Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

¬ј ÷»Ќј ƒЋя ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я ќѕќ—–≈ƒќ¬јЌЌќ… “-  Ћ≈“ јћ» ѕј“ќЋќ√»» »Ћ» Ќ≈–≈√”Ћ»–”≈ћќ… –≈ѕЋ» ј÷»»  ЋќЌјћ» “-  Ћ≈“ќ , —ѕќ—ќЅ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ƒ»ј√Ќќ—“»–ќ¬јЌ»я »Ћ» ѕ–ќ√Ќќ«»–ќ¬јЌ»я ¬ќ—ѕ–»»ћ„»¬ќ—“»   –≈¬ћј“ќ»ƒЌќћ” ј–“–»“” »Ћ» –ј——≈яЌЌќћ” — Ћ≈–ќ«”, —ѕќ—ќЅ ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –≈¬ћј“ќ»ƒЌќ√ќ ј–“–»“ј »Ћ» –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј » —ќƒ≈–∆јў»… ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ SGDQGGNE ѕ≈ѕ“»ƒ, я¬Ћяёў»…—я ј√≈Ќ“ќћ ƒЋя ќЅЌј–”∆≈Ќ»я, ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј - ѕатент –‘ 2138512
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
¬ј ÷»Ќј ƒЋя ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я ќѕќ—–≈ƒќ¬јЌЌќ… “-  Ћ≈“ јћ» ѕј“ќЋќ√»» »Ћ» Ќ≈–≈√”Ћ»–”≈ћќ… –≈ѕЋ» ј÷»»  ЋќЌјћ» “-  Ћ≈“ќ , —ѕќ—ќЅ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ƒ»ј√Ќќ—“»–ќ¬јЌ»я »Ћ» ѕ–ќ√Ќќ«»–ќ¬јЌ»я ¬ќ—ѕ–»»ћ„»¬ќ—“»   –≈¬ћј“ќ»ƒЌќћ” ј–“–»“” »Ћ» –ј——≈яЌЌќћ” — Ћ≈–ќ«”, —ѕќ—ќЅ ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –≈¬ћј“ќ»ƒЌќ√ќ ј–“–»“ј »Ћ» –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј » —ќƒ≈–∆јў»… ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ SGDQGGNE ѕ≈ѕ“»ƒ, я¬Ћяёў»…—я ј√≈Ќ“ќћ ƒЋя ќЅЌј–”∆≈Ќ»я, ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј
¬ј ÷»Ќј ƒЋя ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я ќѕќ—–≈ƒќ¬јЌЌќ… “-  Ћ≈“ јћ» ѕј“ќЋќ√»» »Ћ» Ќ≈–≈√”Ћ»–”≈ћќ… –≈ѕЋ» ј÷»»  ЋќЌјћ» “-  Ћ≈“ќ , —ѕќ—ќЅ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ƒ»ј√Ќќ—“»–ќ¬јЌ»я »Ћ» ѕ–ќ√Ќќ«»–ќ¬јЌ»я ¬ќ—ѕ–»»ћ„»¬ќ—“»   –≈¬ћј“ќ»ƒЌќћ” ј–“–»“” »Ћ» –ј——≈яЌЌќћ” — Ћ≈–ќ«”, —ѕќ—ќЅ ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –≈¬ћј“ќ»ƒЌќ√ќ ј–“–»“ј »Ћ» –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј » —ќƒ≈–∆јў»… ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ SGDQGGNE ѕ≈ѕ“»ƒ, я¬Ћяёў»…—я ј√≈Ќ“ќћ ƒЋя ќЅЌј–”∆≈Ќ»я, ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј

¬ј ÷»Ќј ƒЋя ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я ќѕќ—–≈ƒќ¬јЌЌќ… “-  Ћ≈“ јћ» ѕј“ќЋќ√»» »Ћ» Ќ≈–≈√”Ћ»–”≈ћќ… –≈ѕЋ» ј÷»»  ЋќЌјћ» “-  Ћ≈“ќ , —ѕќ—ќЅ ¬џƒ≈Ћ≈Ќ»я ¬ј ÷»Ќџ, —ѕќ—ќЅ ƒ»ј√Ќќ—“»–ќ¬јЌ»я »Ћ» ѕ–ќ√Ќќ«»–ќ¬јЌ»я ¬ќ—ѕ–»»ћ„»¬ќ—“»   –≈¬ћј“ќ»ƒЌќћ” ј–“–»“” »Ћ» –ј——≈яЌЌќћ” — Ћ≈–ќ«”, —ѕќ—ќЅ ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –≈¬ћј“ќ»ƒЌќ√ќ ј–“–»“ј »Ћ» –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј » —ќƒ≈–∆јў»… ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ SGDQGGNE ѕ≈ѕ“»ƒ, я¬Ћяёў»…—я ј√≈Ќ“ќћ ƒЋя ќЅЌј–”∆≈Ќ»я, ѕ–ќ‘»Ћј “» » »Ћ» Ћ≈„≈Ќ»я –ј——≈яЌЌќ√ќ — Ћ≈–ќ«ј

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к медицине, в частности к иммунологии. ѕредложенна€ вакцина дл€ профилактики или лечени€ опосредованной “-клетками патологии или нерегулируемой репликации клонами “-клеток в млекопитающих содержит активное вещество и фармацевтически переносимую среду, при этом в качестве активного вещества она содержит рецептор “-клеток или его фрагмент, соответствующий рецептору “-клеток, наход€щемус€ на поверхности опосредующих данную патологию “-клеток, или антиидиотипические антитела, €вл€ющиес€ внутренним изображением данного рецептора или его упом€нутого фрагмента, причем активное вещество вз€то в иммуногенно эффективном количестве. ≈е готов€т путем получени€ клонов “-клеток, вызывающих опосредованную “-клетками патологию, определени€ последовательности аминокислот рецепторов “-клеток клонов “-клеток, св€занных с данной патологией, отбора сегментов данных рецепторов “-клеток, характерных дл€ упом€нутых рецепторов “-клеток, а не дл€ рецепторов “-клеток, не св€занных с данной патологией, и отбора из упом€нутых последовательностей тех последовательностей, которые способны к индукции иммуногенной реакции относительно упом€нутого рецептора “-клеток, таким образом отбира€ вакцину. “акже предложены способ диагностировани€ или прогнозировани€ восприимчивости индивидуума к ревматоидному артриту, который заключаетс€ в том, что он включает обнаружение “-клеток, содержащих вариабельный участок β-нити MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS или его фрагмент в пробе индивидуума, причем анормальна€ экспресси€ “-клеток, содержащих такой участок, указывает на ревматоидный артрит или восприимчивость к ревматоидному артриту, а также способ профилактики или лечени€ ревматоидного артрита, который заключаетс€ в том, что он включает предотвращение св€зывани€ рецептора “-клеток, содержащего последовательность MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, или рецептора “-клеток, содержащего в основном последовательность SGDQGGNE, с его партнером, и способ профилактики или лечени€ ревматоидного артрита в индивидууме, который заключаетс€ в том, что он включает цитотоксическую или цитостатическую обработку “-клеток, MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, или “-клеток, содержащих в основном последовательность SGDQGGNE в индивидууме. 5 с. и 16 з.п.ф-лы, 10 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2138512
 ласс(ы) патента: C07K7/06, A61K39/44, G01N33/564, G01N33/68
Ќомер за€вки: 5001756/14
ƒата подачи за€вки: 21.03.1990
ƒата публикации: 27.09.1999
«а€витель(и): ƒзе »ммюн –испонз  орпорейшн (US)
јвтор(ы): ћарк ’ауэл (US); —тивен Ѕростофф (US); ƒеннис  арло (US)
ѕатентообладатель(и): ƒзе »ммюн –испонз  орпорейшн (US)
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к иммунной системе, в частности к вакцине дл€ профилактики или лечени€ опосредованной “-клетками патологии или нерегулируемой репликации клонами “-клеток, способу выделени€ вакцины, способу диагностировани€ или прогнозировани€ восприимчивости к ревматоидному артриту или рассе€нному склерозу, способу профилактики или лечени€ ревматоидного артрита или рассе€нного склероза и содержащему последовательность SGDQGGNE пептиду, €вл€ющемус€ агентом дл€ обнаружени€, профилактики или лечени€ рассе€нного склероза.
¬ысшие организмы отличаютс€ иммунной системой, защищающей их от инвазии возможно вредных веществ или микроорганизмов. ≈сли вещество, обозначаемое как антиген, проникает в тело и если оно узнаваетс€ как чужое, то иммунна€ система вызывает и опосредованную антителами реакцию, и клеточно-опосредованную реакцию.  летки иммунной системы, обозначаемые как Ѕ-лимфоциты, или Ѕ-клетки, производ€т антитела, специфически узнающие чужое вещество и св€зывающиес€ с ними. ƒругие лимфоциты, обозначаемые как “-лимфоциты, или “-клетки, и вызывают, и регулируют клеточно-опосредованную реакцию, в конечном счете привод€щую к уничтожению антигена.
¬ клеточно-опосредованной реакции участвуют разные виды “-клеток. Ќекоторые из них индуцируют определенные клоны Ѕ-клеток к пролиферации и производству антител, специфических дл€ соответствующего антигена. ƒругие узнают и уничтожают клетки, представл€ющие собой чужие антигены на своей поверхности. ќпределенные “-клетки регулируют реакцию или путем стимул€ции, или путем супрессии других клеток.
Ќормальна€ иммунна€ система точно регулируетс€, однако отклонени€ не редки. ¬ некоторых случа€х иммунна€ система работает неправильно и реагирует на компонент хоз€ина, как будто он €вл€лс€ чужим. “ака€ реакци€ приводит к аутоиммунной болезни, котора€ выражаетс€ в том, что иммунна€ система организма атакует ткань хоз€ина. “-клетки, €вл€€сь основными регул€торами иммунной системы, непосредственно или косвенно вызывают такие аутоиммунные патологии.
