Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Способ может быть использован в медицине, а именно в биохимических методах исследования. Перекисную резистентность эритроцитов рассчитывают на основе трех показателей: оптическая плотность пробы, подвергшейся перекисному гемолизу; оптическая плотность, соответствующая 100% гемолизу; оптическая плотность, характеризующая спонтанный (без Н2О2) гемолиз эритроцитов. Используется одна порция суспензии эритроцитов. Оптическую плотность определяют при длине волны 536 нм. Величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов. Способ обеспечивает повышение точности и чувствительности метода. 1 табл., 1 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2134420
Класс(ы) патента: G01N33/50
Номер заявки: 97105596/14
Дата подачи заявки: 09.04.1997
Дата публикации: 10.08.1999
Заявитель(и): Санкт-Петербургская государственная академия физической культуры им.П.Ф.Лесгафта
Автор(ы): Михайлов С.С.; Романчук Л.А.; Фактор Э.А.
Патентообладатель(и): Санкт-Петербургская государственная академия физической культуры им.П.Ф.Лесгафта; Михайлов Сергей Сергеевич; Романчук Людмила Александровна; Фактор Эдуард Александрович
Описание изобретения: Изобретение относится к биохимическим методам исследования, а именно к способам определения перекисной резистентности эритроцитов.
Перекисное окисление (ПО) является нормальной составной частью окислительных процессов, постоянно протекающих в организме. Чрезмерная активация ПО оказывает отчетливое повреждающее действие на уровне субклеточных образований.
Изобретение представляет интерес для спортивной биохимии, т. к. практически любая спортивная деятельность сопровождается активацией ПО, что в силу упомянутого повреждающего воздействия негативно сказывается на физической работоспособности организма. Поэтому контроль интенсивности ПО в организме атлета является важной задачей биохимии спорта. Этот контроль удобно осуществлять на основании оценки гемолитической стойкости эритроцитарных мембран. Фосфолипидные структуры клеточных мембран относятся к биологическим объектам, наиболее чувствительным к изменению уровня ПО. В то же время эритроциты легко доступны для исследования.
Из описанных в литературе способов определения гемолитической стойкости эритроцитов наиболее близкими к предлагаемому оказались [1, 2].
В качестве ближайшего аналога был взят способ [2]. Он заключается в следующем. 2 мл 0,068% раствора перекиси водорода добавляли к 2 мл 5% суспензии эритроцитов и 0,16 мл 0,2% раствора азида натрия. Суспензия эритроцитов и растворы перекиси водорода и азида натрия приготовляли на забуференном физиологическом растворе с pH 7,4.
Таким образом готовили две опытные пробы. Третья - контрольная проба, предназначенная для определения спонтанного гемолиза эритроцитов, состояла из тех же объемов суспензии эритроцитов и раствора азида натрия, но вместо раствора перекиси водорода брали равный объем забуференного физиологического раствора с pH 7,4.
Опытные и контрольную пробы инкубировали 1 час при 37oC. Для получения 100% гемолиза эритроцитов к одной из опытных проб добавляли 0,2 мл 4% раствора сапонина. После инкубации все пробы (опытные и контрольную) центрифугировали 10' при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для определения степени гемолиза. Для этого к 0,3 мл надосадочной жидкости добавляли 2,7 мл трансформирующего раствора (см. Инструкцию Минздрава СССР от 07.06.82 "Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом") и далее определяли оптическую плотность E541, пропорциональную количеству гемоглобина в пробе.
Степень гемолиза А (в %), определяемую в стандартных условиях, под влиянием перекиси водорода рассчитывали по формуле
А = 100 (а - в)/(б - в), (1)
где а - величина оптической плотности опытной пробы E541;
б - величина оптической плотности при полном (100%) гемолизе под влиянием сапонина;
в - величина оптической плотности контрольной пробы - характеристика спонтанного гемолиза эритроцитов в условиях опыта.
