Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СРЕДА ДЛЯ СЛИЯНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РИСА
СРЕДА ДЛЯ СЛИЯНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РИСА

СРЕДА ДЛЯ СЛИЯНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РИСА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение предназначено для использования в биотехнологии, культуре растительных тканей, физиологии. В среду для слияния протопластов дополнительно вводят диметилсульфоксид при следующем соотношении компонентов, вес.%: CaCl2·2H2O 0,0478 - 0,0615, KH2РО4 0,054 - 0,0695, KNO2 0,0956 - 1,231, (NH4)2SO4 0,0427 - 0,0549, MgSO4·7H2O 0,0796 - 0,103, MnSO4·H2O 0,0032 - 0,0041, ZnSO4·7H2O 0,00064 - 0,00082, MnSO4·4H2O 0,0042 - 0,0054, H3BO3 0,0009 - 0,0012, KI 0,00024 - 0,0006, СuSO4·5Н2О 0,000007 - 0,000009, Nа2МоO4·2Н2О 0,00007 - 0,00009, CoCl2·6H2O 0,000007 - 0,000009, Fe2SO4·7H2O 0,0089 - 0,0111, HO(CH2H4O)88H 34,97028 - 40,705808, C6H14O6 22,310 - 28,716, NaOH 6,374 - 8,205, NH2CH2COOH 6,374 - 7,705, C2H6SO 15,661328 - 27,097792. Изобретение обеспечивает увеличение слияния протопластов, что способствует получению большего числа регенератов. 3 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2138552
Класс(ы) патента: C12N5/04
Номер заявки: 97118768/13
Дата подачи заявки: 11.11.1997
Дата публикации: 27.09.1999
Заявитель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт риса
Автор(ы): Давиденко Е.А.; Авакян Э.Р.; Алешин Н.Е.; Алешин Е.П.
Патентообладатель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт риса
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, культуре растительных тканей, физиологии, может быть использовано при генноинженерном конструировании растительных организмов.
В отечественной и зарубежной практике, а также в селекционных и физиологических исследованиях широкое распространение получило применение метода вегетационной (соматической) гибридизации, необходимой составной частью которого является среда для слияния протопластов. Важнейшим компонентом таких сред являются вешества-фузогены, обеспечивающие слияние протопластов, одним из них является ПЭГ-HO(CH2H4O)пH-(полиэтиленгликоль).
Известна среда для слияния протопластов, содержащая полиэтиленгликоль (см. например: Биология растений. Культура клеток. Под редакцией Л.Г.Бутенко. М.,"Агропромиздат", 1989, с. 69-70): HO(CH2H4O)88H - 64,51; C12H22O11 - 8,602; CaCl2 · 2H2O - 0,3139; NH2CH2COOH - 0,404; C6H14O6 - 19,35; сухого вещества в растворе - 46,49% вес., остальное - вода.
Эта смесь рекомендуется в качестве основной смеси для соматической гибридизации растений любого систематического таксона, но не имеет видоспецифической направленности.
Известна также смесь для слияния протопластов (CM.Laszlo Мenczel, Kathy Wolfe. High freguency oi fusion induced in freely suspended protoplast mixtures by polyethylene glycol and dimethyl 'sulfoxide at high ph//Plant Cell Reports (1984), 3: 196-198), содержащая следующие компоненты в % вес.:
CaCl2 · 2H2O - 0,0702; KH2PO4 - 0,0790; HNO3 - 1,403; (NH4)2SO4 - 0,062; MgSO4 · 7H2O - 0,116; MnSO4 · H2O - 0,0046; ZnSO4 · 7H2O - 0,0004; MnSO4 · 4H2O - 0,00617; H3BO3 - 0,0014; KI - 0,0003; CuSO4 · 5H2O - 0,00001; Na2MoO4 · 2H2O - 0,0001; CoCl2 · 6H2O - 0,00001; FeSO4 · 7H2O - 0,01301; HO(CH2H4O)88H - 46,781; C6H14O6 - 32,748; NaOH - 9,3588; NH2CH2COOH - 9,356; сухого вещества в растворе - 21,4% вес., остальное - вода.
Эта питательная среда принята в качестве прототипа изобретению, т.к. она является наиболее близкой ему как по назначению, так и по технической сущности.
Недостатком прототипа является: низкая плотность слияния протопластов, отрицательно влияющая на процессы морфогенеза и каллусообразования.
Задачей являлось увеличение процента частоты слияния протопластов риса.