ѕредполагают, что многочисленные болезни €вл€ютс€ результатом аутоиммунных механизмов. —амые известные из этих болезней - ревматоидный артрит, системна€ красна€ волчанка, рассе€нный склероз, диабет типа I, миастени€ gravis и обыкновенна€ пузырчатка. ћиллионы людей во всем мире страдают от аутоиммунных болезней, и св€занные с этими болезн€ми расходы, включающие и само лечение, побочные расходы и потери трудовой производительности составл€ют миллиарды долларов каждый год. ¬ насто€щее врем€ нет средств дл€ эффективного лечени€ таких аутоиммунных патологий. ќбычно можно лечить лишь симптомы, причем сама болезнь прогрессирует, часто привод€ к серьезному ослаблению больного или его смерти.
¬ других случа€х лимфоциты умножаютс€ чрезмерно и неконтролируемым образом. “акое умножение приводит к раковому состо€нию, т.н. лимфоме. ¬ том случае, если нерегулируемые лимфоциты €вл€ютс€ “-клетками, то данные опухоли обозначают как лимфомы “-клеток. “акже как и другие злокачественные опухоли и лимфомы “-клеток эффективно лечить трудно.
“аким образом, уже давно нуждаютс€ в эффективном средстве дл€ лечени€ или уменьшени€ интенсивности патологий, опосредованных “-клетками. ¬ идеальном случае такое лечение включало бы скорее контроль неподход€щей реакции “-клеток чем лишь уменьшение интенсивности симптомов. Ќасто€щее изобретение удовлетвор€ет это требование и одновременно имеет побочные преимущества.
ѕервым объектом насто€щего изобретени€ €вл€етс€ вакцина дл€ профилактики или лечени€ опосредованной “-клетками патологии или нерегулируемой репликации клонами “-клеток в млекопитающих, содержаща€ фармацевтически переносимую среду и активное вещество, представл€ющее собой рецептор “-клеток или его фрагмент, соответствующий рецептору опосредующих данную патологию “-клеток, наход€щемус€ на их поверхности, или антиидиотипические антитела, €вл€ющиес€ внутренним изображением данного рецептора “-клеток или его упом€нутого фрагмента, причем активное вещество вз€то в иммуногенно эффективном количестве.
ѕод пон€тием "опосредованна€ “-клетками патологи€" в данном тексте понимаетс€ любое состо€ние, в котором неуместна€ реакци€ “-клеток €вл€етс€ компонентом патологии. ƒанное пон€тие здесь охватывает и болезни, непосредственно опосредованные “-клетками, и болезни, напр. миастению gravis, которые прежде всего про€вл€ютс€ в нарушении, вызываемом св€зыванием антител, а также болезни, вызванные неуместной реакцией “-клеток, привод€щей к производству таких антител. “.е., данное пон€тие охватывает и аутоиммунные болезни, опосредованные “-клетками, и нерегулируемую репликацию клонами “-клеток.
¬ нижеследующем обороте "в основном последовательность" в св€зи с последовательностью аминокислот следует понимать в смысле или описываемой последовательности, или другой последовательности, в которой добавлены, пропущены или заменены отдельные звень€, причем данные изменени€ не существенно вли€ют на способность последовательности вызывать иммунную реакцию против желаемой последовательности рецептора “-клеток. “аким образом, участок описываемой иммунизирующей последовательности можно использовать всегда тогда, когда он в достаточной степени €вл€етс€ характерным дл€ желаемого рецептора “-клеток с тем, чтобы вызывать эффективную иммунную реакцию против желаемых рецепторов “-клеток, а не против нежелаемых рецепторов “-клеток. “аких вариаций последовательности можно достичь простыми методами, напр., путем синтеза другой последовательности, и их эффективность можно провер€ть, напр., путем иммунизации млекопитающих.
ѕон€тие "фрагмент" в нижеследующем охватывает фрагменты в сочетании с дополнительными последовательност€ми или част€ми, в которых, напр., пептид св€зан с другими последовательност€ми аминокислот или с носителем, или фрагменты, св€занные с ними. ѕон€ти€ "фрагмент" и "пептид" поэтому могут быть использованы в данном тексте как взаимозаменимые пон€ти€, т.к. пептид будет €вл€тьс€ самым распространенным фрагментом рецептора “-клеток.  аждый фрагмент согласно изобретению может иметь измененную последовательность, как описано выше в разделе "в основном последовательность".
 огда в нижеследующем речь идет о "фрагменте или участке рецептора “-клеток", тогда это не означает, что они должны быть производными неповрежденных рецепторов “-клеток. “акие "фрагменты или участки" можно производить с помощью разных известных методов, напр., путем ручного или автоматического синтеза пептида или путем клонировани€.
¬ нижеследующем в св€зи с отношением между фрагментом предлагаемого пептида и последовательност€ми рецепторов “-клеток слово "соответствующий" означает, что фрагмент пептида имеет последовательность аминокислот, котора€ в достаточной степени гомологична последовательности рецептора “-клеток с тем, чтобы возбуждать регулирующую реакцию в индивидууме. ќднако последовательности не об€зательно тождественны с последовательностью рецептора “-клеток, как видно в примерах II и III.
ѕод словами "иммуногенно эффективный" здесь понимаетс€ количество рецептора “-клеток или его фрагмента, которое эффективно вызывает иммунную реакцию дл€ профилактики или лечени€ опосредованной “-клетками патологии или нерегулируемой репликации клонами “-клеток в индивидууме. —амо собой разумеетс€, что такое количество может колебатьс€ в зависимости от существа и индивидуума и многих других факторов. Ќапример, в общем у человека дл€ эффективной иммунной реакции необходима больша€ доза, чем у мыши.
¬ качестве наличи€ вакцины в жидком состо€нии концентраци€ активного вещества составл€ет примерно 1 мкг - 100 мг на мл. ¬ случае использовани€ предлагаемой вакцины в твердом состо€нии активное вещество берут с соответствующей концентрацией.
¬ нижеследующем под "Vβ17" понимаетс€ определенный вариабельный участок β-цепи рецептора “-клеток. Vβ17 имеет следующую последовательность аминокислот: MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHD AMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQK NPTAFYLCASS. √ипервариабельные и св€зывающие участки €вл€ютс€ наиболее полезными дл€ вакцин. ќдин из гипервариабельных участков Vβ17, а именно участок CDR2, имеющий последовательность аминокислот SQIVNDFQK, €вл€етс€ особенно полезным. ћодификации данной последовательности, не затрагивающие способность рецептора к действию в качестве иммуногена, вызыва€ желаемую иммунную реакцию, также охватываютс€ данным термином. ¬ариабельный участок может быть с€взан с любым D- или J-сегментом рецептора “-клеток.  роме того, иммуногенно действующие фрагменты Vβ17 также охватываютс€ определением "Vβ17".
¬ нижеследующем под "партнером (дл€ св€зывани€)" понимаетс€ состав, способный к взаимодействию с рецептором “-клеток. ¬ общем данный состав представл€ет собой главный антиген тканевой совместимости (ћЌ—), но он может быть любым составом, при обычном св€зывании рецептора “-клеток привод€щим к активации или пролиферации “-клеток.
ѕод пон€тием "лиганд" в нижеследующем понимаетс€ люба€ молекула, котора€ реагирует с другой молекулой с образованием комплекса.
—лова "избирательно св€зываетс€ с" в нижеследующем следует понимать так, что молекула св€зываетс€ с одним видом молекул, но в основном не с другими. ¬ отношении Vβ17 "избирательно св€зываетс€ с" включает св€зывание с рецепторами “-клеток, содержащими Vβ17 , но в основном не с рецепторами “-клеток, не содержащими Vβ17.
»ммунна€ система €вл€етс€ главной биологической защитой хоз€ина (собственного организма) от возможно вредных (чужих) агентов. “акими вредными агентами могут быть, напр., патогенные факторы, напр., бактерии или вирусы, а также модифицированные собственные клетки, включа€ инфицированные вирусами клетки, опухолевые клетки и другие анормальные клетки хоз€ина. ¬се эти цели иммунной системы обобщенно называют антигенами. ѕри узнавании антигена иммунной системой сразу же включаетс€ иммунный механизм дл€ уничтожени€ антигена, защища€ таким образом здоровье хоз€ина.
√лавными типами специфической дл€ определенного антигена иммунной реакции €вл€ютс€ гуморальный (опосредованный антителами) и клеточный (клеточно-опосредованный) иммунитет.  аждый из этих иммуннологических механизмов пускаетс€ активацией вспомогательными (CD4+) “-клетками. ƒанные CD4+ “-клетки стимулируют Ѕ-клетки, способные к синтезу антител путем св€зывани€ антигенов, в результате чего они пролиферируют и секретируют антитела. —екретированные антитела св€зываютс€ с антигенами и облегчают их уничтожение путем других иммунных механизмов. ѕодобным образом CD4+ “-клетки отдают стимулирующие сигналы цитотоксическим (CD8+) “-клеткам, которые узнают и уничтожают соответствующие клетки (напр., инфицированные вирусами клетки хоз€ина). “аким образом, активаци€ CD4+ “-клеток €вл€етс€ решающим фактором при стимул€ции иммунной реакции. ѕоэтому ознакомление с механизмами, привод€щими к специфической дл€ определенного антигена активации CD4+ “-клеток, важно при любой попытке избирательной модификации иммунологического действи€.
—пецифичность “-клеток относительно определенных антигенов обеспечиваетс€ рецептором “-клеток, выраженным на поверхности клетки. –ецептор “-клеток €вл€етс€ гетеродимерным гликопротеином, состо€щим из двух полипептидных нитей, кажда€ из которых имеет молекул€рный вес примерно 45 пар оснований (п.о.). »звестны две формы рецепторов “-клеток. ќдна состоит из альфа-нити и бета-нити, а друга€ - из гамма-нити и дельта-нити.  ажда€ из данных полипептидных нитей рецепторов “-клеток кодирована определенным генетическим локусом, содержащим сложные прерывистые сегменты генов, представл€ющее собой, напр., вариабельные (¬), св€зывающие (J) или немен€ющиес€ (—) участки. Ѕета- и дельта-нити содержат дополнительный элемент, обозначаемый как диверзиционный (D) сегмент. (“.к. диверзиционные сегменты (D) и элементы содержатс€ лишь в некоторых генетических локусах рецепторов “-клеток и полипептидах, в нижеследующем они приведены в скобках с тем, чтобы показать, что данные участки имеютс€ лишь в соответствующих нит€х рецепторов “-клеток. “аким образом, V(D)J относитс€ или к последовательности VDJ нитей, имеющих D-участок, или к последовательности VJ, в которых не имеетс€ D-участка.)
