 37oC в течение 6-8 ч. ‘ильтры с нанесенным антигеном отмывают в TBS /20мћ Tris - HCl, pH 8,0, 150 мћ NaCl / и инкубируют в течение 8-10 при 4oC с избытком сыворотки, содержащей антитела к мерозоитам, которую предварительно абсорбируют хоз€йскими бактери€ми E. coli. ‘ильтры трижды отмывают TBS дл€ удалени€ неспецифических антител.
јнтитела, специфически св€завшиес€ на фильтрах с белком сли€ни€, элюируют 2,0 мл 0,1ћ глицерина, pH 2,6, 0,15 ћ NaCl / 10 мин, 20oC/. Ёлюированные антитела немедленно нейтрализуют эквивалентным объемом 0,1 ћ Tris -HCl, pH 8,0/. ¬ыделенные антитела /далее называемые "антителами, отобранными антигеном"/ используют дл€ иммунопреципитации поверхностных меченых белков мерозоитов или полученных in vitro продуктов трансл€ции, а также в качестве проб дл€ ¬естерн - блоттинга тотальной белковой фракции мерозоитов.  онтрольную сыворотку получают с помощью нерекомбинатного фага, использу€ методику отбора антителом.
–езультаты ¬естерн-блоттинга и иммунопреципитации при использовании антител, отобранных антигеном, приведены на фиг.2.  артину иммунопреципитации меченых белков получают путем флуорографии, как описано Bonner et al. /Eur. J. Biochem, 46:83, 1974/. ÷ифры с правой стороны рисунков показывает положение белков - маркеров мол. массы, котора€ выражена в килодальтонах.
‘иг. 2ј показывает результаты иммуноблоттинга тотальной белковой фракции мерозоитов с контрольными антителами /а/ и антителами, отобранными антигеном /б/. Ќа фиг. 2 ¬ представлены результаты иммунопреципитации поверхностных белков мерозоитов, меченных 125J, с контрольными антителами /а/ и антителами, отобранными антигеном /б/.
¬ыделение м–Ќ  мерозоитов и ее трансл€ции in vitro
ќсадок замороженных мерозоитов, содержащий 1 · 109 - 1 · 1010 организмов, оттаивают в 10 мл TEL/SDS -буфера [0,2 ћ Tris-HCl, 0,1 M LiCl, 25 мћ Ёƒ“ј, 1% /вес на объем /SDS, pH 8,8], содержащего 1 мћ дитиотреитола /DTT/ и 300 единиц –Ќ азина /Promeda Biotec, Medison, WI/ и гомогенизируют 10-12 ударами в покрытом тефлоном гомогенизаторе дл€ измельчени€ тканей. Ќерастворимый дебрис отдел€ют центрифугированием на холоду при 3000 g. ∆идкий супернатант дважды экстрагируют смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт /24: 24:1, объем на объем/, которую уравновешивают TEL -буфером. ∆идкую фазу обрабатывают 100 мг/мл протеиназ  /37oC, 30 мин/, повторно экстрагируют эквивалентным объемом смеси фенол : хлороформ/1:1/ и осаждают нуклеиновую кислоту двум€ объемами этанола на сухом льду в течение 1 ч или в течение ночи при - 20oC. ќсадок, полученный в результате центрифугировани€ /1 ч, 10000 g ресуспендируют в TE -буфере/ 10 мћ Tris - HCl, pH 7,5, 2 мћ Ёƒ“ј/ и центрифугируют через подушку из 4 мл CsCl/ 5,7 ћ CsCl, 0,1 ћ Ёƒ“ј/ при 150000 g в течение 20 ч при 15oC. ќсадок –Ќ  повторно осаждают с помощью 0,2 ћ ацетата кали€ и 2,5 объемов этанола. “отальную –Ќ  пропускают через олиго-dT-целлюлозу дл€ получени€ poly (A+) PHK, как описано Maniatis /см. выше, с. 197/. ќбычно 1,9 мг тотальной –Ќ , полученной из 5 · 109 мерозоитов, содержит около 20 мкг poly (A+) PHK.
0,1 - 0,5 мкг м–Ќ  используют дл€ синтеза белка в услови€х in vitro с помощью обработанного нуклеазой лизата ретикулоцитов кролика /Amersham Corp. , Arlington Heigths, IL, USA или Promeda Biotec/ с добавлением 10-20 м и 35S-метионина на 20 мл реакционной смеси. ѕродукты трансл€ции in vitro анализируют методом иммунопреципитации после осуществлени€ SDS - PAGE и вы€вл€ют путем флуорографии, как описано выше. –езультаты исследований приведены на фиг. 2C.
Ќа фиг. 2C показана картина преципитации полной смеси белков, полученной при трансл€ции in vitro poly (A+)-PHK мерозоитов. Ќа лини€х b, a и d можно видеть продукты трансл€ции, преципитированные антителами, отобранными с помощью рекомбинатного клона 5-7 фага λ /см. ниже; этот клон экспрессирует ген, кодирующий у Eimeria белок - предшественник мол. массы 33 кƒа другого фагового клона, реагирующего с сывороткой, содержащей антитела к мерозоитам, а также с помощью нерекомбинатного клона dt 11 фага λ соответственно.
—ледует обратить внимание, что основной белок примерной мол. массы 33 кƒа виден на полосах a и b. Ётот белок не вы€вл€етс€ в тотальной белковой фракции мерозоитов, которую обрабатывают антителами, отобранными антигеном /фиг. 2ј, лини€ а/, однако белок мол. массы 23 кƒа здесь виден /фиг. 2ј лини€ b, отмечено стрелкой/. Ѕелок мол. массы 23 кƒа осаждаетс€ с помощью антител, отобранных антигеном, и из фракции белков мерозитов, меченных 125J /фиг. 2¬, лини€ b/. ѕолученные результаты позвол€ют предположить, что белок - предшественник мол. массы 33 кƒа может процессироватьс€ путем протеолитического расщепленни€ в поверхностный антиген мол. м 23 кƒа.
ѕолучение библиотеки кƒЌ  мерозоитов.
ƒвухцепочечную кƒЌ  синтезируют 6 мкг poly /A+/-–Ќ  мерозоитов, как описано Gubber et al. /Gene, 25 : 263, 1983/ обратную транскриптазу /BRL, Gaithersburg, MD, USA/, oligo (dT) - затравку, –Ќ азу H/BRL /и ƒЌ  - полимеразу E. coli /New England Biolabs, Beverly, MA, USA/ дл€ образовани€ комплементарной цепи. «атем на двухцепочечной кƒЌ  с помощью ƒЌ  - полимеразы “4 /BRL/ образуют тупые концы и после обработки метилазой EcoRI /New England Biolabs/ присоедин€ют EcoRI- линкеры /GGAATTCC, Collabarative Research Inc. Bedford, MA, USA/ согласно лабораторной методике.
ѕосле расщеплени€ EcoRi кƒЌ  франкционируют в Ѕиогеле ј-50ћ дл€ удалени€ избытка линкерных молекул и кƒЌ  меньшего размера, чем около 300 bp, как описано Huynh et al. /см. ниже/. «атем кƒЌ  концентрируют преципитацией с помощью этанола.
Ѕиблиотеку кƒЌ  конструируют в векторе λ gt11 /Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA/ как описано Huynh et al. под редакцией D. Glover /DNA Cloning, vol. I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., USA, pp. 49-78/. EcoRI- фрагменты кƒЌ  лигируют с расщепленной EcoRI и дефосфорилированной ƒЌ  λ t 11 /Stratagene Cloning Systems/ и образовавшуюс€ ƒЌ  упаковывают в фаговый вектор с помощью набора GigapacKTM /Stratagene Cloning Systems/ согласно лабораторной методике.
ѕолученную библиотеку амплифицируют, рассева€ фаг на хоз€йских клетках Y1088. ѕроцент рекомбинантов определ€ют по соотношению голубых и бесцветных бл€шек на чашках с X-gal /Maniatis, см. выше, p.24/ в присутствии изопропилтиогалактозида /IPTG, Sigma Chemical Co./. ќна составл€ет около 90%.
»ммунологический скрининг библиотеки кƒЌ .
Ѕактериофаг λ gt 11, содержащий библиотеку кƒЌ  мерозоитов, рассеивают на газон хоз€йских клеток Y1090 с плотностью около 10000 Ѕќ≈ λ gt 11 на чашку диаметром 150 мм. Ўесть таких чашек инкубируют 3,5 ч при 42oC, затем на чашки накладывают нитроцеллюлозные фильтры, предварительно смоченные в 10 мћ IPTG дл€ индуцировани€ экспрессии белка сли€ни€ β- -галактозидазы и еще раз инкубируют в течение 4-5 ч и более /иногда всю ночь/ при 37oC. ‘ильтраты удал€ют с чашек и несколько раз последовательно промывают в TBS /20 мћ Tris-HCl, pH 8,0, 0,15 ћ NaCl/. Ќеспецифические участки св€зывани€ белка блокируют инкубацией в 20%-ной эмбриональной тел€чьей сыворотке /FCS/ в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
«атем фильтры инкубируют в течение часа с кроличьей антисывороткой, содержащей антитела к мерозоитам, которую предварительно адсорбируют хоз€йскими клетками Y1090 и развод€т в соотношении 1:100 в TBS с 20% тел€чьей сыворотки. Ќеспецифические антитела удал€ют последовательным отмыванием в TBS /один раз в TBS, содержащем 0,1% NP-40/. «атем фильтры инкубируют с конюъгатом пероксидазы и антител козы к иммуноглобулинам кролика /BioRad, Richmond, CA/, разведенным в соотношении 1:1000 в TBS, содержащем эмбриональную сыворотку, в течение 1 ч при комнатной температуре. ÷ветна€ реакци€ развиваетс€ при добавлении 4-хлор-1-нафтола /BioRad/, как описано в соответствующей инструкции.
ƒл€ скрининга используют и сыворотку иммунных цыпл€т. “акую сыворотку предварительно адсорбируют клетками Y1090 и используют в том же самом разведении, что и сыворотку кролика. ¬ качестве вторых антител используют антитела кролика к иммуноглобулинам цыпл€т, а дл€ вы€влени€ антител - конъюгат пероксидазы с антителами козы к иммуноглобулинам кролика. ќтдельные бл€шки изолируют при второй процедуре скрининга, использу€ описанные выше реагенты.
ќдин клон, названный λ 5-7, экспрессируют белок, который с высокой аффинностью реагирует с антителами из сыворотки кролика. ¬торой изол€т, клон λ 1-5, идентифицированный с помощью иммунной сыворотки цыпл€т, достоверно содержит вставку кƒЌ  того же самого размера, что и клон 5-7. јнализ последовательностей ƒЌ  показывает, что эти фаговые клоны содержат гены, кодирующие один и тот же антиген мерозоитов.
Ёкспресси€ кƒЌ  клона λ 5-7 в E.coli.
¬ставку гена 1,1 кв изролируют из клона 5-7 с помощью рестриктазы EcoRI и электрофореза в агарозном геле /Maniatis et al., см. выше, pp. 157-170/. EcoRI - концы восстанавливают с помощью полимеразы  ленова в присутствии dATP и dTTP и к обеим концам присоедин€ют Bam HI-линкеры /GGGATCCC/. ћодифицированные фрагменты встраивают в каждый из трех векторов экспрессии pOS56/RBSII, pDS56/RBSII, -1 и pDS56/RBSII,-2 по сайту Bam HI. Ёти три вектора описаны ниже. ѕлазмидами, содержащими вставки в обеих возможных ориентаци€х, трансформируют штамм M 15 E.coli, несущий совместную плазмиду pDMI.1 [методика трансформации описана Mandel et al. /J.Mol. Biol, 53 : 159, 1970/] . Ўтамм M 15 E.coli, несущий плазмиды pDS56/RBSII и pDMI.1 описаны в за€вке на ≈вропейский ѕатент N 316695.
—троение плазмид.
¬ целом плазмиды pDS56/RBSII, -1 и -2 содержат регулируемые промоторно/операторный элемент N 250 SN 250P29 и сайты св€зывани€ рибосом RBSII, RBSII /-1/ и RBSII /-2/ соответственно. Ёти сайты св€зывани€ рибосом происход€т из сайта св€зывани€ рибосом промотора PG25 фага “5 E.coli /«а€вка на ≈вропейский ѕатент N 207459/ и получены с помощью технологии синтеза ƒЌ .
ƒл€ получени€ высокой эффективности экспрессии указанные выше плазмиды поддерживают в E.coli только в том случае, если промоторно /операторный элемент репрессирован св€зыванием lac - репрессора с оператором. Lac - репрессор кодируетс€ геном lac I. N 250SN 250P29 может быть эффективно репрессирован только, когда к клетках присутствует достаточное количество молекул репрессора. “аким образом используют аллель lac Ig, котора€ содержит мутантный промотор, ответственный за увеличение экспрессии гена, кодирующего репрессор. Ёта аллель lac Ig входит в состав плазмиды pDMI.1, как описано ниже.
ѕомимо гена lac I, плазмида pDMI. 1 содержит ген неомицинфосфонтрансферазы, который обеспечивает устойчивость бактерий к антибиотику канамицину и используетс€ в качестве селективного маркера. pDMI.1 совместима с плазмидами pDS56/RBSII, -1 и -2.  летки E.coli, которые трансформированы векторами экспрессии pDS56/RBSII, -1 и -2 должны содержать pDMI.1 дл€ того, чтобы обеспечить стабильность вектора экспрессии в клетках - хоз€евах. »ндукци€ системы вызываетс€ добавлением IPTG в питательную среду.
ѕлазмида pDS56/RBSII.
”часток плазмиды pDS56/RBSII, который находитс€ между рестрикционными сайтами расщеплени€ XbaI и XhoI и содержит область репликации и ген β- лактамазы /обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину/ /фиг. 4 и 5/, происходит из плазмиды pBR322 /Bolivar el al., Gene 2 : 95 - 113, 1977; Sutcliffe, cold Spring Xarbor Symp. Quant. Biol. 43 : 77 -90, 1979/. ќднако ген β- лактамаза модифицирован удалением сайтов расщеплени€ дл€ ферментов рестрикции Hinc II и Pst I. Ёти изменени€ последовательности ƒЌ  не вли€ют на аминокислотную последовательность β- лактамазы. ќстальные участки плазмиды содержит регулируемый промоторно /операторный элемент N 250PSOP29, следующий за сайтом св€зывани€ рибосом RBS II /который представл€ет собой часть EcoR I /Bam HI - фрагмента/, сайты расщеплени€ дл€ рестрикционных ферментов Sal I, Pst I и Hind III, терминатор фага λ E.coli /Schwarz et al., 272:410 - 414, 1978/, промотор свободного гена хлорамфениколацетилтрансферазы /Marcoli et al. , FEBS Letters, 110:11 - 14, 1980/ и терминатор T1 оперона rrn B.coli /Brosius et al., J. Mol. Biol., 148:107 -127, 1981/.
ѕлазмида p DS56/RBS II (-1).
ѕлазмида pDS56/RBS II (-1) /фиг. 6 и 7/ имеет такое же строение, как и плазмида pDS56/RBS II, но содержит сайт св€зывани€ рибосом RBS II (-1).
ѕлазмида pDS56/RBS II (-2).
ѕлазмида pDS56/RBS II (-2) /фиг. 8 и 9/ имеет такое же строение, как и плазмида pDS56/RBS II, но содержит сайт св€зывани€ рибосом RBS II (-2).
Ёти три плазмиды различаютс€ одним нуклеотидом, который следует за стартовым кодоном ATG и тем самым обеспечиваетс€ экспресси€ белка во всех трех возможных рамок считывани€.
ѕлазмида pDMI. 1
ѕлазмида pDMI. 1 /фиг. 10 и 11/ содержит ген неомицинфосфотрансферазы из транспозона Tn5 /Beck et al., Gene 19:327 - 336, 1982/, который обеспечивает устойчивость клеток E.coli к канамицину, и ген lac I /Farabough, Nature 274: 765 - 769, 1978/ с мутантным промотором If/Calos, Nature, 274:762 - 765, 1978/, кодирующий lac - репрессор. Ѕолее того, плазмида pDMI.1 содержит участок плазмиды pACYC184 /Chang and Cohen, J. Bacteriol, 134:1141 - 1156, 1978, который несет всю информацию, необходимую дл€ репликации и стабильного переноса в дочерние клетки.
—ледует понимать, что дл€ осуществлени€ данного эксперимента помимо указанных выше плазмид может быть использована люба€ друга€ подход€ща€ система экспрессии в E.coli.
“рансформированные бактерии выращивают при 37oC на среде LB /Maniatis et al., см. выше, p/ 68/ и экспрессию белка индуцируют добавлением в среду 1 мћ IPTG. ѕосле одночасовой инкубации собирают 1-мл образцы и клетки осаждают центрифугированием. ќсадок клеток обрабатывают, как описано Crowl et al., /см. выше/ и лизаты исследуют в SSS-PAGE. ѕосле окончани€ электрофореза белки в гел€х окрашивают  умасси €рко-синим или перенос€т на нитроцеллюлозные фильтры дл€ последующего ¬естерн - блоттинга /Towbin et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350, 1979; Burnetti, Anal. Biochem., 112:195, 1981/ при использовании кроличьей антисыворотки, содержащей антитела к мерозоитам, как описано выше.
–езультаты исследований показывают, что молекула к ƒЌ  1,2 кв в одной ориентации во всех трех рамках считывани€ кодирует белок, имеющий примерную мол. массу 33 кƒа /по данным SDS-PAGE/ и взаимодействующий с антисывороткой кролика, котора€ содержит антитела к мерозоитам.
јнализ последовательностей ƒЌ 
¬ целом, выделение плазмидной ƒЌ  в небольших объемах из 1 мл насыщенной ночной культуры бактерий осуществл€ют по методу Birnboim et al., Nucleic Acids Research, 7:1513, 1979/. ¬ результате можно получить небольшое количество ƒЌ  из бактериальной колонии дл€ аналитических целей. Ѕольшие количества плазмидной ƒЌ  получают из 1 о культур, следу€ стандартной методике, использу€ центрифугирование в градиенте плотности CsCl /Maniatis et al., см. выше. р. 93/.
ѕоследовательность ƒЌ  1,2 кв из вставки EcoRI кƒЌ  клона λ 5 - 7 определ€ют следующим образом: разрезают вставку EcoRI, очищают путем гельэлектрофореза и лигируют в расщепленную EcoRI плазмиду pEV-vrf, описанную Crowl et al. , /Gene, 38:31, 1985/. ѕолученную плазмиду обозначают как pEV/ 5-7 и используют дл€ амплификации вставки 1,2 кв кƒЌ  с целью проведени€ гибридизационного анализа /как описано выше/ и в предварительных экспериментах по определению последовательности ƒЌ , следу€ методу ZagursKy et al., /Gene Anal. Tech. 2:89, 1983/.
ƒл€ определени€ полной нуклеотидной последовательности ƒЌ  вставку 1,2 кв кƒЌ  в pEV/5-7 клонируют в одноцепочечном фаговом векторе M 13 mp 19, использу€ набор дл€ клонировани€ BIO-RADTM M 13 и набор дл€ секвенировани€ SEQUENASETM. ƒл€ расшифровки последовательности примен€ют метод терминации цепей, разработанной Sanger et al., /Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74:5463, 1977/, следу€ рекомендуемой методике, котора€ прилагаетс€ к набору SEQUENASETM /United States Biochemical Corp., Cleveland OH, USA/.
ѕолна€ нуклеотидна€ последовательность молекулы кƒЌ  1,2 кв из pEV/5-7, включа€ 5' и 3' нетранслируемые области, показана на фиг. 1.
ѕоследовательность кƒЌ , предполагающа€ открытую рамку считывани€ с кодона ATG в 68 положении до стоп - кодона TGA в положении 1013 и кодирующа€ 315 аминокислотных остатков, приведена на фиг.1
ѕредлагаемый размер белка /33, 375D/, который кодируетс€ этой последовательностью, соответствует размеру белкового продукта, полученного при трансл€ции in vitro м–Ќ  мерозоитов и осаждаемого антителами, отобранными антигеном /см. фиг. 2 C, линию a/, а также размеру белка, который образуетс€ при экспрессии кƒЌ  векторами.
јнализ подсказанной аминокислотной последовательности белка, кодируемого вставкой кƒЌ  λ 5-7 /фиг. 1/, показывает, что в зависимости от алгоритма, который был использован дл€ предсказани€ последовательности, первые 20 /или от 75-го до 95-го/ амино-концевых аминокислотных остатков имеют сильные гидрофобные свойства. Ёто позвол€ет предложить, что они могут кодировать сигнальный пептид. “аким образом, последовательность сигнального пептида веро€тно состоит из амино-концевых аминокислотных остатков, наход€щихс€ в пределах первых ста аминокислот всей последовательности кƒЌ  λ 5-7. Ёто подтверждаетс€ тем фактом, что полипептид, полученный в результате трансл€ции in vitro м–Ќ  мерозоитов и очищенный методом иммунопреципитации имеет мол. массу около 35 кƒа в форме предшественника и около 23 кƒа в форме зрелого белка.  ак отмечалось выше, размер белка-предшественника хорошо согласуетс€ с теоретическими размерами белка. ќднако зрелый может, кроме того, представл€ть собой внутренний или N-концевой фрагмент молекулы предшественника. “очно определить терминальные аминокислоты можно известными методами.
ƒл€ многих участков полипептида с данной аминокислотной последовательностью можно определить области эпитопов, использу€ комбинированный подход, основанный на критерии гидрофильности согласно J.P. Hopp и K/R/ Woods /Proc, Natl. Acad. Sci, USA, 78:3824 - 3828, 1981/ и критерии вторичной структуры согласно P.Y.Chou и G.D.Fasman /Advances in Enzymology, 47:45 - 148, 1987/.
—ледующие участки содержат возможные эпитопы, распознаваемые антителами:
S79 - V86 (SEQ ID NO:3)
C95 - K123 (SEQ ID NO:4)
P137 - V139 (SEQ ID NO:5)
R147 - F152 (SEQ ID NO:6)
N155 - E162 (SEQ ID NO:7)
R169 - E173 (SEQ ID NO:8)
T181 - E186 (SEQ ID NO:9)
Q196 - G225 (SEQ ID NO:10)
T239 - G243 (SEQ ID NO:11)
T252 - G256 (SEQ ID NO:12)
A265 - K269 (SEQ ID NO:13)
D276 - K289 (SEQ ID NO:14)
T298 - E315 (SEQ ID NO:15)
ƒополнительно, “-клеточные эпитопы можно установить путем теоретических обоснований, использу€ критерий амфифильности, разработанный BerzofsKy /Good et al. , Science, 235, 1059 - 1062, 1987/. “-клеточные эпитопы образуютс€ в результате процессинга антигенов /H.M. Grey and Chestnut, Immunol. Today, 6 : 101 - 106, 1985/, перенос€тс€ внутрь клеток /Schwartz A.L., Ann. Rev. Immun., 8 : 195 - 229, 1990/ и распознаютс€ T-клеточным рецепторным комплексом. ’от€ некоторые алгоритма использовались главным образом дл€ идентификации антигенных сайтов класса II, из-за сходства пептидных взаимодействий классов II и I они, по-видимому, могут быть полезны и дл€ идентификации пептидных мишеней дл€ цитотоксических T-лимфоцитов /Feller и de la Cruz, Nature, 349 : 720 - 721, 1991/.
ƒополнительно был установлен потенциальный сайт гликозилировани€, локализованный в области расположени€ двадцатой аминокислоты, а именно аспарагина /D20/.  ак известно, углеводородные группы определ€ют важные биологические свойства, например конформационную стабильность, устойчивость к протеазам, зар€д и способность св€зывать воду. ќднако следует заметить, что D20 €вл€етс€ частью лидерной последовательности и таким образом может отсутствовать в зрелом белке. ƒл€ наиболее полного ознакомлени€ с работами, показывающими важную роль углеводородных групп в процессах биологического распознавани€, см. обзор J.C.Paulson, TIBS, 14 : 272 - 276, 1989.
√ибридизационный анализ.
ƒЌ  изолируют из спорулированных ооцист (у которых предварительно удал€ют цисты/ после их обработки трипсином и желчью и отмыванием в PBS, как описано ниже.
ћатериал, содержащий ооцисты /примерно 1·109 ооцист/ суспендируют в 20 мл 0,5 ћ Ёƒ“ј, pH 8,0 и 0,5% саркозила (Sigma, St. Louis, MO, USA), обрабатывают протеиназой K (Boehringer-Mannheim, FRG) в дозе 1 мг/мл при 50oC в течение 2 ч, затем –Ќ азой (10 мг/мл) 1 ч при 37oC и снова протеиназой K 1 ч при 50oC. Ѕелок удал€ют двум€ экстракци€ми фенолом, насыщенным 20 мћ Tris-HCl, pH 7,5 и 1 мћ Ёƒ“ј /“≈/ и одной экстракцией смесью фенол-хлороформ /1: 1/. ¬одную фазу диализуют против большого объема “≈ и концентрируют, осажда€ этанолом. ¬ыход ƒЌ  обычно составл€ет 0,4 мг га 1 · 106 ооцист.
ѕаразитарную ƒЌ  расщепл€ют различными рестрикционными эндонуклеазами по обычной лабораторной методике и полученные фрагменты ƒЌ  разгон€ют путем электрофореза в 0,8%-ной агарозе /40 ¬, 2,5 ч/ в буфере Ћенинга /4,7 г NaH2PO4, 4,36 г трис-основани€, 0,372 г Na2 Ёƒ“ј на 1 л, pH 7,6/. «атем гель обрабатывают 0,25 ћ HCl в течение 30 мин и перенос€т на специальный фильтр (Zeta-Probe, BIO - RADTM/ в 0,4 ћ NaOH в течение ночи. ƒалее фильтрат нейтрализуют раствором 2X SSC (pH 6,8) и высушивают при 80oC в течение 1 ч под вакуумом.
‘ильтр предгибридизируют в течение 3 ч при 65oC в буфере, содержащем 7% SDS, 1% BSA /Bochringer, фракци€ V/, 0,5 ћ NaHPO4, pH 7,2. ¬ставку кƒЌ  EcoRI - гена 5-7 выдел€ют с помощью расщеплени€ EcoRI из плазмиды pEV/5-7, разгон€ют путем электрофореза в агарозном геле и мет€т путем случайного праймировани€ с помощью фрагмента  ленова в присутствии дезоксинуклеотидов, содержащих 32P. ћеченую вставку освобождают от невключившихс€ нуклеотидов путем центрифугировани€ через колонку /BIO-RAD/, денатурируют и добавл€ют к раствору дл€ гибридизации. ѕосле инкубации в течение 12 ч при 65oC фильтры трижды отмывают раствором 2x SSC/0,1%SDS и дважды - раствором 0,1 х SSC/0,1%SDS при 65oC. √еномные фрагменты ƒЌ , гибридизированные с пробой, определ€ют путем авторадиографии. ’от€ авторы изобретени€ используют плазмиду pEV/5-7, пон€тно, что соответствующим образом может быть применен и любой другой эквивалентный вектор, содержащий вставку 1,2 кв кƒЌ  λ 5-7 мерозоитов.
–езультаты исследований приведены на фиг. 3, где можно видеть картину, полученную при расщеплении геномной ƒЌ  спорулированных ооцист рестриктазами Pvu II(1), Hinc II(2), Pst I(3), Sph I(4) или Sac I(5).
√еномные фрагменты ƒЌ  6,5 и 3,6 кв определ€ют после расщеплени€ с помощью Pvu II и Cac I /линии 1 и 5 соответственно/. ѕоскольку в клоне кƒЌ  нет сайтов рестрикции дл€ этих ферментов, максимальный размер гена Eimeria предположительно оцениваетс€ в 3,6 кв.
ѕосле расщеплени€ с помощью Pst I /лини€ 3/ определ€ют три фрагмента. ƒва Pst I - сайта, предсказанные на основе последовательности кƒЌ , могут обеспечить расщепление с образованием внутреннего фрагмента 306 в. р. /слишком маленького, чтобы быть обнаруженным в этом —аузерн - блоттинге/ и два соединительных фрагмента. ѕо€вление третьего большого Pst I - фрагмента наилучшим образом объ€сн€етс€ наличием интрона, локализованного между внутренними Pst I - сайтами.
Ќабор фрагментов, образуемый при расщеплении Sph I /лини€ 4/, котора€ также имеет два сайта рестрикции в кƒЌ , не дает определенной информации. Ќебольшой внутренний Sph I - фрагмент 640 в.р., предсказанный на основе последовательности кƒЌ , не может быть определен в этом геле.
–асщепление ƒЌ  с помощью Eco RI приводит к образованию геномного фрагмента 1,2 кв, соответствующего по размеру фрагменту кƒЌ . ƒвойное расщепление Hinc II и Eco RI приводит к образованию фрагмента 0,9 кв /не показан/.
ѕри Ќозерн - блоттинге /Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 : 5350, 1970/ содержащей poly /A/ м –Ќ  мерозоитов 1,2 кв. фрагмент кƒЌ  гена λ 5-7 гибридизируют с одноцепочечной м –Ќ  на прот€жении примерно 1,3 кв. Ќа основании коррел€ции размеров €сно, что 5-7 клон, вместе с 5'-последовательностью из упоминаемого выше изол€та I - 5 соответствует полной прот€женности последовательности к ƒЌ  с возможным исключением крайних 5 - нуклеотидов.
ѕример 2. — целью разработки наиболее эффективного пути иммунизации цыпл€т антигеном 5-7 мерозоитов E. tenella 1,2 кв ƒЌ , описанную выше, клонируют в вирусе вакцины. ѕолученный таким образом рекомбинантный вирус вакцины используют в качестве субъединичной кокцидиозной вакцины дл€ иммунизации цыпл€т.
 онструирование вектора.
¬се используемые формы рекомбинантного вируса вакцины /rVV/ основаны на гомологичной рекомбинации в локусе вирусной тимидинкиназы /“ /, как описано Macket et al., /Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79 : 7415, 1982/. “ -локус был квартирован в Hind III J - фрагменте вируса вакцины /VV/ /Hruby et al., J. Virol. , 43 : 403, 1982/ и часть этого фрагмента секвенирована /Weir et al., J. Virol., 46: 530, 1983/.
 онструкци€ вектора дл€ рекомбинанта pVC8 - “  - 7.5  подробно описана в за€вке на ≈вропейский ѕатент N 344808.  ратко говор€, вектор содержит основную часть плазмиды pVC8, несущую “ -ген вируса вакцины, разорванный промотором 7.5  VV /Venkatesan et al., Cell, 25 : 805, 1981/. ¬ области направлени€ транскрипции перед промотором конструируют множественный клонирующий сайт, чтобы обеспечить встраивание экспрессируемого гена. Ќа фиг. 12 показано схематическое изображение плазмиды pVC8 - “  - 7.5 .
ƒл€ создани€ конструкции Eco RI - фрагмент, кодирующий антиген мерозоитов 5-7, клонируют в полилинкерном Eco RI - сайте основного вектора, показанного на фиг.12.  онструкции, содержащие фрагмент в соответствующей ориентации, размножают и модифицируют, как описано ниже, чтобы делетировать наход€щийс€ внутри рамки считывани€ стартовый кодон, расположенный на 97 нуклеотидов выше от природного стартового кодона в 5-7 гене микрозоитов. — этой целью плазмиду расщепл€ют рестриктазами Sma I и Bgl II. ѕосле создани€ в сайте Bgl II тупых концов с помощью фрагмента  ленова в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидов плазмиду повторно лигируют в конструкцию pR3 /фиг. 13/, несущую ожидаемую делецию, размножают и используют дл€ рекомбинации с вирусом вакцины. Ќа фиг. 14 приведена полна€ последовательность этой рекомбинантной плазмиды.
 роме того, 5-7 ген мерозоитов встраивают в вектор дл€ рекомбинации, который содержит лидерную последовательность Dral - Hind III мал€рийного антигена. Ётот вектор, описанный в за€вке на ≈вропейский ѕатент N 344808, создан на основе вектора pVC8 - “  - 7.5 , но в дополнение перед промотором 7.5  содержит последовательность мал€рийного антигена /190 кƒа/. ¬ области, смежной с этой последовательностью, конструируют множественный сайт дл€ клонировани€, чтобы встраивать ген, который необходимо экспрессировать. ¬ результате образующийс€ с промотора 7.5 VV транскрипт может транслироватьс€ с образованием белка, который на N - конце содержит лидерную последовательность мал€рийного антигена /190 кƒа/. In vivo в результате процессинга при расщеплении сайта лидерной последовательности образуетс€ белок. Ќа фиг. 15 приведено схематическое изображение конструкции pR4, несущей 5-7 ген мерозоитов.
 онструирование рекомбинантного вируса вакцины.
 летки CV1, высе€нные на культуральные чашки площадью 8 см2, адаптируют к росту при 33oC и выращенные до состо€ни€ моносло€ на 80-90% инфицируют температурочувствительным мутантом вируса вакцины tsN7 в дозе 0,1 бл€шкообразующей единицы /Ѕќ≈/ на клетку /Drillen, R. and Spehner, D., Virology, 131 : 385 - 393, 1983/. ѕосле двух часов инкубации при пермессивной температуре /33oC/ в CO2 - термостате /Kieny et al., Nature, 312 : 163, 1984/ клетки трансфицируют 0,25 мл кальций-фосфатного преципитата ƒЌ , как описано Weir et al. /Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79 : 1210 - 1214, 1982/.  альций-фосфатный преципитат ƒЌ  имеет следующий состав: 0,8% NaCl, 0,038% KCl, 0,0134 ћ Na2HPO4 · 2 H2O, 0,1% глюкозы, pH 7,0, 125 мћ CaCl2, а также 200 нг ƒЌ  вируса вакцины дикого типа /штамм WR/ и 100 нг подход€щей рекомбинантной плазмиды pR3 или pR4. „ерез 1 ч инкубации при комнатной температуре в чашки внос€т дополнительную среду и инкубируют их в течение 2 ч при 39,5oC в атмосфере 5%-ного CO2. ѕри этой температуре tsN 7 вирус не может реплицироватьс€ и в результате происходит селекци€ вирусов, которые имеют рекомбинацию по крайней мере в локусе ts 7.
ѕосле инкубации в течение двух дней при 39,5oC клетки соскабливают с чашек и суспензию обрабатывают ультразвуком. Ётот гомогенат затем используют дл€ получени€ “ -негативного /“ -/ вируса путем титровани€ на “ --клетках человека 143 в присутствии 30 мкг/мл бромдезоксиуридина /BUdR/. Ѕл€шки собирают и вирус очищают из бл€шек путем двухкратного посева и последующего отбора бл€шек на “ --клетках человека 143 в присутствии 30 мкг/мл BUdR. —обранный вирус затем помещают на CV1 - клетки в отсутствии BUdR. –екомбинантный вирус вакцины R3.2 и R4.1 соответственно идентифицируют по наличию гена мерозоитов /1.2 кв кƒЌ / в составе “ -гена, расщепл€€ вирусную ƒЌ  рестриктазой Hind III и сравнива€ образец rVV ƒЌ  с образцом ƒЌ  вируса вакцины дикого типа, обработанной тем же самым ферментом. ≈сли рекомбинаци€ произошла, после электрофореза в 1%-ном агарозном геле положение фрагмента ƒЌ  J Hind III должно быть изменен. Ёто и наблюдаетс€ в действительности. »зменение коррелирует с вычисленными данными, полученными методом дедукции исход€ из размеров вставки.
“ест на экспрессию.
ƒл€ тестировани€ экспрессии 5-7 антигена мерозоитов рекомбинантным вирусом клетки CV1 инфицируют как rVV R3.2, так и rVV R4.1 и собирают через 48 ч. ѕосле центрифугировани€ клеток осадок солюбилизируют в буфере Ћэммли дл€ нанесени€ образцов /Nature, 227 : 680, 1970/ в присутствии β- меркаптоэтанола как редуцирующего агента. ѕосле кип€чени€ в течение 5 мин образцы нанос€т на пластину с 12,5%-ным полиакриламидным гелем, содержащем SDS. ѕосле электрофоретического разделени€ белки перенос€т на нитроцеллюлозные фильтры /Trans-Blot, BIO-RAD/ в буфере дл€ блоттинга, содержащем 25 мћ Tris-HCl, 0,19 ћ глицина, pH 8,3, и 20% /объем на объем/ метанола при посто€нном напр€жении 80 ¬ в специальной камере дл€ блоттинга /Transblot transfer cell, BIO-RAD Laboratories/ в течение 2 ч при 4oC /Towbin et al., Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 76 : 4350 - 4354, 1979/.