Поставленная задача достигается тем, что в питательную среду, содержащую хлорид кальция двухводный, фосфорнокислый калий, нитрат калия, сернокислый аммоний, семиводный сульфат магния, одноводный сернокислый марганец, семиводный сульфат цинка, четырехводный сульфат марганца, борную кислоту, йодистый калий, пятиводный сульфат меди, двухводный молибденовокислый натрий, шестиводный хлорид кобальта, семиводный сульфат железа, полиэтиленгликоль, маннитол, гидроксид натрия, глицин, дополнительно вводят диметилсульфоксид в качестве вещества, усиливающего эффект полиэтиленгликоля при следующем соотношении компонентов, в % вес. (таблица 1).
Сопоставимый анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для слияния протопластов отличается от известной введением нового компонента, а именно, диметилсульфоксида.
Таким образом, решение соответствует критерию новизна. Анализ известных сред для слияния (см., например, Laszlo Menczel, Kathy Wolfe. High freguency of fusion induced in freely suspended protoplast mixtures by polyethylene glycol and dimethyl sulfoxide at high ph//Plant Cell Reports (1984), 3: 196 - 198), используемых в биотехнологии, показал, что ряд введенных в заявляемое решение веществ известны. Однако их применение в известных культуральных средах в сочетании с полиэтиленгликолем не обеспечивает средам такие свойства, которые они проявляют в заявленном решении, а именно: повышение плотности слияния протопластов, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "существенные отличия" (см. таблицу 2).
Диметилсульфоксид (DMSO)C2H6SO - 78,13, широко применяемый растворитель, tпл. - 18,5oC; tкип. - 189oC; растворяется в органических растворителях, воде, диффундирует через покровные ткани (Л.И.Кнунянц. Химический энциклопедический словарь. М., "Советская энциклопедия", 1983, с. 171).
Для экспериментальной проверки заявляемой среды были приготовлены 6 сред (таблица 2). Опыты по слиянию мезофильных протопластов, полученных из мутантных линий N107 и 98 из сорта Лиман, проводили в двухкратной повторности.
Изложенная сущность изобретения поясняется примерами:
Пример 1.
Среду для слияния мезофильных и каллусных протопластов готовили по следующей технологии: CaCl2 · 2H2O - 0,0702; KH2PO4 - 0,0790; KNO3 - 1,403; (NH4)2SO4 - 0,062; MgSO4 · 7H2O - 0,116; MnSO4 · H2О - 0,0046; ZnSO4 · 7H2O - 0,0004; MnSO4 · 4H2О - 0,00617; H3BO3 - 0,0014; KI - 0,0003; CuSO4 · 5H2O - 0,00001; Na2MoO4 · 2H2O - 0,0001; CoCl2 · 6H2O - 0,00001; FeSO4 · 7H2O - 0,01301; HO(CH2H4O)88)H - 46,781; C6H14O6 - 32,748; NaOH -9,3588% вес, сухого вещества в растворе - 21,4%, остальное - вода, компоненты растворяли в 950 мл H2O; автоклавировали 15' при 121oC, добавляли NH2CH2COOH - 9,356%, доводили объем до 1000 мл. Тщательно перемешивали растворами HCl и NaOH, устанавливали pH среды до 10,0. В 10-см чашки Петри помещали по 4 мл раствора суспензии протопластов и 4 мл раствора для слияния, смешивали 5 круговыми движениями и оставляли в покое на весь период слияния (40' при комнатной температуре), после чего слившиеся протопласты промывали в промывочном растворе, а продукт слияния оценивали микроскопически (подсчитывали плотность слившихся протопластов и частоту слияния, %).
Пример 2.
Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl2 · 2H2O - 0,0444; KH2PO4 - 0,0508; KNO3 - 1,3407; (NH4)2SO4 - 0,0401; MgSO4 · 7H2O - 0,0749; MnSO4 · H2O - 0,044; ZnSO4 · 7H2O - 0,00059; MnSO4 · 4H2O - 0,0039; H3BO3 - 0,0013; KI - 0,00022; CuSO4 · 5H2O - 0,000007; Na2MoO4 · 2H2O - 0,00007; CoCl2 · 6H2O - 0,000007; FeSO4 · 7H2O - 0,0083; HO(CH2H4O)88H - 29,818706; C6H14O6 - 20,993; NaOH - 5,992, NH2CH2COOH - 5,992, C2H6SO - 35,595, сухое вещество - 22,124013, остальное - вода.
Пример 3.
Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl2 · 2H2O - 0,0478; KH2PO4 - 0,054; KNO3 - 0,0956; (NH4)2SO4 - 0,0427; MgSO4 · 7H2O - 0,0796; MnSO4 · H2O - 0,0032; ZnSO4 · 7H2O - 0,00064; MnSO4 · 4H2O - 0,0042; H3BO3 - 0,0009; KI - 0,00024; CuSO4 · 5H2O - 0,000007; Na2MoO4 · 2H2O - 0,00007; CoCl2 · 6H2O - 0,000007; FeSO4 · 7H2O - 0,0089; HO(CH2H4O)88H - 40,705808; C6H14O6 - 28,716; NaOH - 8,205, NH2CH2COOH - 6,374, C2H6SO - 15,661328, сухое вещество - 22,4, остальное - вода.
Пример 4.
Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl2 · 2H2O - 0,0568; KH2PO4 - 0,0643; KNO3 - 1,137; (NH4)2SO4 - 0,0510; MgSO4 · 7H2O - 0,0947; MnSO4 · H2O - 0,0037; ZnSO4 · 7H2O - 0,00075; MnSO4 · 4H2O - 0,0050; H3BO3 - 0,0011; KI - 0,00028; CuSO4 · 5H2O - 0,000009; Na2MoO4 · 2H2O - 0,00009; CoCl2 · 6H2O - 0,000009; FeSO4 · 7H2O - 0,0105; HO(CH2H4O)88H - 37,913; C6H14O6 - 26,539; NaOH - 7,583762, NH2CH2COOH - 7,582, C2H6SO - 18,957, сухое вещество - 26,3762, остальное - вода.
Пример 5.
Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl2 · 2H2O - 0,0615; KH2PO4 - 0,0695; KNO3 - 1,231; (NH4)2SO4 - 0,0549; MgSO4 · 7H2O - 0,103; MnSO4 · H2O - 0,0041; ZnSO4 · 7H2O - 0,00082; MnSO4 · 4H2O - 0,0054; H3BO3 - 0,0012; KI - 0,0003; CuSO4 · 5H2O - 0,000009; Na2MoO4 · 2H2O - 0,00009; CoCl2 · 6H2O - 0,000009; FeSO4 · 7H2O - 0,0111; HO(CH2H4O)88H - 34,97028; C6H14O6 - 22,31; NaOH - 6,374, NH2CH2COOH - 7,705, C2H6SO - 27,097792, сухое вещество - 34,05, остальное - вода.
Пример 6.
Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl2 · 2H2O - 0,0670; KH2PO4 - 0,0757; KNO3 - 0,0899; (NH4)2SO4 - 0,059; MgSO4 · 7H2O - 0,1117; MnSO4 · H2O - 0,0029; ZnSO4 · 7H2O - 0,00085; MnSO4 · 4H2O - 0,0058; H3BO3 - 0,0008; KI - 0,0003; CuSO4 · 5H2O - 0,00001; Na2MoO4 · 2H2O - 0,0001; CoCl2 · 6H2O - 0,00001; FeSO4 · 7H2O - 0,0124; HO(CH2H4O)88H - 44,691; C6H14O6 - 31,283; NaOH - 8,90013; NH2CH2COOH - 8,938, C2H6SO - 5,7614; сухое вещество - 34,4; остальное - вода.
Результаты экспериментов представлены в таблице 3. Как следует из экспериментальных данных, использование оптимального варианта предлагаемой смеси обеспечивает увеличение частоты слияния протопластов на 15,83%. Последнее очень важно, т.к. приводит к увеличению количества микрокаллусов и получению большого числа регенерантов, позволяет уменьшить количество повторностей, лабораторной техники и рабочего времени.
Формула изобретения: Среда для слияния протопластов риса, включающая хлорид кальция двухводный, фосфорнокислый калий, нитрат калия, сернокислый аммоний, семиводный сульфат магния, одноводный сернокислый марганец, семиводный сульфат цинка, четырехводный сульфат марганца, борную кислоту, йодистый калий, пятиводный сульфат меди, двухводный молибденовокислый натрий, шестиводный хлорид кобальта, семиводный сульфат железа, полиэтиленгликоль, маннитол, гидроксид натрия, глицин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит диметилсульфоксид в качестве химического вещества, усиливающего фузогенный эффект полиэтиленгликоля при следующем соотношении компонентов, вес.%:
CaCl2·2Н2О - 0,0478 - 0,0615
КН2РО4 - 0,054 - 0,0695
KNO3 - 0,0956 - 1,231
(NH4)2SO4 - 0,0427 - 0,0549
MgSO4·7Н2О - 0,0796 - 0,103
MnSO4·Н2О - 0,0032 - 0,0041
ZnSO4·7Н2О - 0,00064 - 0,00082
MnSO4·4Н2О - 0,0042 - 0,0054
Н3ВО3 - 0,0009 - 0,0012
KI - 0,00024 - 0,0003
CuSO4·5Н2О - 0,000007 - 0,000009
Na2МоО4·2Н2О - 0,00007 - 0,00009
CoCl2·6Н2О - 0,000007 - 0,000009
FeSO4·7Н2О - 0,0089 - 0,0111
НО(СН2Н4О)88Н - 34,97028 - 40,705808
С6Н14О6 - 22,310 - 28,716
NaOH - 6,374 - 8,205
NH2СН2СООН - 6,374 - 7,705
С2Н6SO - 15,661328 - 27,097792