¬о врем€ мейозы лимфоцитов отдельные V-, (D-) и J-сегменты перегруппируютс€ и формируют функциональный ген, определ€ющий последовательность аминокислот рецептора “-клеток, выраженного данной клеткой. “.к. запас V-, (D-) и J-генов, который может перегруппироватьс€, содержит много членов и благодар€ тому, что отдельные элементы данного запаса могут перегруппироватьс€ с любой комбинацией, общий запас рецепторов “-клеток €вл€етс€ в высокой степени диверзиционным и способным к св€зыванию бесчисленных партнеров, которые могут наступать на организм. ќднако кажда€ отдельна€ “-клетка имеет лишь одну молекулу “-рецептора, котора€ в основном, если не полностью, предопредел€ет специфичность данной “-клетки относительно его партнера.
ћодели на животных значительно способствовали пониманию иммунологических механизмов аутоиммунных болезней. ќдной моделей €вл€етс€ экспериментальный аллергический энцефаломиелит (≈ј≈), представл€ющий собой аутоиммунную болезнь центральной нервной системы, которую можно вызывать в мышах и крысах путем иммунизации с основным протеином миелина (ћЅ–). ’арактеристика упом€нутой болезни следующа€: клинически - паралич и легка€ гипотрофи€, а гистологически - периваскул€рна€ мононуклеарна€ инфильтраци€ клеток паренхимы центральной нервной системы. ѕатогенез болезни опосредуетс€ “-клетками, специфическими в отношении основного протеина миелина. –азнообразные клоны специфических в отношении основного протеина миелина “-клеток выдел€ли из животных, страдающих от экспериментального аллергического энцефаломиелита, и их амплифицировали путем последовательной культивации. ѕосле стимул€ции in vitro основным протеином миелина данные “-клетки сражу же вызывают экспериментальный аллергический энцефаломиелит, когда их адаптивно перенос€т в здорового хоз€ина. ¬ажно при этом, что данные вызывающие экспериментальный аллергический энцефаломиелит “-клетки специфические не только в отношении именно этого антигена (основного протеина миелина), но обычно в отношении одного единственного эпитопа на данном антигене. ¬се это означает, что малые количества аутоагрессивных “-клеток ответственны за патогенез экспериментального аллергического энцефаломиелита.
¬ результате анализа рецепторов “-клеток, вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит, вы€вилось, что структура данных св€занных с болезнью рецепторов имеет уменьшенную разнородность. ¬ ходе анализа, в котором исследовали 33 взаимодействующие с основным протеином миелина “-клетки, обнаружили лишь два содержащих вариабельные участки сегмента альфа-нитей и один единственный сегмент альфа-нити, содержащий св€зывающий участок. ¬ этой совокупности “-клеток также обнаружили одинаково ограниченное использование генов рецепторов “-клеток в бета-нит€х. »мелись лишь два содержащих вариабельные участки сегмента бета-нитей и два сегмента, содержащих св€зывающие участки. ≈ще важнее, примерно 80% клонов “-клеток на V-D-J-участках бета-нити имели идентичные последовательности аминокислот. Ёти результаты подтверждают, что рецепторы “-клеток с похожей специфичностью относительно антигенов также имеют одинаковую структуру, и показывают, что рецептор “-клеток €вл€етс€ подход€щей целью дл€ иммунотерапевтичесих стратегий при борьбе с патогенезом экспериментального аллергического энцефаломиелита.
–азнообразными методами пытались использовать специфичность аутоагрессивных “-клеток относительно антигенов дл€ выработки стратегий дл€ лечени€ экспериментального аллергического энцефаломиелита. Ќапример, использовали пассивную дачу моноклональных антител, специфических дл€ рецепторов, имеющихс€ на поверхности вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит “-клеток. ¬ случае мышиной модели экспериментального аллергического энцефаломиелита в результате инфузии моноклонального антитела, специфического дл€ V,β8, представл€ющего собой больший вариабельный участок бета-нити, использованный в специфических относительно основного протеина миелина “-клетках, восприимчивость мышей к последующей индукции экспериментального аллергического энцефаломиелита снизилась (см. јха-ќрбеа и др., Cell, N 54, стр. 263 - 273, 1988 г., и ”рбан и др., Cell, N 54, стр. 577 - 592, 1988 г.). ѕодобна€ защита достигалась в случае экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс с помощью моноклонального антитела, способного к взаимодействию с неидентифицированной идиотипической детерминантой рецептора “-клеток на специфических относительно основного протеина миелина “-клетках (см. Ѕэрнс и др., J. Exp. Med., N 169, стр. 27 - 39, 1989 г. ). ’от€ терапи€ пассивными антителами по всей видимости положительно сказываетс€ на восприимчивость к экспериментальному аллергическому энцефаломиелиту, она св€зана с потенциальными проблемами. ƒостигаема€ защита исчезает, в св€зи с чем требуетс€ повторна€ дача антитела. ѕри многократной инфузии антител, однако, повышаетс€ веро€тность того, что хоз€ин развивает иммунную реакцию против подаваемых антител, в частности тогда, если их получили в ксеногенном животном.  роме того, реакци€ антител на патогенный клон “-клеток представл€ет собой лишь одно звено всей иммунной реакции и пренебрежает возможную роль клеточного иммунитета при преодолении аутореактивности.
–оль клеточного иммунитета при снижении активности аутоагрессивных “-клеток при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите €вилась предметом исследований, и предложены возможные терапии. ѕодобно методу пассивных антител ex vivo получили регулирующие “-клетки, которые затем вновь дали хоз€ину в рамках иммунотерапии. Ќапр., недавно выделили клон CD8+ “-клеток из выздоравливающих крыс, в которых путем адоптивного переноса специфической относительно основного протеина миелина линии CD4+ “-клетки вызвали экспериментальный аллергический энцефаломиелит (см. —ан и др., Nature, N 332, стр. 843 - 845, 1988 г.). ƒанный клон CD8+ “-клетки in vitro про€вил цитолитическую активность в отношении содержащей CD4+ “-клетки, использованной дл€ индукции болезни.  роме того, адоптивный перенос данного клона CTL снизил восприимчивость соответствующих крыс при последующей подаче основного протеина миелина. Ћидер и др. (см. Science, N 239, стр. 181 -183, 1988 г.) также выделили клоны CD8+ “-клеток, обладающие супрессивной активностью относительно вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит “-клеток. ƒанный клон CD8+ “-клеток выделили из крыс, вакцинированных аттенуированными клонами “-клеток, вызывающими болезнь, и, хот€ он не про€вл€л ситолитической активности in vitro, он был способен к супрессии зависимой от основного протеина миелина пролиферации “-клеток, вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит. ’от€ данные анализы показывают, что содержащие CD8+ “-клетки способны к сдерживанию экспериментального аллергического энцефаломиелита, все-таки неверо€тно, что данные определенные CD8+ CTL будут играть важную роль дл€ долгосрочной резистентности выздоровевших крыс, т.к. —еджвик и др. (Eur. J. Immunol., N 18, стр. 495 - 502) €сно показали, что удаление содержащих CD8+ клеток с моноклональными антителами не вли€ет на протекание болезни или выздоровление.
¬ вышеописанных опытах —ана и др. и Ћидера и др. дача регулирующих “-клеток приводит к преодолению важной проблемы пассивной терапии антителами, т.к. она позвол€ет достичь долгосрочной регулирующей реакции in vivo. ќднако она требует культивации in vitro с использованием аттенуированных “-клеток, вызывающих болезнь, с тем, чтобы развивать клоны таких регулирующих “-клеток, что представл€ет собой дорогосто€щий и трудоемкий процесс.  роме того, в случае человека из-за неидентичности главного антигена тканевой совместимости это требует в высокой степени индивидуализованную терапевтическую стратегию, т.к. дл€ каждого отдельного больного необходимо получение регулирующих клонов, которые затем дают исключительно этому больному с тем, чтобы исключить возможную реакцию "трансплантат против хоз€ина".
Ќепосредственную вакцинацию аттенуированными клонами “-клеток, вызывающих болезнь, использовали дл€ терапии экспериментального аллергического энцефаломиелита. “-клетки, специфические относительно основного протеина миелина и способные к передаче болезни, аттенуировали путем облучени€ гамма-лучами или химической фиксации и затем их использовали дл€ вакцинации неинфицированных крыс. ¬ некоторых случа€х вакцинированные животные развивали резистентность относительно последующих попыток вызвать у них экспериментальный аллергический энцефаломиелит (Ћидер и др., см. выше, а также у  охена и ¬айнера, Immunol. Today, N 9, стр. 332 - 335, 1988 г.). ќднако эффективность такой вакцинации изменчива€, и степень защиты также значительно колеблетс€. “-клетки содержат много разнообразных антигенов, которые вызывают иммунную реакцию, когда целую “-клетку примен€ют в качестве вакцины. Ёто показали ќффнер и др. (J. NeuroimmunoL, N 21, стр. 13 - 22, 1989 г.), кто доказали, что иммунизаци€ применением целой “-клетки способствует аллергической реакции замедленного типа, определ€емой на набухании уха, на данные “-клетки, котора€ возрастает с увеличением числа вакцинаций. ќднако четкие аллергические реакции замедленного типа устанавливали и в защищенных, и в незащищенных животных.  рысы показывали похожую реакцию при вакцинации и вызывающих энцефалит “-клеток, и контрольных “-клеток. » наоборот, вакцинаци€ специфическими относительно очищенного деривата протеина “-клетками из специфической относительно очищенного деривата протеина линии вызвала аллергическую реакцию замедленного типа и на клетки вакцины, и на вызывающий энцефалит клон, хот€ не обнаруживалось никакой защиты. ѕохожа€ реакци€ вакцинированных крыс на вызывающие болезнь клетки и на контрольные клетки, определ€ема€ на аллергической реакции замедленного типа (котора€ €вл€етс€ мерой дл€ клеточно-опосредованного иммунитета), указывает на то, что многочисленные антигены данных “-клеток вызывают иммунную реакцию. “аким образом, недостатками вакцинации аттенуированными “-клетками, вызывающими болезнь, €вл€ютс€ недостаточна€ специфичность относительно защитного антигена на поверхности данной “-клетки, а также непосто€нные результаты относительно иммунитета против данного антигена. „то касаетс€ применени€ данного метода дл€ лечени€ людей, то он €вл€етс€ таким же трудоемким, как и вышеописанна€ инфузи€ CD8+ клеток, и также как и последн€€ данный метод требует индивидуализованной терапии.
Ќасто€щее изобретение предлагает эффективный способ иммунотерапии патологий, опосредованных “-клетками, включа€ аутоиммунных болезней, не св€занный с теми проблемами, с которыми св€заны вышеописанные известные методы лечени€. ѕутем вакцинации, а не путем пассивной дачи гетерологических антител мобилизуетс€ собственна€ иммунна€ система хоз€ина к супрессии аутоагрессивных “-клеток. “аким образом, супресси€ €вл€етс€ посто€нной и может охватывать любые и все иммунологические механизмы, привод€щие к этой супрессии. “ака€ многосторонн€€ реакци€ €вл€етс€ более эффективной, чем односторонн€€ супресси€, достигаема€ путем пассивного применени€ моноклональных антител или клонов регулирующих “-клеток.
“. к. предлагаемые вакцины служат дл€ борьбы с аутоиммунными болезн€ми, они содержат рецепторы “-клеток, опосредующих аутоиммунные болезни. ¬акцины могут €вл€тьс€ или целыми рецепторами “-клеток, в основном очищенными от клонов “-клеток, или отдельными нит€ми рецепторов “-клеток (напр., альфа- бета-, гамма-нит€ми), или част€ми таких нитей, или отдельно или в сочетании друг с другом. ¬акцина может быть или гомогенной, напр., включать лишь один пептид, или содержать более одного типа пептида, причем каждый пептид относитс€ к разной части рецептора.  роме того, данные пептиды могут происходить от разных рецепторов, когда оба рецептора способствуют опосредованной “-клетками патологии.
—огласно особенной форме выполнени€ изобретени€ иммунизирующий пептид может иметь последовательность аминокислот SGDQGGNE, если он призван служить дл€ лечени€ рассе€нного склероза. Ћюба€ иммуногенна€ часть данного пептида может быть эффективной. “аким образом, возможна замена аминокислот без потери иммуногенности пептида.  роме того, данный пептид может быть св€занным с носителем с тем, чтобы дальше повышать его иммуногенность.
—огласно дальнейшему развитию изобретени€ дл€ иммунизации человека, страдающего от ревматоидного артрита, можно использовать рецепторы “-клеток или фрагменты рецепторов, содержащие Vβ17 , дл€ лечени€ или профилактики данной болезни. ¬ызываема€ в человеке иммунна€ реакци€ может обезвреживать или уничтожать “-клетки, имеющие Vβ17, и таким образом предотвращать или лечить их вредное действие.  роме того, в той степени, в которой Vβ17 имеетс€ также в рецепторах на патогенных “-клетках, опосредующих аутоиммунные болезни в общем, предлагаемые вакцины можно использовать и дл€ борьбы с такими другими аутоиммунными болезн€ми.
—лова "в основном чистый" означают, что рецептор “-клеток в основном свободен от других биохимических компонентов, с которыми он обычно св€зан в природе. јльтернативно вакцины содержат пептиды разной длины, соответствующей рецептору “-клеток или его част€м. ѕептиды можно получать или путем синтеза, или путем рекомбинации с помощью известных дл€ специалиста методов. ѕредпочтительно пептидные вакцины соответствуют участкам рецепторов “-клеток, которыми данный рецептор отличаетс€ от других, непатогенных рецепторов. “акие специфические участки могут находитьс€ на отдельных(ом) участках(е) соответствующих полипептидных нитей рецептора, в частности на небольшой последовательности, включающей V(D)J-участок, ограничива€ таким образом иммунную реакцию на “-клетки, содержащие данную детерминанту.
¬акцины дают в том случае, если хоз€ин показывает аутоиммунную реакцию или находитс€ в такой опасности. “очный клинический диагноз определенной аутоиммунной болезни оправдывает дачу необходимых специфических дл€ данной болезни вакцин, содержащих рецепторы “-клеток. ѕрофилактическа€ дача оправдана там, где аутоиммунные механизмы предшествуют началу открытой клинической болезни (напр., диабета типа I). “аким образом, данные вакцины можно до начала болезни профилактически примен€ть у людей, у которых в семейном анамнезе имеетс€ соответствующа€ болезнь и которые, суд€ по надежным показател€м, наход€тс€ в опасности заболевани€.
—одержащие рецепторы “-клеток вакцины можно примен€ть с многими возможными составами, с фармацевтически переносимой средой. ¬ случае короткого пептида последний может быть св€зан с носителем, напр., выделенным из блюдечка гемоцианином, с тем, чтобы повысить его иммуногенность. ¬акцину можно давать в сочетании с адъювантом (имеетс€ несколько известных адъювантов). ѕосле начальной иммунизации вакциной можно подавать усилитель. ¬акцины апплицируют известными методами в дозах, которые достаточны дл€ индукции иммунной реакции и легко могут быть определены любым специалистом.
ѕригодные дл€ иммунизации пептиды можно находить следующим образом.  лоны вызывающих болезнь “-клеток, взаимодействующие с антигенами, с которыми хот€т боротьс€, выдел€ют из зараженных индивидуумов. “акие “-клетки получают предпочтительно в месте, где про€вл€етс€ сильна€ аутоагрессивна€ активность, т. е. в месте патологического изменени€ в случае обыкновенной пузырчатки, из центральной нервной системы в случае рассе€нного склероза, из синовиальной жидкости или ткани в случае ревматоидного артрита или же из крови соответствующего зараженного индивидуума. «атем определ€ют последовательность аминокислот генов рецепторов аутоагрессивных “-клеток. ѕосле этого дл€ вакцинов, используемых вышеописанным образом, можно выбирать полипептиды, соответствующие рецепторам “-клеток или част€м рецепторов, имеющимс€, в частности, в вызывающих болезнь “-клетках (по сравнению с непатогенными “-клетками).
¬место этого вакцина может содержать антиидиотипические антитела, €вл€ющиес€ внутренними изображени€ми вышеописанных пептидов. ћетоды получени€, отбора и применени€ таких антиидиотипических вакцин известны (см., напр., јйхманн и др., CRC Critical Reviews в Immunology, N 7, стр. 193 - 227, 1987 г.).
ќпосредованные “-клетками патологии со злокачественной этиологией
ѕолезность вакцинации рецепторами “-клеток выше по€снилась на примере аутоиммунных болезней.  роме того, и вызванна€ “-клетками лимфома €вл€етс€ патологией, поддающейс€ такому лечению. ѕрименение данной технологии при лечении “-лимфомы можно осуществл€ть в основном идентичным методом. ќднако данна€ технологи€ примен€етс€ скорее при “-клеточной пролиферативной болезни, т. к. легче осуществл€ть выделение патогенных “-клеток. ѕосле выделени€ клонов технологию осуществл€ют нижеописанным образом. ¬ частности, определ€ют последовательность аминокислот генов рецепторов “-клеток “-лимфомов и определ€ют подход€щие участки данных рецепторов, которые используют в качестве вакцин. ¬акцины могут содержать или простые, или сложные пептиды, и их можно примен€ть известным образом в фармакологически переносимом составе с адъювантом или без него.
–ассе€нный склероз
¬ызывающие рассе€нный склероз “-клетки до сих пор еще не идентифицировали, хот€ из-за клинических и гистологических сходств рассе€нного склероза и экспериментального аллергического энцефаломиелита предполагали, что “-клетки, взаимодействующие с основным протеином миелина, при этом играют некоторую роль. ѕри экспериментальном аллергическом энцефаломиелите на крысах и мышах энцефалогенные “-клетки, взаимодействующие с основным протеином миелина, показывают поразительное сохранение последовательности аминокислот на VDJ-участке β-нити, несмотр€ на известные различи€ по рестрикции главного антигена тканевой совместимости и антигенной специфичности основного протеина миелина. Ќасто€щее изобретение основываетс€ на обнаружении того, что лини€ “-клетки человека, взаимодействующа€ с основным протеином миелина и полученна€ из больного рассе€нным склерозом, имеет β-нить рецептора “-клеток с VDJ-последовательностью аминокислот, соответствующей последовательности на β-нит€х “-клеток, взаимодействующих с основным протеином миелина и вызывающих патогенез у экспериментального аллергического энцефаломиелита, представл€ющего собой модель рассе€нного склероза у животных. ƒанна€ лини€ €вл€етс€ специфической дл€ другого эпитопа основного протеина миелина. Ёто открытие показывает, что взаимодействующие с основным протеином миелина “-клетки участвуют в патогенезе рассе€нного склероза и что рецепторные пептиды, подобные описанным дл€ профилактики экспериментального аллергического энцефаломиелита, можно использовать дл€ лечени€ рассе€нного склероза.
–евматоидный артрит
–евматоидный артрит €вл€етс€ аутоиммунной болезнью, опосредованной “-клетками. »зобретение описывает олигоклональные инфильтраты активированных “-клеток, содержащих Vβ17, в синовиальный слой больных ревматоидным артритом. Ќаличие данных “-клеток в больной ткани всех осмотренных больных, их олигоклональность и цитотоксическа€ активность одной из этих “-клеток дл€ синовиальных присоединенных клеток показывают центральную роль содержащих Vβ17 T-клеток в патогенезе ревматоидного артрита.
јктивированные попул€ции “-клеток в синовиальной ткани больных ревматоидным артритом исследовали путем анализа м–Ќ  рецепторов “-клеток, выделенных из синовиальных “-клеток, положительных относительно рецептора IL-2 (IL-2R+). м–Ќ  рецепторов “-клеток амплифицировали известным образом путем цепной реакции с помощью полимеразы (PCR). ¬ этом анализе вы€вилось, что олигоклональные Vβ17 перегруппировки обогащены в попул€ции IL2-R+, что указывает на веро€тность участи€ содержащих Vβ17 “-клеток в патогенезе ревматоидного артрита. »з пробы синовиальной ткани выдел€ли клон “-клетки, содержащий CD4+, Vβ17 и тот факт, что он обладает цитотоксичностью in vitro относительно синовиальных присоединенных клеток, подтверждает непосредственное участие содержащих Vβ17 “-клеток в ревматоидном артрите.
 ак уже указывалось, насто€щее изобретение содержит чрезвычайно важное открытие, заключающеес€ в том, что специфический вариабельный участок β-нити рецептора “-клеток, обозначаемый как Vβ17, тесно св€зан с ревматоидным артритом у человека. ƒанное открытие делает возможными обнаружение, профилактику и лечение ревматоидного артрита с использованием описанного в данном изобретении способа. —пециалист будет способен примен€ть в отношении ревматоидного артрита терапевтические методы, подобные описанным выше в св€зи с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом методам.
“аким образом, вторым объектом изобретени€ €вл€етс€ способ диагностировани€ или прогнозировани€ восприимчивости к ревматоидному артриту или рассе€нному склерозу индивидуума. ¬ случае ревматоидного артрита способ включает обнаружение “-клеток, содержащих обозначаемый как Vβ17 вариабельный участок β-нити в пробе индивидуума, причем наличие анормального количества содержащих Vβ17 “-клеток указывает на ревматоидный артрит или восприимчивость к ревматоидному артриту. —одержащую Vβ17 “-клетку можно качественно или количественно сравнивать с клеткой нормального индивидуума. “акое диагностирование можно осуществл€ть путем обнаружени€ части Vβ17, котора€ не имеетс€ на вариабельном участке β-нити рецепторов “-клеток, не св€занных с ревматоидным артритом. Vβ17 можно обнаруживать, напр., путем приведени€ Vβ17 в контакт с детекторным лигандом, способным к специфическому св€зыванию с Vβ17. »звестны многочисленные детекторные лиганды, напр., св€занное с ферментом антитело. ¬место этого дл€ обнаружени€ содержащих Vβ17 “-клеток также можно использовать нуклеотидные пробы, комплементарные с кодирующими Vβ17 последовательност€ми нуклеиновых кислот (см. пример IX).
¬ случае диагностировани€ или прогнозировани€ восприимчивости к рассе€нному склерозу предлагаемый способ включает обнаружение в пробе индивидуума “-клеток, имеющих в основном последовательность SGDQGGNE, причем наличие данной последовательности указывает на рассе€нный склероз или восприимчивость к рассе€нному склерозу. ѕоследовательность можно обнаруживать, напр., путем приведени€ в контакт с детекторным лигандом. »звестны многочисленные детекторные лиганды, напр. св€занное с ферментом антитело. ¬место этого дл€ обнаружении “-клеток также можно использовать нуклеотидные пробы, комплементарные с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоте (см. пример IX).
“ретьим объектом изобретени€ €вл€етс€ способ профилактики или лечени€ ревматоидного артрита или рассе€нного склероза. ¬ случае ревматоидного артрита способ включает предотвращение св€зывани€ содержащей Vβ17 “-клетки с ее партнером. —огласно одной форме выполнени€ изобретени€ св€зывание предотвращаетс€ путем св€зывани€ лиганда с Vβ17. —огласно другой форме выполнени€ изобретени€ св€зывание предотвращаетс€ путем св€зывани€ лиганда с партнером Vβ17. —в€зывание можно предотвращать известными методами, напр. путем св€зывани€ антитела с Vβ17 или св€зывающей частью дл€ физического блокировани€ св€зывани€.
—огласно другой возможности выполнени€ изобретени€ профилактику или лечение ревматоидного артрита можно также осуществл€ть путем цитотоксической или цитостатической обработки содержащих Vβ17 “-клеток в индивидууме. —огласно одному варианту содержащие Vβ17 “-клетки обрабатывают цитотоксическим или цитостатическим агентом, избирательно св€зывающим Vβ17. јгент может представл€ть собой радиоактивное или хемотерапевтическое вещество. “акое св€зывание и пригодные дл€ этой цели агенты широко известны (см., напр., ’арлоу Ё. и Ћейн Antibodies, a Laboratory Manual,  оульд спринг ’арбор Ћэборатори, 1988 г.).
¬ случае профилактики или лечени€ рассе€нного склероза способ включает предотвращение св€зывани€ содержащей в основном последовательность SGDQGGNE “-клетки с ее партнером. —огласно одной форме выполнени€ изобретени€ св€зывание предотвращаетс€ путем св€зывани€ лиганда с последовательностью. —огласно другой форме выполнени€ изобретени€ св€зывание предотвращаетс€ путем св€зывани€ лиганда с партнером. —в€зывание можно предотвращать известными методами, напр. путем св€зывани€ антитела с последовательностью дл€ физического блокировани€ св€зывани€.
—огласно другой возможности профилактику или лечение рассе€нного склероза можно осуществл€ть путем цитотоксической или цитостатической обработки содержащих в основном последовательность SGDQGGNE “-клеток в индивидууме. —огласно одному варианту “-клетки обрабатывают цитотоксическим или цитостатическим агентом, избирательно св€зывающим последовательность. јгент может представл€ть собой радиоактивное или хемотерапевтическое вещество.
„етвертым объектом насто€щего изобретени€ €вл€етс€ способ выделени€ вакцины дл€ лечени€ опосредованной “-клетками патологии, включающий получение клонов “-клеток, вызывающих данное состо€ние, определение последовательности аминокислот рецепторов “-клеток клонов “-клеток, св€занных с данным состо€нием, отбор сегментов данных рецепторов “-клеток, характерных дл€ упом€нутых рецепторов “-клеток, а не дл€ рецепторов “-клеток, не св€занных с данным состо€нием, и отбор из упом€нутых последовательностей тех последовательностей, которые способны к индукции иммуногенной реакции относительно упом€нутого рецептора “-клеток, таким образом отбира€ вакцину.
ѕ€тым объектом насто€щего изобретени€ €вл€етс€ содержащий последовательность SGDQGGNE пептид, €вл€ющийс€ агентом дл€ обнаружени€, профилактики или лечени€ рассе€нного склероза.
Ўестым объектом изобретени€ €вл€етс€ способ согласно пп. 25-27 формулы изобретени€.
»зобретение по€сн€етс€ нижеследующими примерами.
ѕример I
Ёкспериментальный аллергический энцефаломиелит на крысах
 рыс-самок разновидности Ћьюиса („арлз –ивер Ћабораториз, –алей-ƒэрхам, —Ўј) иммунизировали подачей в лапу каждой задней ноги 50 мкл основного протеина миелина морской свинки в виде эмульсии в полном стимул€торе ‘рейнда. ѕервые симптомы болезни обычно обнаруживали за 9-11 дней после иммунизации. —тепень болезни оценивали с помощью шкалы с трем€ разделами: 1 - хромой хвост, 2 - слабость задних ног, 3 - паралич задних ног. ѕосле продолжительности болезни примерно 4 - 6 дней большинство крыс спонтанно выздоровело и было резистентным к последующему вызыванию экспериментального аллергического энцефаломиелита.
ѕример II
¬ыделение вакцины
¬акцинации осуществл€ли пептидом рецептора “-клеток, последовательность которого вывели из последовательности ƒЌ  бета-гена рецептора “-клеток, преобладающем среди вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит “-клеток мышей разновидности B10.PL/L. ѕоследовательность ƒЌ  соответствует указани€м ”рбана и др. (см. выше). ѕептид, содержащий дев€ть аминокислот и имеющий последовательность VDJ β-нити рецептора “-клеток из мыши, синтезировали известным методом. ѕоследовательность данного пептида следующа€: SGDAGGGYE. —оответствующа€ последовательность в крысах гласит: SSD-SSNTE (Ѕэрнс и др., J. Exp. Med., N 169, стр. 27 - 39, 1989 г.). ѕептид обессоливали путем колоночной хроматографии на колонне на —ефадекс √-25 (‘армаси€ ‘аин  емикэлс, ѕискатавей, Ќью ƒжерсей, —Ўј) с использованием в качестве элюента 0,1 ћ уксусной кислоты, и растворитель затем удал€ли лиофилизацией в двух циклах. „асть пептида с помощью глутаральдегида конъюгировали с выделенным из блюдечка гемоцианином (LH) в соотношении 7,5 мг пептида на мг гемоцианина.  онъюгат подвергали диализу с применением солевого фосфатного буфера (–¬—).
ѕример III
¬акцинаци€ против экспериментального аллергического энцефаломиелита
»спользуемые в данных опытах вакцины состо€т из свободного пептида с VDJ-участком, а также из пептида с VDJ-участком, конъюгированного с выделенным из блюдечка гемоцианином. »х разбавл€ли в солевом фосфатном буфере и эмульгировали равными част€ми или (1) неполного стимул€тора ‘рейнда или (2) полного стимул€тора ‘рейнда, полученного путем суспендировани€ 10 мг/мл убитых термообработкой высушенных Mycobacterium tuberculosis H37ra (ƒифко Ћабораториз, ƒитройт, —Ўј) в неполном стимул€торе ‘рейнда. Ёмульсии дали крысам-самкам разновидности Ћьюиса возрастом 8 - 12 недель в общем количестве 100 мкл на животное (50 мкл в лапу каждой задней ноги).  аждой крысе дали 5 мкг неконъюгированного VDJ пептида.  онъюгат выделенного из блюдечка гемоцианина и VDJ дали в количестве, соответствующем 10 мкг выделенного из блюдечка гемоцианина на животное. «а 29 дней после этого каждой крысе дали 50 мкг основного протеина миелина морской свинки в полном стимул€торе ‘рейнда в передние лапы. ∆ивотных наблюдали каждый день, начина€ с 9-го дн€, чтобы обнаруживать клинические симптомы экспериментального аллергического энцефаломиелита, и их оценивали вышеописанным образом. –езультаты опыта приведены в таблице I (см. в конце описани€). ќни показывают не только то, что у вакцинированных животных болезнь вы€вилась меньше, но и то, что в заболевших животных болезнь протекала менее т€жело и/или ее начало было замедлено. —тепени защиты были разными, как и составы вакцин, причем вакцины, содержащие полный стимул€тор ‘рейнда, показывали наибольшую степень защиты.
ѕример IV
¬акцинаци€ против экспериментального аллергического энцефаломиелита с VDJ пептидами, полученными из крыс разновидности Ћьюиса
VDJ пептид, используемый в предыдущих примерах, синтезировали согласно последовательности молекул в β-цепи рецептора “-клеток, найденной в вызывающих экспериментальный аллергический энцефаломиелит “-клетках мышей разновидности B10.PL. ƒанные VDJ последовательности €вл€ютс€ гомологичными, а не идентичными, с последовательност€ми, найденными в “-клетках мышей разновидности B10. PL. ѕептиды крыс синтезировали согласно последовательност€м ƒЌ , названным Ѕэрнсом и др. и  луба и др. (Eur. J. Immunol., N 19, стр. 279 - 284, 1989 г. ). ѕоследовательности данных трех пептидов, обозначаемые как IR1, IR2 и IR3, приведены ниже, вместе с последовательностью мыши разновидности B10.PL, использованной в примерах I и III (VDJ).

ѕолучение, дачу и оценку данных вакцин осуществл€ли описанным в примерах I - III образом, за следующими исключени€ми. ¬ составах вакцин, содержащих полный стимул€тор ‘рейнда, использовали 50 мкг отдельных VDJ пептидов; не использовали ни вакцины в неполном стимул€торе ‘рейнда, ни вакцины, содержащие конъюгированные с выделенным из блюдечка гемоцианином (LH).  онтрольным животным перед подачей основного протеина миелина (ћЅ–) ничего не дали или их вакцинировали эмульсией солевого фосфатного раствора (PBS) и полного стимул€тора ‘рейнда (CFA) с тем, чтобы оценивать защитное действие одного адъюванта. –езультаты приведены в табл. II (см. в конце описани€).
ѕриведенные в таблице II результаты показывают, что в невакцинированных контрольных животных обнаружили болезнь уже в 10-ый день. Ѕолезнь про€вилась в т€желом параличе и ослаблении, продолжалась в течение 4 - 6 дней и затем спонтанно прекратилась. ” крыс, вакцинированных PBS-CFA, болезнь протекала в основном таким же образом, как и в невакцинированных контрольных животных. ¬ отличие от этого на некоторых животных, вакцинированных IR1, IR2 и IR3, обнаруживали замедленное начало, а на других - и замедленное начало, и уменьшенную интенсивность и/или продолжительность болезни. ќднако в общем вакцинаци€ VDJ пептидами крыс (IR1-3) была немного менее эффективной, чем вакцинаци€ VDJ пептидом мыши (см. пример III). ќднако вакцинаци€ IR9b привела к полной защите во всех четырех животных, на которых его исследовали. ¬ажное значение имеет тот факт, что ни в одном из четырех животных, вакцинированных IR9b, не обнаруживали ни одного гистологического изменени€, характерного дл€ болезни, что указывает на то, что были предотвращены также субклинические симптомы болезни.
ѕример V
¬акцинаци€ пептидами, специфическими относительно вариабельного участка
—пецифический дл€ семейства Vβ8 генов пептид исследовали в качестве вакцины против экспериментального аллергического энцефаломиелита. Vβ8 €вл€етс€ наиболее распространенным семейством β-нити, и он используетс€ в энцефалитогенных “-клетках крыс и мышей. ѕептид синтезировали согласно уникальной последовательности ƒЌ , которую нашли в гене Vβ8 , а не в других генах крысы, последовательности которых приведены у ћорриса и др. (Immunogenetics, N 27, стр. 174 - 179, 1988 г.). ѕоследовательность данного Vβ8 пептида, обозначаемого как IR7, следующа€:
IR7 DMGHGLRLIHYSYDVNSTE .
Ёффективность данного пептида исследовали в экспериментальном аллергическом энцефаломиелите на крыс (пример I) описанным в примерах II и III образом. 50 мкг пептида исследовали с полном стимул€торе ‘рейнда (CFA). ¬акцинацию с неполным стимул€тором ‘рейнда (IFA) или с конъюгатом пептида с выделенным из блюдечка гемоцианином (IFA) не осуществл€ли. –езультаты данных опытов приведены в табл. III (см. в конце описани€).
–езультат вакцинаций, осуществл€емых пептидом крысы, похож на результаты вакцинаций IR1, IR2 и IRS пептидами мышей и крыс. Ќа одном животном обнаруживали уменьшенную интенсивность и продолжительность болезни, а одно животное защищалось полностью.
ѕример VI
¬акцинаци€ содержащими J-участки пептидами
ѕептид синтезировали согласно сегменту J на α-нити, “ј39, нашли среди рецепторов энцефалитогенных “-клеток и в крысах, и в мышах. ѕоследовательность данного пептида, обозначаемого как IR5, следующа€:
IR5 RFGAGTRLTVX.
Ёффективность JαTA39 пептида исследовали в экспериментальном аллергическом энцефаломиелите на крыс разновидности Ћьюиса (пример I) описанным в примерах II и III образом. 50 мкг пептида исследовали в полном стимул€торе ‘рейнда (CFA). ¬акцинацию с неполным стимул€тором ‘рейнда (IFA) или с конъюгатом пептида с выделенным из блюдечка гемоцианином (IFA) не осуществл€ли. –езультаты данных опытов приведены в табл. IV (см. в конце описани€).
–езультаты вакцинации Jα“ј39 пептидом крысы €вл€ютс€ более эффективными, чем результаты вакцинации VDJ пептидом мыши или Vβ8 пептидом. ƒва из трех животных полностью защищались, а в третьем животном начало болезни было значительно замедлено.  роме того, в этом животном интенсивность болезни также была снижена, несмотр€ на то, что болезнь имела нормальную продолжительность 5 дней. ¬ажное значение имеет тот факт, что на обоих полностью защищенных животных не обнаруживали ни одного гистологического симптома инфильтрации “-клеток в центральную нервную систему. Ётот результат показывает, что вакцинаци€ JαTA39 очень эффективно вызывает регул€тивную реакцию, нацеленную на энцефалитогенные “-клетки. ƒаже не обнаруживалось субклинических симптомов болезни.
ѕример VII
¬акцинаци€ смес€ми пептидов рецепторов “-клеток
¬акцинации осуществл€ли со смесью пептидов рецептора “-клеток. ƒанна€ смесь содержала по 50 мкг пептидов IR1, IR2 и IR3 (VDJ пептидами трех крыс и пептидом Jα“ј39 крысы).
Ёффективность данной смеси пептидов исследовали в экспериментальном аллергическом энцефаломиелите на крыс разновидности Ћьюиса (пример I) описанным в примерах II и III образом. ѕептиды исследовали в полном стимул€торе ‘рейнда (CFA). ¬акцинацию с неполным стимул€тором ‘рейнда (IFA) или с конъюгатом пептида с выделенным из блюдечка гемоцианином (IFA) не осуществл€ли. –езультаты данных опытов приведены в табл. V (см. в конце описани€).
–езультаты вакцинаций, осуществленных с использованием Jα“ј39 пептидом крысы и трем€ VDJ пептидами, €вл€ютс€ почти столь эффективными, сколь результаты вакцинации IR9b, приведенные в таблице II. ¬се три животных полностью защищались. Ќар€ду с отсутствием клинических симптомов экспериментального аллергического энцефаломиелита два из трех животных были полностью свободными от гистологических симптомов инфильтрации “-клеток в центральную нервную систему, причем на третьем наблюдали лишь два маленьких очага лимфоцитарной инфильтрации на основании спинного мозга.
ѕример VIII
¬акцина против рассе€нного склероза
¬заимодействующие с основным протеином миелина “-клетки человека
Ћинии взаимодействующих с основным протеином миелина “-клеток человека получили из периферийных одно€дерных клеток крови (–¬ћ—) дев€ти больных хроническим прогрессирующим рассе€нным склерозом и двух здоровых контрольных людей.  летки в течение 3 дней держали в культуре при регул€рной стимул€ции очищенного основного протеина миелина человека и облученной аутологическими периферийными одно€дерными клетками крови, а затем в течение 4 дней в содержащей IL-2 среде.
јмплификаци€ путем цепной реакции с помощью полимеразы (PCR) генов β-нити рецептора “-клеток из линий взаимодействующих с основным протеином миелина “-клеток
“-клетки выдел€ли из культур, получаемых после логарифмической фазы роста, и получили –Ќ , амплифицированную Vβ16-мерным примером и примером Cβ дл€ осуществлени€ 55 циклов согласно примеру IX.
ѕоследовательности β-нитей рецептора “-клеток человека, взаимодействующих с основным протеином миелина
— использованием примера Cβseq определ€ли последовательность амплифицированных Vβ16-мером генов β-нити рецептора линий “-клеток человека, взаимодействующих с основным протеином миелина. ѕродукт амплификации очищали с помощью гел€, денатурировали основани€ и с помощью примера Cβseq определ€ли его последовательности. »з п€ти линий получили способные к считыванию последовательности ƒЌ , которые показывали, что доминирующие клоны “-клеток получили путем длительного переноса in vitro. ќдна из данных последовательностей, из клеточной линии Re (см. табл. VI в конце описани€), имела VDJ последовательность аминокислот β-нити, в которой п€ть из первых шести и шесть из дев€ти в общем остатков идентичны с соответствующими остатками VDJ последовательности аминокислот β-нити, сохран€емых в энцефалогенных “-клетках, взаимодействующих с основным протеином миелина, в экспериментальном аллергическом энцефаломиелите на мышах разновидности B10.PL. ƒанна€ последовательность не имелась в численно преобладающих перегруппировках рецептора “-клеток, найденных в остальных четырех лини€х “-клеток человека, взаимодействующих с основным протеином миелина.
ƒл€ вы€снени€ возможного наличи€ похожих последовательностей в β-нит€х линий “-клеток, взаимодействующих с основным протеином миелина, других больных рассе€нным склерозом осуществл€ли амплификацию PCR с дегенерированным (n = 1024) 21-нуклеотидным примером (VβRe), соответствующим семи аминокислотам данной последовательности (см. таблицу VI). ќсуществл€ли обратную транскрипцию –Ќ , которые Vβ16-мерным примером и примером Cβext амплифицировали реакцией в 20 циклах (стади€ I). 1 мкл аликвотной пробы продукта данных реакций стадии I реамплифицировали в 35 циклах примерами VβRe и Cβint. 1 мкл аликвотной пробы продукта данных реакций исследовали путем гибридизации по —аутерну маркированной 32P пробы Cβ человека. ƒанное исследование показало амплифицированный продукт с 300 п.о. в клеточной линии Re и в линии одного другого больного рассе€нным склерозом, но не в “-клетках, взаимодействующих с основным протеином миелина, контрольных индивидуумов или лини€х и клонах не взаимодействующих с основным протеином миелина “-клетках человека. Ќаличие данной последовательности в двух из дев€ти исследованных линий клеток больных рассе€нным склерозом имеет важное значение. “.к. данна€ последовательность, как известно, сохран€етс€ среди энцефалогенных “-клеток при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите, ее обнаружение в “-клетках, взаимодействующих с основным протеином миелина, больных рассе€нным склерозом показывает, что имеющие этот детерминант “-клетки играют некоторую роль в патогенезе рассе€нного склероза.
»ммуногенные пептиды, имеющие последовательность SGDQGGNE, можно получить путем синтеза описанным в примере II образом, и их можно использовать дл€ иммунизации людей описанным в примере III методом. “ака€ иммунизаци€ может приводить к эффективной иммунной реакции.
ѕример IX
¬ыделение олигоклональных инфильтратов II активированных “-клеток, содержащих Vβ17, в синовии больных ревматоидным артритом
ѕолучение “-клеток из синовиальной ткани
ѕробы синовиальной ткани получили из больных, на которых ревматоидный артрит подтверждалс€ радиографией и которых лечили протезированием суставов. — использованием магнитных жемчужин и антител, взаимодействующих с IL2-R (α IL2-R) человека, следующим образом получили активированные “-клетки. —иновиальную ткань переваривали при температуре 37oC в течение 4 ч в среде RPMI с 10% сыворотки плода коровы (FBS), содержащей 4 мг/мл коллагеназы (¬ортингтон Ѕиокемикэл, ‘рихольд, Ќью ƒжерсей, —Ўј) и 0,15 мг/мл ƒЌ азы («игма, —т. Ћуис, —Ўј). ѕродукт переваривани€ подали через 80-меш сито, и отдельные клетки собрали путем центрифугировани€ в градиенте плотности согласно ‘иколлу.  летки на поверхности раздела промывали и инкубировали в солевом фосфатном буфере (PBS), содержащем 2% FBS (PBS-FBS), 5 мкг/мл иммуноглобулина IgG контрольных мышей (—оултер »ммунолоджи, ’айали, ‘лорида, —Ўј) в концентрации 106/мл при температуре 0oC в течение 30 минут.  летки три раза промывали и инкубировали с магнитными шариками, конъюгированными с анти-мышинным IgG козы (јдвансд ћагнетикс,  ембридж, ћассачюсетс, —Ўј). Ўарики магнитно отдел€ли, и их трижды промывали PBS-FBS. ƒанный предварительный отбор с помощью IgG мыши (mIgG) и магнитными шариками использовали дл€ контрол€ не- специфической адсорбции “-клеток. ќставшиес€ в исходной суспензии клетки дополнительно инкубировали с 5 мкг/мл моноклонального IgG мыши, взаимодействующего с IL2-R “-клетки человека при температуре 0oC в течение 30 минут ( оултер »ммунолоджи, ’айали, ‘лорида, —Ўј).  летки промывали и отбирали вышеописанным образом с помощью магнитных шариков. Ўарики предварительной адсорбции IgG и отобранные антитела IL2-R сразу же ресуспендировали в подкисленной смеси гуанидини€, фенола и хлороформа и –Ќ , полученной согласно ’онецынски и —аки (Anal. Biochem. N 162, стр. 156, 1987 г). “.к. –Ќ  получили без культивации клеток in vitro и возможно вызванного отклонени€, они должны точно отражать количество “-клеток в синовиальной ткани в момент ее оперативного удалени€. Ћишь половина mIgG и шариков с α IL2-R больного 1012 сразу же обрабатывали дл€ получени€ –Ќ . ќстальную часть культивировали в среде RPMI 1640 с 5% FBS, 20% HL-1 (¬ентрекс Ћабораториз »нк. , ѕортлэнд, —Ўј), 25 мћ HEPES, глутамином, антибиотиками и в качестве источника IL-2 20% надосадочной жидкости LAK (јллегретта и др., Science, N 247, стр. 718, 1990 г.) в течение 5 дней. –Ќ  экстрагировали из культур шариков αIL2-R (1012IL2.d5), а не из пробы 1012mIgG, т.к. не имелось жизнеспособных клеток в конце 5-дневной культивации.
 лон “-клетки выдел€ли из центрифугата из больного 1008. »меющиес€ в центрифугате клетки культивировали с концентрацией 2 · 106/мл в среде, не содержащей IL-2, в течение двух недель. Ќеприсоединенные клетки данной культуры клонировали с использованием метода лимитирующего разбавлени€ на аутологические монослои синовиальных клеток. ѕолучили клон 1008.8 CD4+ клетки, который приспосабливали к культивации путем регул€рной стимул€ции аутологическими синовиальными моносло€ми в течение 3 дней в среде, не содержащей IL-2, а затем культивировали в течение 4 дней в среде, содержащей надосадочную жидкость LAK.
Ћизис синовиальных присоединенных к 1008.8 клеток
Ћизис синовиальных присоединенных клеток 1008.8 демонстрировали следующим образом. ћонослои синовиальных слоев маркировали согласно —тэдмэн и  эмпбелл (J. Immunol Meth.., N 119, стр. 219, 1989 г.) с помощью 35S в качестве маркера в опытах CTL.  летки обрабатывали трипсином, промывали и нанесли на круглодонную микротитровую пластину с 96 углублени€ми, причем в каждое углубление подали 2000 клеток.  летки 1008.8, культивированные за 3 дн€ до исследовани€ вместе с синовиальными присоединенными клетками и содержащей надосадочную жидкость средой, добавл€ли к маркерам с нижеприведенным соотношением эффекторов и маркеров.  ультуры инкубировали при температуре 37oC в течение ночи, их центрифугировали при 300 · g в течение 2 минут и определ€ли радиоактивность в 50 мкл надосадочной жидкости. —пецифический лизис высчитывали с помощью известных формул на основе лизированных в поверхностно-активном веществе маркеров. ƒанный клон €вл€етс€ цитотоксическим относительно синовиальных присоединенных клеток в опытах CTL (см. табл. VII в конце описани€).
јмплификаци€ генов β-нити рецептора “-клеток путем цепной реакции с помощью полимеразы
√ены β-нити рецептора “-клеток амплифицировали с помощью примеров в разных комбинаци€х, приведенных в табл. VIII (см. в конце описани€). Vβ16-мерный пример €вл€етс€ дегенерированным Vβ примером (n = 256), который предположительно св€зываетс€ с 85% генов β-нити рецептора “-клеток человека на всех 16 остатках и с 95% на 15 остатках. ƒанный пример использовали дл€ амплификации β-нитей рецептора “-клеток более 25 разных клонов, линий или препаратов первичной ткани человека. ќпредел€ли продолжительность многих разных генов Vβ данных амплифицированных ƒЌ , несмотр€ на значительное отклонение примера относительно некоторых групп Vβ. “аким образом, амплификаци€ PCR с использованием Vβ16-мерного примера облегчает исследование попул€ций “-клеток, использование генов Vβ которых специалисту неизвестно.
√ены β-нити рецептора “-клеток амплифицировали путем двухстадийных реакций с парами примеров, приведенными в таблице VIII. –Ќ  подвергали обратной транскрипции при температуре 42oC 40 пмоль с использованием Cβext примера в 12 мгл в услови€х, описанных ’артом и др., The Lancet, стр. 596 (1988). ѕродукт реакций разбавл€ли смесью, содержащей 40 пмоль Vβ16-мерного примера, нуклеотиды и буфер, как выше описано, но без MgCl2 с тем, чтобы достичь конечной концентрации 3,6 мћ. ѕробы денатурировали при температуре 95oC в течение 15 минут, добавл€ли 1 единицу теплостойкой рекомбинантной ƒЌ  полимеразы (фирмы —итэс  орпорейшн, Ёмеривилль,  алифорни€, —Ўј, название: јмплитакTM) и осуществл€ли 20 циклов PCR.  аждый цикл состо€л из денатурации при температуре 95o— в течение 1 минуты, ренатурации в течение 2 минут и распространени€ при температуре 72oC в течение 2 минут. ѕродукт первых двух циклов ренатурировали при температуре 37oC и 45oC, а остаток - при температуре 50o—. ќдин мкг аликвотной пробы результата данных реакций I стадии добавл€ли к 100 мкг амплифицирующей стадии II (см. —итус, Gene Amp, KitIM), содержащей 100 пмоль Cβint примера и 100 пмоль примеров Vβ8,Vβ17 или 5ʹCβ или 100 пмоль примеров Vβ мерный пример. јмплификацию стадии II осуществл€ли вышеописанным образом при температуре ренатурации 50oC и без обработки при температуре 37oC и 45oC.
ѕробы –Ќ  из культур 1012IL2. d5 и 1008.8 амплифицировали с помощью Vβ16-мерного примера и примера Cβext в реакци€х стадии I и с помощью Vβ16-мерного примера и примера Cβint в реакци€х в 35 циклах стадии II. ѕродукт реакций с помощью стекл€нных шариков (Ѕиолол, —ан ƒьего,  алифорни€, —Ўј) очищали от агарозного гел€ с низкой точкой плавлени€, его основани€ денатуризировали, и его последовательность определ€ли “7 полимеразой (—еквенейз, ёнайтед —тейтс Ѕайохем,  ливлэнд, ќхайо, —Ўј) с использованием Cβseq примера. „исленно преобладающа€ последовательность Vβ, соответствующа€ отдельной перегруппировке Vβ17 (см. таблицу IX), в пробе 1012IL2.d5 легко подавалась считыванию. ƒругие, менее распространенные перегруппировки €вл€лись слабыми, не поддающимис€ считыванию фоновыми полосами в гел€х, служащих дл€ определени€ последовательности. ѕо всей веро€тности культура данных 1012.IL2 шариков в содержащей IL2 среде без добавлени€ дополнительных клеток или антигена не приводит к повторной активации “-клеток. “аким образом, преобладание одной единственной перегруппировки Vβ17 в данной пробе отражает клональную экспансию in vivo содержащих Vβ17 “-клеток в этом больном. ќпределение последовательности ƒЌ  β-нити рецептора “-клеток, амплифицированной с применением цитотоксического клона “-клеток, 1008.8, также указывает на перегруппировку Vβ17 (см. табл. IX в конце описани€). Ќаличие данных двух видов проб синовиальных “-клеток, полученных из двух больных ревматоидным артритом, предполагает участие содержащих Vβ17 “-клеток в патогенезе ревматоидного артрита.