ƒл€ иммунологического определени€ нитроцеллюлозные фильтры предварительно обрабатывают 5%-ным нежирным сухим молоком в TBS (20 мћ Tris-HCl, 150 мћ NaCl, довод€т до pH 8/ в течение 45 мин и инкубируют 2 ч или ночь при комнатной температуре с разделенной 1 : 50 кроличьей сывороткой, содержащей антитела к E.tenella. —ыворотку развод€т в TBS-буфера, в который добавлена эмбриональна€ тел€чь€ сыворотка /20%, объем на объем/. «атем фильтры три раза по 10 мин отмывают в TBS, содержащем 0,1% NP-40 и далее инкубируют 2 ч при комнатной температуре с аффинно-очищенными IgG козы к антителам кролика /H + L/, конъюгированными с пероксидазой /BIO-RAD/ в разведении 1 : 1000 в TBS с добавлением 5%-ного нежирного сухого молока /H + l обозначают т€желые и легкие цепи IgG/. «атем блоты трижды отмывают, как описано выше. —в€зывание пероксидазного конъюгата вы€вл€ют, обрабатыва€ фильтры 0,018%-ным 4-хлоро-1-нафтолом в 6%-ном метаноле в H2O и 0,02%-ной /объем на объем/ H2O2. –еакцию останавливают, отмыва€ блок в избытке H2O.
ќбнаружено, что сыворотка кролика, содержаща€ антитела к мерозоитам E. tenella, в реакции ¬естерн-блоттинга /Towbin et al., см. выше/ взаимодействует с CV1-клетками, инфицированными rVVR3.2, причем с двум€ отдельными белками мол.массы 33 и 23 кƒа соответственно. ¬ качестве контрол€ используют предварительно окрашенные низкомолекул€рные стандарты дл€ проведени€ SDS-PAGE фирмы BIO-RAD. CV1-клетки, зараженные вирусом вакцины дикого типа /WR/, не реагируют с кроличьей сывороткой, содержащей антитела к мерозоитам E. tenella. –азмер белка мол.массы 33 кƒа коррелирует с теоретически ожидаемыми равзмерами белка-предшественника, как показано на фиг. 2 C /лини€ b/. Ѕелок меньшего размера мол.массы 23 кƒа может обрабатыватьс€ в результате процессинга белка-предшественника, указанного выше, и его можно видеть в составе поверхностных белков мерозоитов /фиг. 2A и 2B, лини€ b/. —ходные результаты получены и при использовании клеток CV1, инфицированных rVVR4.1.
ƒополнительно моет быть показано путем ¬естерн-блоттинга, что иммунна€ сыворотка цыпл€т, инфицированых спорулированными ооцистами E.tenella, распознает 5-7 белки мерозоитов /33 кƒа и 23 кƒа/, экспрессируемые CV1-клетками, которые были инфицированы рекомбинантными вирусами вакцины R3.2 и R4.1 соответственно.
ѕолучение вируса.
¬ирус вакцины дикого типа (WR) размножаетс€ практически в клетках любого типа /Drillen et al., Virology, 28 : 843, 1978/ и это можно вы€вить непосредственно по образованию бл€шек. ¬ большинстве случаев дл€ получени€ большого количества вирусов авторы используют клетки CV1.
ƒл€ заражени€ вирусом с клеток CV1, выращиваемых в культуральных флаконах объемом 175 см2 /например Falcon 3028/ и на 80-90% достигших состо€ни€ моносло€, сливают культуральную среду и клетки инкубируют в растворе PBS, содержащем вирус /0,1 Ѕќ≈/мл, 0,01 мл/см2/, в течение 1 ч при комнатной температуре /20oC/. «атем добавл€ют свежую культуральную среду /0,2 мл/см2/ и флаконы инкубируют при 37oC в течение 2-3 дней, пока степень лизиса клеток не достигнет 80%. ѕолученный вирусосодежащий материал хран€т непосредственно с клетками или культуральной средой в первоначально используемых культуральных флаконах при -30oC до очистки вируса.
ƒальнейшую очистку провод€т дл€ получени€ вирусного препарата, свободного от специфических компонентов хоз€йских клеток. »нфицированные клеточные культуры, которые хранились при -30oC, оттаивают и оставшиес€ клетки снимают с поверхности флаконов потр€хиванием или соскабливанием.  летки и вирусы отдел€ют от среды центрифугированием /центрифуга Sorvall, ротор GSA/ при 5000 об/мин и 10oC. ќсадок клеток с вирусными частицами ресуспендируют в TBS /10-20х объем осадка/ и центрифугируют, как описано выше. «атем осадок ресуспендирут в 10-кратном объеме RSB-буфера /10 мћ Tris-HCl, доведенный до pH 8,0, 10 мћ KCl, 1 Mg Cl2/.
ƒл€ лизиса оставшихс€ интактных клеток и высвобождени€ из них вируса, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком /дважды, 10 с при 60 ¬т при комнатной температуре в ультразвуковом дезинтеграторе, например Labsonic 1510 с 4 мм-зондом. —месь затем центрифугируют в центрифуге типа Sorvall, ротор GSA, в течение 3 мин при 3000 об/мин и 10oC. “аким образом получают суспензию вируса, свободную от клеточных €дер и крупных "обломков" клеток. —упернатант осторожно удал€ют, осадок ресуспендируют в RSB-буфере, обрабатывают ультразвуком и центрифугируют как описано выше.
ѕервый супернатант объедин€ют со вторым, наслаивают на 10 мл 35%-ной сахарозной подушки /в 10 мћ Tris-HCl, pH 8,0/ и центрируют в течение 90 мин при 14000 об/мин, использу€ ротор Beckman SW27, при 10oC. —упернатант сливают и осадок вирусных частиц ресуспендируют в 10 мл 10 мћ Tris-HCl, pH 8,0, обрабатывают ультразвуком дл€ гомогенизации /дважды, в течение 10 с при комнатной температуре как описано выше/ и наслаивают на ступенчатый градиент дл€ дальнейшей очистки.
—тупенчатый градиент содержит 5 мл-аликвоты сахарозы в 10 мћ Tris-HCl, pH 8,0, в следующих концентраци€х: 20%, 25%, 30%, 35% и 40%. √радиент центрифугируют, использу€ ротор Beckman SW27 в течение 35 мин при 14000 об/мин и 10oC. ¬ области 30-40%-ного градиента можно видеть несколько зон /полос/, содержащих вирусные частицы. Ётот участок градиента извлекают, развод€т в PBS и осаждают вирусные частицы центрифугированием /ротор Beckman SW 27/ в течение 90 мин при 14000 об/мин и 10oC. ќсадок, содержащий практически исключительно вирусные частицы, ресуспендируют в PBS, чтобы концентраци€ вируса примерно составила 0,5 - 1 · 1011 Ѕќ≈/мл. ѕолученный вирус используют в этой концентрации или дополнительно развод€т в PBS.
ƒл€ определени€ концентрации и очистки собранного вируса используют два метода. јбсолютную концентрацию вирусных частиц определ€ют, измер€€ оптическую плотность /OD/ вируссодержащего материала на спектрофотометре при длине волны 260 нм /OD260/. ѕри этом 1 OD260 соответствует концентрации вируса около 1,2 · 1010 частиц в 1 мл /Joklik, Virology, 18 : 9, 1962/.  роме того, концентрацию вируса определ€ют по титрованию на клеточной культуре /метод бл€шек/, полага€, что только одна из 60 вирусных частиц способна инфицировать клетку.
— целью титровани€ вируса на культуре клеток, фибробласты куриных эмбрионов /CEF/ высевают на специальные чашки площадью 8 см2 /Falcon 3001/ с добавлением питательной среды дл€ культивировани€ клеток. ѕосле того, как клетки достигнут состо€ни€ моносло€ на 80-90%, среду удал€ют, замен€ют на 0,2 мл на разведенного в PBS вируссодержащего материала и оставл€ют на 1 ч при комнатной температуре. √отов€т дес€тикратные разведени€ вируссодержащего материала. ¬ каждую чашку внос€т 2 мл полужидкой среды дл€ культивировани€ клеток, содержащей 1% агарозы, и чашки оставл€ют на 16-24 в CO2-термостате при 37oC. «атем 2 мл полужидкой среды дл€ культивировани€ клеток, содержащей 0,2% нейтрального красного, наслаивают на чашки дл€ окрашивани€ живых клеток и чашки инкубируют дополнительно в течение 16-24 ч. Ѕесцветные бл€шки далее подсчитывают под микроскопом.
ѕример 3.
»ммунизаци€ цыпл€т.
„тобы определить, способен ли вектор rVV-R 3.2 вируса вакцины, несущий ген 5-7 мерозоитов, защитить цыпл€т при последующем введении спорулированных ооцист патогенного штамма E.tenella, провод€т следующую вакцинацию.
ѕетушков породы WARREN, полученных на инкубаторной станции E.Wuethrich /Ѕелп, Ўвейцари€/ выдерживают в клетках с проволочным полом на производственной диете дл€ выращивани€ бройлеров, преимущественно состо€щей из кукурузы, пшеницы и соевых бобов. Ќа 17-й день цыпл€там инокулируют 3 · 108 Ѕќ≈ рекомбинантного вируса вакцины R3.2 в 100 мкл PBS, в то врем€ как другие 50 мкл инъецируют подкожно в область перепонки крыла и еще 50 мкл ввод€т в мышцы груди. Ёти процедуры осуществл€ют дважды с интервалам в одну неделю, но в одной группе последнюю инъекцию вируса замен€ют на оральное введение 5000 спорулированных ооцист вирулентного штамма E.tenella /например T7 - 776/21/, чтобы стимулировать естественный контакт цыпл€т с инфекционными кокциди€ми в полевых услови€х. „ерез неделю после последней иммунизации у всех цыпл€т отбирают кровь дл€ анализа и еще через неделю /45-ый день птицам ввод€т 50000 спорулированных ооцист E. tenella /например штамм T7 - 776/21/. ѕаразитические простейшие заканчивают цикл развити€ в течение 7 дней и на 52-й день у цыпл€т отбирают кровь, затем их умерщвл€ют и вскрывают. ”дал€ют инфицированную слепую кишку, подсчитывают повреждени€, вызванные развитием паразитов, и ткань кишки гомогенизируют, чтобы определить количество ооцист. Ѕолее того, оценивают качество цыпл€т /ежедневную прибавку веса и потребление пищи/.
Ёксперименты по защите цыпл€т.
ƒанные, приведенные в таблице, €сно показывают, что вакцинаци€ рекомбинантным вирусом вакцины R3.2 оказывает значительный защитный эффект против т€желой кокцидиальной инфекции.  оличество повреждений уменьшаетс€ на 18%, а содержание ооцист в слепой кишке на 35% по сравнению с инфицированным контролем.  ачество цыпл€т - наиболее важный экономический параметр - улучшаетс€ на 62% дл€ ежедневной прибавки веса и на 56% дл€ потреблени€ пищи. ќднако, когда последнюю вирусную инъекцию замен€ют на введение ооцист /слаба€ кокцидиальна€ инфекци€/, защита цыпл€т от кокцидиаза становитс€ практически полной.  ачество таких цыпл€т эквивалентно контрольным неинфицированным птицам, а количество повреждений, так же как и ооцист в слепой кишке, очень невелико. “ак как одна инокул€ци€ E.tenella никогда не показывала такую высокую степень защиты, авторы заключают, что вакцинаци€, основанна€ на использовании вируса, очень сильно праймирует иммунную систему цыпл€т, так что последующа€ слаба€ кокцидиальна€ инфекци€ может про€вить бустерный эффект и в результате достигаетс€ эффективна€ иммунна€ защита от кокцидиоза.
√уморальный статус цыпл€т.
√уморальный статус цыпл€т анализируют непр€мым ELISA и в дальнейшем используют ¬естерн-блоттинг.
¬естерн-блоттинг провод€т, как описано выше, за исключением того, что осуществл€ют одну дополнительную инкубацию до исследовани€ образцов сыворотки цыпл€т. Ёта дополнительна€ инкубаци€ заключаетс€ в том, что фильтры обрабатывают гипериммунной сывороткой кролика, содержащей антитела к вирусу вакцины /2 ч при комнатной температуре, разведение 1 : 50/ дл€ блокировани€ всех специфических вирусных белков.
ƒл€ непр€мого ELISA используют третью генерацию мерозоитов E.tenella, полученных при культивировании в услови€х in vitro на культуре клеток почки цыпл€т. ¬ каждую лунку панелей дл€ микротитровани€ внос€т 3000 мерозоитов, растворенных в 100 мл натрий-карбонатно-бикарбонатного буфера /pH 9,6/ и инкубируют в течение ночи при 4oC. ѕанели трижды отмывали деионизированной водой и заполн€ют 200 мл блокирующего буфера /0,1 ћ Na2HPO4, pH довод€т до 6,5 с помощью HCl, 1% BSA 0,5 г/л этилмеркуриттиосалицилата натри€/. Ѕлокирование провод€т в течение ночи при 4oC. ќт каждого цыпленка тестируют два образца сыворотки. ќдин образец отбирают неделю спуст€ после последней иммунизации, второй - сразу же перед умерщвлением. √отов€т последовательные двухкратные разведени€ образцов в PBS, содержащем 3%-ное сухое молоко, начина€ с разведени€ 1 : 50. »нкубирование продолжают в течение 4 ч при 37oC /100 мл/. ѕанели отмывают, как описано выше, затем добавл€ют 100 мл на лунку конъюгата антител козы к Ig(H + L) цыпл€т, меченного пероксидазой /1 : 2000 в PBS, содержащем 3%-ное сухое молоко/. ѕанели инкубируют при 37oC 2 ч.  омплексы антиген - антитело вы€вл€ют добавлением 100 мл “ћ¬-субстрата. “ћ¬-субстрат состоит из одной части “ћ¬ /0,24 г тетраметилбензидина, растворенного в 5 мл ацетона и доведенного до 50 мл метанолом/ и 20 частей субстрата /0,2 ћ лимонна€ кислота, pH 4,0, 275 мл/л 30%-ной H2O2/.
–еакцию останавливают 0,5 ћ H2O2 до того, как учитывают результаты реакции с помощью ELISA-ридера (Titertek Multiskan MCC/340, Flow Laboratories) при 450 нм.
ѕосле вакцинации цыпл€т рекомбинантными вирусами R3.2 и R4.1, по сравнению с контрольными птицами, иммунизированными низкими дозами спорулированных ооцист, ответное образование антител к мерозоитам кокцидий наблюдаетс€ только в течение недели. —редний титр антител в эксперименте составл€ет 1 : 100, а в контроле - более 1 : 1600. Ёто позвол€ет предположить, что эффективна€ защита и хорошее качество вакцинированных цыпл€т /см. таблицу и обсуждаемые выше результаты/ обеспечиваютс€ эффективными механизмами клеточно-опосредованного иммунитета.
„тобы подтвердить образование специфических антител к антигену мерозоитов 5-7, образцы крови с наивысшим титром антител в ELISA тестируют методом ¬естерн-блоттинга, использу€ CV1-клетки, инфицированные rVV3.2 как источником антигена. —ыворотка распознает два белка мол.массы 33 и 23 кƒа соответственно, показыва€ что произошла успешна€ иммунизаци€.
—пециалистам, работающим в этой области, €сно, что на практике могут быть применены различные варианты и модификации данного изобретени€, не измен€ющие его сущности.
¬ приведенных в материалах за€вки примерах насто€щее изобретение описано лишь с целью иллюстрации и изобретение ограничиваетс€ только объемом прит€заний, выраженным далее в формуле изобретени€.
 ратка€ характеристика последовательностей
(1) ќсновные данные:
(i) «а€витель:
(A) Ќазвание фирмы: F. HOFFMANN-LA ROCHE, AG
(B) ”лица: √ренцахерштрассе 124
(C) √ород: Ѕазель
( )  антон: Ѕазель
(E) —трана: Ўвейцари€
(F) ѕочтовый код: CH-4002
( ) “елефон: 061-688 24 03
(H) “елефакс: 061-688 13 95
(I) “елекс: 962292/965542
(ii) Ќазвание изобретени€: вакцина против кокцидиоза
(iii)  оличество последовательностей: 15
(iv) ‘орма, удобна€ дл€ компьютерной обработки:
(A) Ќоситель: гибкий диск
(B)  омпьютер: IBM PC совместимый
(C) ќперативна€ система: PC-DOS/MS-DOS
(D) ѕрограмма: Patent In Release # 1.0, ¬ерси€ # 1.25 (EPO)
(v) ƒанные по насто€щей за€вке:
Ќомер за€вки: 05052667 / 13 RU
(vi) ƒанные по предыдущей за€вке:
(A) Ќомер за€вки: US 07/729 099
(B)  онвенционный приоритет: 12 июл€ 1991.
(2) »Ќ‘ќ–ћј÷»я ќ ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» SEQ ID NO:1:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 315 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: неизвестна
(ii) ћолекул€рный тип продукта: белок
(iii) √ипотетическа€? Ќет
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(D) —тади€ развити€: мерозоит
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:1 (см. в конце описани€).
(2) »Ќ‘ќ–ћј÷»я ќ ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» SEQ ID NO:2:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 948 пар оснований
(B) “ип: нуклеинова€ кислота
(C)  оличество цепей: одна
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: кƒЌ 
(iii) √ипотетическа€? Ќет
(iv) јнтисмыслова€? Ќет
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:2 (см. в конце описани€).
(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:3:
(i) ’арактеристика последовательности
(A) ƒлина: 8 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:3:

(2) »Ќ‘ќ–ћј÷»я ќ ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» SEQ ID NO:4:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 29 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:4:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:5:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 3 аминокислоты
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:5:
Pro Asn Val
1
(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:6:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 6 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(ii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:6:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:7:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 8 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:7:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:8:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 5 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:8:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:9:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 6 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:9:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:10:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 30 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:10:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:11:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 5 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:11:

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:12:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 5 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 14 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: внутренний
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности

(2) »нформаци€ о последовательности SEQ ID NO:15:
(i) ’арактеристика последовательности:
(A) ƒлина: 18 аминокислот
(B) “ип: аминокислотна€
(D) “опологи€: линейна€
(ii) ћолекул€рный тип продукта: пептид
(iii) √ипотетическа€? ƒа
(v) “ип фрагмента: C - терминальный
(vi) ѕроисхождение:
(A) ќрганизм: Eimeria tenella
(xi) —троение последовательности SEQ ID NO:15:
о
‘ормула изобретени€: 1. ‘рагмент ƒЌ , кодирующий иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа и имеющий следующую последовательность
2. »ммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, образующийс€ в результате экспрессии фрагмента ƒЌ , охарактеризованного в п. 1 формулы, в клетках микроорганизмов и имеющий следующую последовательность аминокислот, выведенную на основе последовательности ƒЌ , охарактеризованной в п.1 формулы
3. »ммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 23 кƒа, образующийс€ в результате протеолитического расщеплени€ иммуногенного поверхностного полипептида, охарактеризованного в п.2 формулы.
4. –екомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ , используема€ дл€ экспрессии иммуногенного поверхностного полипептида мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, охарактеризованного в п.2 формулы, содержаща€ следующие конструктивные элементы: фрагмент ƒЌ , охарактеризованный в п.1 формулы; регулируемый промоторно-операторный элемент N 250 pSN 250 P 29; сайт св€зывани€ рибосом промотора P625 бактериофага T5 Escherichia coli; сайты рестрикции дл€ эндонуклеаз BamH1, Eco R1, Hind III, Pst I, Sal I, Xho I и Xba I; кодирующую область дл€ хлорамфениколацетилтрансферазы; модифицированный ген β-лактамазы; терминаторы бактериофага λ и оперона rrnB. Escherichia coli.
5. —пособ получени€ рекомбинантной плазмидной ƒЌ , используемой дл€ экспрессии иммуногенного поверхностного полипептида мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, охарактеризованного в п.2 формулы, заключающийс€ в том, что фрагмент ƒЌ , кодирующий полипептид, встраивают в подход€щий вектор, которым трансформируют клетки микроорганизмов, и выдел€ют целевую рекомбинантную ƒЌ  из клеток, в которых произошла экспресси€ полипептида.
6. —пособ получени€ иммуногенного поверхностного полипептида мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, охарактеризованного в п.2 формулы, заключающийс€ в том, что рекомбинантной плазмидной ƒЌ , содержащей фрагмент ƒЌ , кодирующий данный полипептид, трансформируют клетки микроорганизмов, которые культивируют в услови€х, обеспечивающих экспрессию полипептида, и выдел€ют целевой полипептид из культуральной среды.
7. —пособ получени€ рекомбинантного вируса вакцины, экспрессирующего иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, охарактеризованный в п.2 формулы, заключающийс€ в том, что фрагмент ƒЌ , кодирующий данный полипептид, после клонировани€ в подход€щем векторе встраивают в плазмиду дл€ рекомбинации, содержащую ген “  вируса вакцины, трансформируют культивируемые клетки полученной плазмидой рекомбинации, температурочувствительным мутантом вируса вакцины и вирусом вакцины дикого типа, выращивают трансформированные клетки при повышенной температуре, выдел€ют “ -негативный вирус вакцины, заражают им культивируемые клетки и отбирают целевой рекомбинантный вирус вакцины по наличию гена мерозоитов.
8. —пособ получени€ микроорганизма, продуцирующего иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов Eimeria tenella молекул€рной массы около 33 кƒа, охарактеризованный в п.2 формулы, заключающийс€ в том, что микроорганизм трансформируют рекомбинантной плазмидной ƒЌ , содержащей фрагмент ƒЌ , кодирующий данный полипептид, выращивают трансформированный микроорганизм в услови€х, обеспечивающих экспрессию полипептида, и отбирают целевой микроорганизм, продуцирующий целевой полипептид.
9. ¬акцина против кокцидиоза птицы, содержаща€ антиген на основе рекомбинантного поверхностного полипептида кокцидий Eimeria tenella и физиологически приемлемый носитель или адъювант, отличающа€с€ тем, что в качестве антигена содержит рекомбинантный вирус вакцины, содержащий фрагмент ƒЌ  по п.1 или иммуногенный поверхностный полипептид мерозоитов по п.2 или 3.