Рассчитанная таким образом средняя перекисная резистентность эритроцитов для группы здоровых людей А = 8,9 + 1,13 [2].
Недостатки метода, взятого в качестве ближайшего аналога. Как следует из описания, исходным субстратом для определения перекисной резистентности является суспензия эритроцитов.
Очевидно, что даже при очень тщательном суспензировании и аккуратном отборе эритроцитарной суспензии для приготовления проб количество эритроцитов неизбежно оказывается различным во всех пробах, особенно при проведении массовых поточных определений. Поэтому и оценка степени гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к пробе со 100% гемолизом (см. формулу (1)) сопровождается существенной ошибкой, особенно, если в опытной пробе наблюдается незначительный гемолиз или же имеет место достаточно сильный спонтанный гемолиз эритроцитов в контрольной пробе.
Таким образом, неоднородность суспензии эритроцитов и необходимость приготовления отдельной пробы для проведения 100% гемолиза негативно сказываются на точности метода. Ведь количество эритроцитов в пробе, в которой за счет добавления сапонина осуществлен 100% гемолиз, и в других пробах может существенно различаться, что снимает точность и воспроизводимость метода.
По ходу определения неоднократно приходится манипулировать малыми объемами субстрата и используемых реактивов. Погрешность измерения этих объемов также негативно сказывается на точности конечного результата.
Взятый в качестве ближайшего аналога метод используется главным образом в клинической биохимии, где полученный результат сравнивается с нормальными значениями степени гемолиза для здорового человека.
В нижеприводимой таблице приводятся (для сравнения с данными, полученными предлагаемым способом) результаты определения перекисной резистентности по способу [2].
Предлагаемый способ определения перекисной резистентности эритроцитов. Разработанный способ учитывает недостатки ближайшего аналога. Прежде чем перейти к его подробному рассмотрению на основе конкретного примера следует остановиться на нескольких практических характеристиках предлагаемого способа.
1. Из двукратно отмытых физиологическим раствором эритроцитов готовили 4,4% суспензию. Например, из эритроцитов, содержащихся в 0,2 мл цельной крови, готовили 2 мл суспензии.
2. В серии специальных экспериментов эмпирически подобрали исходную рабочую концентрацию перекиси водорода - 2,2%, которая обеспечивает удобную для измерения величину оптической плотности гемолизата (от 0,1 до 0,8). Концентрацию перекиси водорода контролировали по экстинкции при λ = 230 нм, используя молярный коэффициент экстинкции.
3. В способе [2] азид натрия применяют для ингибиции эритроцитарной каталазы с тем, чтобы оценивать непосредственно резистентность мембран эритроцитов к перекисному окислению, инициированному H2O2. Предлагаемый же способ преследует несколько иную цель: оценивать общую резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы, разлагающей перекись водорода. Поэтому азид натрия в предлагаемом способе не использовали.
4. Как уже отмечалось, в способе [2] применяют трансформирующий раствор, дающий окрашенный комплекс с Fe3+ гемоглобина. Величина оптической плотности E541 полученного раствора позволяет судить о концентрации гемоглобина и, следовательно, о степени гемолиза эритроцитов. В предлагаемом способе трансформирующий раствор не использовали. О степени гемолиза судили по оптической плотности E536, непосредственно отражающей концентрацию гемоглобина. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46, обеспечивающим точность считывания показаний до третьего знака после запятой.
Пример конкретного применения предлагаемого способа
Взяты 10 образцов одной и той же донорской крови. В спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл и с толщиной поглощающего слоя жидкости 1 см вносят 0,8 мл забуференного физиологического раствора (pH 7,4), добавляют 0,1 мл суспензии эритроцитов. Содержимое перемешивают.
Все три параметра каждой пробы ("а", "б" и "в"), фигурирующие в формуле (1), определяются непосредственно в одной и той же спектрофотометрической кювете.