Ќаличие перегруппировок Vβ17 в остальных пробах синовиальной –Ќ  определ€ли путем амплификации путем PCR с применением специфического относительно Vβ17 примера (см. таблицу VIII). ƒЌ  содержащего Vβ17 рецептора “-клеток амплифицировали с применением проб на магнитных шариках, полученных из семи больных ревматоидным артритом. — помощью обработки продуктов электорфореза бромидом этиди€ обнаруживали большую амплификацию Vβ17 в четырех из проб, содержащих αIL2-R, чем в соответствующих контрольных пробах, содержащих mIgG. ƒанное обогащение €вл€лось результатом не процесса выделени€, т. к. при амплификации содержащих Vβ8 рецепторов “-клеток не обнаруживалась разница между пробами, содержащими mIgG, и пробами, содержащими IL2-R.
ѕерегруппировки Vβ17 двух из препаратов, содержащих –Ќ  αIL2-R, амплифицировали примерами Vβ17 и Cβint, а последовательность продукта реакций определ€ли с использованием примера Cβseq. ѕробы 1014 и 1015 содержали отдельные последовательности (см. таблицу IX), которые, также как и проба 1012IL2. d5, указывают на клональную экспансию содержащих Vβ17 “-клеток in vivo. ¬ отличие от этого, непосредственное определение последовательности перегруппировок, амплифицированных с помощью специфического относительно Vβ8 примера, было невозможным из-за значительной разнородности β -нити продукта.
Vβ17 имеет последовательность аминокислот MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGI- TQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQ- KGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS.
HLA-DR-анализ ƒЌ  больных ревматоидным артритом
HLA-DR-анализ ƒЌ  больных ревматоидным артритом осуществл€ли следующим образом. ƒЌ  из каждого больного препарировали путем кипени€ 105 синовиальных клеток в 200 мкл dH2O. 10 мкл амплифицировали в 35 циклах в 100 мкл среды (—итус, ƒжин јмп  ит»ћ), содержащей 100 пмоль каждого примера дл€ осуществлени€ цепной реакции DRβ при помощи полимеразы (см. таблицу X). 1/10 мкл данной среды реамплифицировали в 10 циклах в 10 мкл, содержащих лишь пример DRβ2 и 17 пмоль α32P-dCTP в качестве единственного источника dCTP. ƒобавл€ли 200 мкћ dCTP и осуществл€ли 2 цикла. ѕолучаемые пробы (отрицательный т€ж) в услови€х, описанных јмором и др. (J. Immunol., N 138, стр. 1947, 1987 г.), гибридизировали с получением следов, содержащих 10 пмоль HLA-DR аллель-специфических олиго (положительные т€жи). —леды два раза промывали хлоридом тетраметиламмони€ (¬уд и др., Proc. Natl. Acad. Sd USA, N 82, стр. 1585, 1985 г.) при температуре 65 - 68oC в течение 20 минут, и затем их обрабатывали рентгеновскими лучами.
 аждый больной в данном анализе имел по крайней мере один аллель генов HLA-DR, а именно DR4w4, DR1, DR4w14 или DR4w15, известные как вызывающие восприимчивость к ревматоидному артриту факторы (см. таблицу X в конце описани€).
—одержащие Vβ17 рецепторы “-клеток или их фрагменты, которые €вл€ютс€ иммуногенными или которым можно придавать иммуногенность, можно использовать дл€ иммунизации людей с помощью способов, описанных в примере VII. “ака€ иммунизаци€ может привести к эффективной иммунной реакции.
’от€ в данном тексте изобретение описано на одном предпочтительном примере его выполнени€, следует указать на то, что возможны разные модификации без выхода за рамки изобретательского замысла. ѕоэтому изобретение не ограничиваетс€ раскрытым в тексте описанием, а лишь формулой изобретени€.
‘ормула изобретени€: 1. ¬акцина дл€ профилактики или лечени€ ревматоидного артрита млекопитающих, содержаща€ активное вещество и фармацевтически переносимую среду, отличающа€с€ тем, что в качестве активного вещества она содержит рецептор “-клеток или его фрагмент, соответствующий рецептору “-клеток, наход€щемус€ на поверхности опосредующих ревматоидный артрит “-клеток, или антиидиотипические антитела, €вл€ющиес€ внутренним изображением данного рецептора или его упом€нутого фрагмента, причем активное вещество вз€то в иммуногенно эффективном количестве.
2. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что упом€нутый рецептор “-клеток содержит последовательность аминокислот MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, ее модификации, не затрагивающие способность рецептора к действию в качестве иммуногена и иммуногенно активные фрагменты.
3. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что упом€нутый фрагмент содержит последовательность вариабельного участка упом€нутого рецептора “-клеток.
4. ¬акцина по п. 3, отличающа€с€ тем, что упом€нута€ последовательность вариабельного участка представл€ет собой вариабельный участок β-нити.
5. ¬акцина по п.4, отличающа€с€ тем, что упом€нутый варибельный участок в-нити содержит в основном последовательность аминокислот MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, ee модификации, не затрагивающие способность рецептора к действию в качестве иммуногена и иммуногенно активные фрагменты.
6. ¬акцина по п.5, отличающа€с€ тем, что упом€нутый вариабельный участок β-нити содержит в основном последовательность SQIVNDFQK.
7. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что упом€нутый фрагмент содержит последовательность V(D)J.
8. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что упом€нутый фрагмент содержит последовательность св€зывающего участка.
9. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит адъювант.
10. ¬акцина по п. 1, отличающа€с€ тем, что она содержит более одного типа рецептора “-клеток или его фрагменты.
11. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что она содержит более одного фрагмента, соответствующего разным последовательност€м одного и того же рецептора “-клеток.
12. ¬акцина по п.1, отличающа€с€ тем, что упом€нутый фрагмент св€зан с носителем путем конъюгировани€.
13. —пособ получени€ вакцины дл€ лечени€ ревматоидного артрита, отличающийс€ тем, что получают клоны “-клеток, вызывающие данное состо€ние, определ€ют аминокислотную последовательность рецепторов “-клеток, св€занных с данным состо€нием, отбирают сегменты данных рецепторов “-клеток, характерных дл€ данных рецепторов “-клеток, а не дл€ рецепторов “-клеток, не св€занных с данным состо€нием, из которых отбирают последовательности, способные к индикации иммуногенной реакции относительно данного рецептора “-клеток, и получаемое таким образом активное вещество с фармацевтически переносимой средой амплицируют известными методами.
14. —пособ обнаружени€ восприимчивости индивидуума к ревматоидному артриту, отличающийс€ тем, что определ€ют “-клетки, содержащие вариабельный участок β-нити MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, или его фрагмент в пробе страдающего ревматоидным артритом индивидуума, который в основном не встречаетс€ в не страдающем ревматоидным артритом индивидууме, причем анормальна€ экспресси€ “-клеток, содержащих такой участок, указывают на ревматоидный артрит или восприимчивость к ревматоидному артриту.
15. —пособ по п. 14, отличающийс€ тем, что пробу берут из синовиальной ткани.
16. —пособ по п. 14, отличающийс€ тем, что упом€нутый вариабельный участок β-нити или упом€нутую последовательность определ€ют с помощью детекторного лиганда.
17. —пособ по п. 14, отличающийс€ тем, что наличие упом€нутого вариабельного участка β-нити или упом€нутой последовательности устанавливают с помощью нуклеотидной пробы, кодирующей упом€нутый участок или упом€нутую последовательность.
18. —пособ профилактики и лечени€ ревматоидного артрита, отличающийс€ тем, что он включает предотвращение св€зывани€ рецептора “-клеток, содержащего последовательность MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, с его партнером путем стимул€ции иммунной реакции на рецептор “-клеток, или св€зывани€ лиганда с последовательностью MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, или с партнером рецептора “-клеток.
19. —пособ по п. 18, отличающийс€ тем, что упом€нутый партнер представл€ет собой HLA-DR, вызывающий восприимчивость к ревматоидному артриту.
20. —пособ профилактики или лечени€ ревматоидного артрита в индивидууме, отличающийс€ тем, что индивидууму дают агент, который цитотоксическим или цитостатическим путем св€зываетс€ с “-клеткой, содержащей последовательность SNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS, или в индивидууме индуцируют цитотоксическую или цитостатическую иммунную реакцию на “-клетки, содержащие последовательность MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS.
21. —пособ по п. 20, отличающийс€ тем, что упом€нутый агент €вл€етс€ антителом, св€занным с веществом из группы, включающей радиоактивные вещества, хемотерапевтические и хемотоксические вещества.
ѕриоритет по пунктам и признакам:
21.03.89 п. 1 в части активного вещества рецептора “-клеток или его фрагмента, соответствующего рецептору “-клеток, наход€щемус€ на поверхности опосредующих ревматоидный артрит “-клеток, пп.3, 4, 7, 9 - 13 также в части активного вещества, указанного в п.1;
18.07.89 п.1 в части активного вещества, касающегос€ антиидиотипических антител, €вл€ющихс€ внутренним изображением рецептора “-клеток или его фрагмента, соответствующего рецептору “-клеток, наход€щемус€ на поверхности опосредующих ревматоидный артрит “-клеток, пп.3, 4, 7, 9 - 12 в части указанного в п.1 активного вещества и п.8, относ€щийс€ к вакцине, содержащий в качестве активного вещества фрагмент рецептора “-клеток.