Сначала определяется величина "в", характеристика спонтанного гемолиза. В серии предварительных опытов было установлено, что в условиях описываемого определения в течение 60' спонтанный гемолиз практически пропорционален времени инкубации. Сразу же после вышеописанного перемешивания пробу в спектрофотометрической кювете центрифугируют (5', 3000 об/мин) и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при λ = 536 нм. Получают E0 - нулевую точку на приводимом ниже графике. Далее осадок взмучивают и после 30' инкубации при 37oC снова центрифугируют и определяют оптическую плотность E30. Затем по графику с учетом линейной зависимости путем экстраполяции получают E60. В качестве примера на чертеже приведены данные, относящиеся к определению "в" для первой пробы (первая строка таблицы, II). E0 = 0,010; E30 = 0,035.
Как следует из чертежа, величина E60 = 0,060. Очевидно, что операция линейной экстраполяции не обязательно связана с построением графика. В данном случае E60 = 2 E30 - E0. Отсюда с учетом разбавления при последующем добавлении H2О2 (методика описана ниже) имеем
в = 0,9 E60 = 1,8 E30 - 0,9 E0. (2)
Методика заключается в следующем: добавляют 0,1 мл 2,2% раствора перекиси водорода и при постоянном покачивании кюветы и перемешивании содержимого пробы инкубируют в течение 30' при той же температуре. Затем после центрифугирования (5', 3000 об/мин) определяют оптическую плотность, соответствующую величине "а".
Далее в кюветы вносят стеклянную палочку, смоченную в 4% растворе сапонина, после чего осадок взмучивают. Предварительные опыты показали, что эта операция и последующая 10' экспозиция обеспечивают 100% гемолиз. По достижении 100% гемолиза пробы вновь центрифугируют (5', 3000 об/мин) и фотометрируют надосадочную жидкость, определяя величину "б". Полученные данные приведены в таблице в конце описания.
В левой части таблицы представлены результаты определений перекисной резистентности 10 проб одной и той же донорской крови по способу [2], в правой - по предлагаемому способу. Сопоставление полученных результатов показывает, что наш способ обеспечивает более высокую точность и воспроизводимость результатов. Средняя ошибка определения составляет 3,8%. В то время как ошибка способа [2] составляет 13%. При этом повышение точности сопровождается упрощением и удешевлением метода (в нем не используют применяемый в [2] трансформирующий раствор).
Таким образом, устранение недостатков ближайшего аналога достигнуто за счет индивидуализации каждой пробы. Суспензия эритроцитов, помещенная в спектрофотометрическую кювету, уже не покидает ее и используется сначала для определения спонтанного гемолиза, потом для определения гемолиза, вызванного добавлением H2O2, и, наконец, для определения полного гемолиза, обусловленного добавлением сапонина.
Область применения предлагаемого способа выходит за рамки спортивной биохимии. Он представляет интерес для всех случаев, включая и клинические, в которых важно иметь точные данные о динамике изменения перекисной резистентности эритроцитов.
Литература
1. Покровский A.A., Абраров А.А. К вопросу о перекисной резистентности эритроцитов. - Вопр. питания, 1964. - N 6. - С. 44-46.
2. Бенисович В.И., Идельсон Л.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Маркиафа-Микели. - Вопр. мед. химии, 1973. - N 6. - С. 596-599.
Формула изобретения: Способ определения перекисной резистентности эритроцитов, включающий определение спонтанного гемолиза суспензии эритроцитов, гемолиза, вызванного добавкой Н2О2, и 100% гемолиза, вызванного детергентом, и по отношению этих величин рассчитывают перекисную резистентность, отличающийся тем, что после перемешивания порции суспензии эритроцитов ее центрифугируют 5 мин при 3000 об/с, определяют резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы путем оценки величины спонтанного гемолиза, гемолиза, вызванного добавлением Н2О2, а затем - 100% гемолиза в одной и той же порции суспензии эритроцитов, помещенной в спектрофотометрическую кювету, при этом оптическую плотность надосадочной жидкости определяют при длине волны λ=536 нм, а величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов.